專利名稱：：一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及降解活性的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種節(jié)嘧磺隆高效降解菌株的篩選及降解活性的鑒定方法。技術(shù)背景芐嘧磺隆，又稱節(jié)磺隆、亞磺隆，商品名為農(nóng)得時(shí)(Londax)，化學(xué)名稱2-{[(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基羰基氨基]磺?；谆鵠}苯甲酸甲酯(Methyl-2-{[(4,methyl}benzoate)。分子式為ClbH18N40;，分子量為410.40，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:節(jié)嘧磺隆是20世紀(jì)80年代中期美國杜邦公司開發(fā)的一種新型磺酰脲類除草劑，具有高效、低毒、廣譜、用量少、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前廣泛用于稻田、麥田雜草防治的主要除草劑之一。但是它在土壤中的殘留周期較長(在黏土中半衰期4~20周)，難揮發(fā)，不易降解，易對后茬敏感作物造成危害。因此，解決節(jié)嘧磺隆殘留的降解問題已成為當(dāng)前農(nóng)殘降解領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外很多專家采取了一系列措施來減少節(jié)嘧磺隆殘留所造成的危害，主要有添加復(fù)配劑降低節(jié)嘧磺隆的用量，開發(fā)抗藥性轉(zhuǎn)基因作物等，但這些措施并不能從根本上解決農(nóng)藥殘留問題。因此，研制芐嘧磺隆生物降解菌劑具有十分重要的意義，但由于很難篩選出芐嘧磺隆的高效降解菌株，目前仍未見節(jié)嘧磺隆降解菌劑的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效、廉價(jià)的節(jié)嘧磺隆高效降解菌株的篩選及其降解活性的鑒定方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下高效降解菌株的篩選方法包括以下步驟l)降解菌的富集馴化取810g接種源置入三角瓶中，加入80~100ral節(jié)嘧磺隆濃度為50~100mg/L的富集培養(yǎng)基和5~10g玻璃珠(將接種源充分打勻)，于283(TC,150~180r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)57天，備用將培養(yǎng)液按體積百分比5~10/的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100~150mg/L的新的富集培養(yǎng)基中，于283(TC,6-dimethoxy—pyrimidin—2—y1)aminocarbonylamino]sulfonyl150180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5~7天，而后將富集培養(yǎng)中的窄嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3~4次，得到富集菌液，待用；2)分離篩選在80~100ml芐嘧磺隆濃度為100~150mg/L的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5~10%的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于283(TC,180200r/min條件下振蕩培養(yǎng)5-7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比5~10%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100~150mg/L的新的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3~4次，得到以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；3)復(fù)壯、純化將分離篩選所得的混合菌液，稀釋106~108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，283(TC培養(yǎng)23天，挑選不同性狀的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；4)驗(yàn)證降解菌將步驟3)中純化好的菌株在選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上劃線，其中選擇性培養(yǎng)基內(nèi)添加節(jié)嘧磺隆至終濃度為100~150mg/L,28~3(TC培養(yǎng)3~4天，能夠生長的菌株即為能夠以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株。5)鑒定降解菌株的降解活性利用玉米生測法初篩出高活性的降解菌株，再利用高效液相色譜法確定高效菌株的降解率。所述步驟l)中的富集培養(yǎng)基的組成為蛋白胨8.0-10.Og,NaCl0.8~1.0g,KH2PO40.8~1.Og,C6H12061.~2.Og,水1000ml，pH=6.0~7.2。所述步驟2)和4)中的選擇性培養(yǎng)基的配方為NH4N030.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g，(NH4)2S040.5~0.8g,KH2P040.5~0.8g，NaCl0.5~0,8g,K2HP042.0~2.5g,FeCl30.005~0.Olg，CaCl20.01~0.02g，蒸餾水1000ml,pH=6.0-7.2。所述步驟3)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組成為牛肉膏2.5~5.Og，蛋白胨8.0~10.Og，NaCl2.5~5.Og,瓊脂15.0~20.Og，水1000ml，pH=7.0~7,2。所述釆用節(jié)嘧磺隆時(shí)用少量甲醇助溶，并在滅菌后加入培養(yǎng)基中。菌株降解活性的鑒定方法根據(jù)玉米生測實(shí)驗(yàn)主根長抑制率y—一節(jié)嘧磺隆濃度對數(shù)x的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b，初步得出步驟4)中所得的以芐嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株的降解活性，篩選出高活性菌株，而后利用高效液相色譜得出高效菌株的精確降解率。所述高效液相色譜的色譜條件為流動(dòng)相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為60~80:20~40:0~0.5;流速為0.6~1.Oml/min;檢測波長;230~260nm;柱溫為283(TC;進(jìn)樣量為510iil。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明釆用的篩選方法簡單易行、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，所得菌株可以用來制備節(jié)嘧磺隆的降解菌劑，在實(shí)踐中有很好的應(yīng)用潛力。2.本發(fā)明利用長期受節(jié)嘧磺隆污染的田間土壤為處理對象，所得的降解菌是田間土壤中的土著菌，制成菌劑后田間應(yīng)用不易被排斥，效果會(huì)更好。3.本發(fā)明提供的生測實(shí)驗(yàn)法初篩與高效液相色譜法復(fù)篩相結(jié)合鑒定降解菌株降解活性的方法，成本低，且高效精確，具有很好的可行性。4.本發(fā)明提供的節(jié)嘧磺隆高效降解菌株的篩選方法可以用于其它磺酰脲類除草劑降解菌株的篩選，在農(nóng)藥殘留降解菌株的篩選方面提供了一定的理論指導(dǎo)。圖1為節(jié)嘧磺隆玉米生測實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2為笮嘧磺隆高效液相色譜試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1節(jié)嘧磺隆降解菌株的篩選1)降解菌的富集馴化取10g接種源(蘇家屯豐收農(nóng)藥廠周邊水稻田土樣)置入250ml三角瓶中，加入100ml節(jié)嘧磺隆濃度為50mg/L的富集培養(yǎng)基和5g玻璃珠(將土樣充分打勻)，于30°C，150r/min條件下振蕩培養(yǎng)7天，將培養(yǎng)液按體積百分比10%的接種量接種于節(jié)嘧磺隆濃度為100mg/L的新配置的富集培養(yǎng)基中，于3(TC,150r/min條件下振蕩培養(yǎng)7天，而后將富集培養(yǎng)基中的節(jié)嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次于富集培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次節(jié)嘧磺隆濃度分別為150mg/L、200mg/L和250mg/L,得到富集菌液，待用；所述采用節(jié)嘧磺隆時(shí)用少量甲醇助溶。2)分離篩選在100ml芐嘧磺隆濃度為100rag/L的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比10%的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于3(TC,180r/min條件下振蕩培養(yǎng)7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比10%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度不變的新配置的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次，得到以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；所述節(jié)嘧磺隆濃度不變與第一次分離篩選時(shí)采用的節(jié)嘧磺隆濃度相應(yīng)。3)復(fù)壯、純化將分離篩選所得的混合菌液，稀釋106~108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，28-3(TC培養(yǎng)23天，挑選不同性狀的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；4)驗(yàn)證降解菌將步驟3)中純化好的菌株在選擇性培養(yǎng)基固體平板上劃線，其中選擇性培養(yǎng)基內(nèi)添加節(jié)嘧磺隆至終濃度為100mg/L，28-3(TC培養(yǎng)3~4天，能夠生長的菌株即為能夠以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株。所述步驟l)中的富集培養(yǎng)基的組成為蛋白胨8.0-10.Og,NaCl60.8~1,0g,KH2P040.8~1.0g,C6H12061.0~2.0g,水1000ml，pH=6.0~7.2，UrC,30min，高壓蒸汽滅菌后加入節(jié)嘧磺隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟調(diào)整相應(yīng)的濃度。所述步驟2)和4)中的選擇性培養(yǎng)基的配方為NH4N030.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g,(NH4)2S040.5~0.8g,KH2P040.5~0.8g，NaCl0.5~0.8g，L線2.0~2.5g,FeCl30.005~0.Olg,CaCl20.01~0.02g,蒸餾水1000ml，pH=6.0~7.2,為防止產(chǎn)生沉淀，含磷的成分與其它成分，分別12rC,30min,高壓蒸汽滅菌后再混合，固體平板，每升培養(yǎng)基加入20g瓊脂，節(jié)嘧磺隆濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟相應(yīng)調(diào)整。所述步驟3)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組成為牛肉膏2.5~5.Og，蛋白胨8.0~10.Og，NaCl2.5~5.Og,瓊脂15.0~20.Og,水1000ml，pH=7.0~7.2。實(shí)施例2降解菌株降解活性的鑒定利用玉米生測法初篩出高活性的降解菌株，再利用高效液相色譜法確定高效菌株的降解率。l.玉米生物測定法利用玉米對節(jié)嘧磺隆的敏感性，以中金736號(hào)玉米為處理對象。1)生測用玉米種子的前處理挑選色澤、大小力求一致的扁長形玉米種子，在25i:下浸種12h，使種子吸足水份，經(jīng)催根處理后挑選根長為1.0~2.Ocm的種子備用。2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在直徑9cm的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)放2張濾紙，分別加入20ml不同濃度(0.5,1,2.5，5，10，20,40ug/L)的以選擇性培養(yǎng)基溶液配制的節(jié)嘧磺隆藥液，每皿中放入8粒大小均勻，形態(tài)正常，籽粒飽滿催根后的玉米種子，將玉米種子均勾排列在培養(yǎng)皿的濾紙上，胚芽向上，置于25'C培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)5天，培養(yǎng)結(jié)束后，將種子取出，分離根系，測量主根長，以沒有加入節(jié)嘧磺隆的選擇性培養(yǎng)基溶液作對照，每一處理組和對照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，將處理組與對照組進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，計(jì)算處理組玉米主根長抑制率。古禍錢制蜜=對照組玉米主根長-處理組玉米主根長很引刺牛_對照組玉米主根長將節(jié)嘧磺隆濃度取對數(shù),進(jìn)行回歸分析，可得主根長抑制率y—一節(jié)嘧磺隆濃度對數(shù)x的線性回歸方程y=0.178x+0.2568(R2=0.9767)(參見表1和圖1)。表i<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)鑒定降解活性將篩選出的能夠降解芐嘧磺隆的菌株活化，接入100ml選擇性液體培養(yǎng)基中，按體積百分比計(jì)，接種量10%，并添加節(jié)嘧磺隆至終濃度為20mg/L,于3(TC,180r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)5天，取菌液過濾除菌，用上述生物測定法測定玉米主根長，然后將玉米根長數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算降解后節(jié)嘧磺隆的濃度，初步得出降解活性。(由于玉米對節(jié)嘧磺隆很敏感，樣品測定時(shí)，應(yīng)該稀釋至0~40ug/L的范圍內(nèi))2.高效液相色譜法1)樣品的預(yù)處理取20ml含節(jié)嘧磺隆的培養(yǎng)菌液，12000r/min離心5min，取上清液于100ml三角瓶中,加入25mlCH2C12,劇烈振蕩后靜置分層，棄水相收集有機(jī)相，有機(jī)相過無水硫酸鈉柱，收集液體，N2吹干CH2Cl2,用甲醇定容至lml,待測。2)降解率的測定a)色譜條件色譜柱phe訓(xùn)enexC主(4.6x150mm，5jum);流動(dòng)相按體積份數(shù)比甲醇水冰醋酸(70:29.5:0.5,V:V:V);流速0.8ml/min;檢測波長250nrn;柱溫3(TC;進(jìn)樣量10|il;釆用外標(biāo)法按峰面積定量。b)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取節(jié)嘧磺隆標(biāo)樣，用甲醇溶解，流動(dòng)相定容，配成1.0,5.0,10.0,15.0，20.Omg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件測定。得出峰面積y—一節(jié)嘧磺隆質(zhì)量濃度x的直線回歸方程為y-12.192x+4.0967,(R2=0.9994)(參見表2和圖2)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>c)樣品上機(jī)檢測，得出精確的降解率。通過該方法篩選得到了4株以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的高效降解菌株，在節(jié)嘧磺隆初始濃度為20mg/L的選擇性培養(yǎng)基中，接種量10%,溫度3(TC,180r/min搖床培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，菌株的降解率都能達(dá)到60%以上。所得的4株以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的高效降解菌株，其與伯杰鑒定手冊(第八版)[M].北京，科學(xué)出版社；黃星，噻吩磺隆降解菌FLX的分離鑒定及降解特性[J].中國環(huán)境科學(xué)，2006,26(2):214-218;邵勁松，一株綠磺隆降解菌的分離鑒定及其特性研究[J].土壤學(xué)報(bào)，2003,40(6):952-956的專利附文獻(xiàn)中的菌種理化性質(zhì)相當(dāng)，經(jīng)其16SrDNA測序和理化性質(zhì)初步鑒定為土壤中常規(guī)的野油菜黃單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、寡養(yǎng)單胞菌和乙酸鉤不動(dòng)桿菌。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于l)降解菌的富集馴化取8g接種源置入三角瓶中，加入80ml節(jié)嘧磺隆濃度為100mg/L的富集培養(yǎng)基和10g玻璃珠(將接種源充分打勻)，于28T,150r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)5天，備用；將培養(yǎng)液按體積百分比5%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為150mg/L的新配置的富集培養(yǎng)基中，于28°C,150r/min條件下振蕩培養(yǎng)5天，而后將富集培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次于富集培養(yǎng)基中，得到富集菌液，待用；2)分離篩選在80ml芐嘧磺隆濃度為150mg/L的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5%的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于28°C,200r/min條件下振蕩培養(yǎng)7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比5~10%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為150mg/L的新配置的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次，得到以芐嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；1)降解菌的富集馴化取9g接種源置入三角瓶中，加入90ml節(jié)嘧磺隆濃度為80mg/L的富集培養(yǎng)基和8g坡璃珠(將接種源充分打勻),于28°C，180r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)5天，備用；將培養(yǎng)液按體積百分比8%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為130mg/L的新配置的富集培養(yǎng)基中，于28°C,180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5天，而后將富集培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次于富集培養(yǎng)基中，得到富集菌液，待用；2)分離篩選在90ml芐嘧磺隆濃度為130mg/L的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5%的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于30°C,200r/min條件下振蕩培養(yǎng)7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比8%的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為130mg/L的新配置的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3次，得到以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用。實(shí)施例權(quán)利要求1.一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選方法，其特征在于包括以下步驟1)降解菌的富集馴化取8～10g接種源置入三角瓶中，加入80～100ml芐嘧磺隆濃度為50～100mg/L的富集培養(yǎng)基和5～10g玻璃珠，于28～30℃，150～180r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，備用；將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的富集培養(yǎng)基中，于28～30℃，150～180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，而后將富集培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到富集菌液，待用；2)分離篩選在80～100ml芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5～10％的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于28～30℃，180～200r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到以芐嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；3)復(fù)壯、純化將分離篩選所得的混合菌液，稀釋106～108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，28～30℃培養(yǎng)2～3天，挑選不同性狀的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；4)驗(yàn)證降解菌將步驟3)中純化好的菌株在選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上劃線，其中選擇性培養(yǎng)基內(nèi)添加芐嘧磺隆至終濃度為100～150mg/L，28～30℃培養(yǎng)3～4天，能夠生長的菌株即為能夠以芐嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株；5)鑒定降解菌株的降解活性利用玉米生測法初篩出高活性的降解菌株，再利用高效液相色譜法確定高效菌株的降解率。2.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述步驟l)中的富集培養(yǎng)基的組成為蛋白胨8.0~10.Og,NaCl0.8~1.()g,KH具0.8~1.0g,CbH.i20,,1.0~2.Og,水1000ml,pH=6.0—7.2。3.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述步驟2)和4)中的選擇性培養(yǎng)基的配方為NH,NO;0.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g，(NH4)2SO40.5~0.8g,KH2PO40.5~0.8g,NaCl0.5~0.8g,K風(fēng)2.0~2.5g，F(xiàn)eCl;O.005~0.Olg,CaCl'0.01~0.02g，蒸餾水1000ml，pH=6.0~7.2。4.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述步驟3)中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組成為牛肉膏2.5~5.0g,蛋白胨8.()~10.Og，NaCl2.5~5.0g，瓊脂15.0~20.Og，水1000ml,pH=7.0~7.2。5.按權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于所述釆用節(jié)嘧磺隆時(shí)用少量甲醇助溶，并在滅菌后加入培養(yǎng)基中。6.—種按權(quán)利要求1所述的節(jié)嘧磺隆高效降解菌株降解活性的鑒定方法，其特征在于根據(jù)玉米生測實(shí)驗(yàn)主根長抑制率y_—節(jié)嘧磺隆濃度對數(shù)x的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=aX+b,初步得出步驟4)中所得的以節(jié)嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株的降解活性，篩選出高活性菌株，而后利用高效液相色譜得出高效菌株的精確降解率。7.按權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征在于所述高效液相色譜的色譜條件為流動(dòng)相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為60~80:20~40:0~0.5;流速為0.6~1.Oml/min;檢測波長為230~260腿;柱溫為28-3(TC;進(jìn)樣量為510jjl。全文摘要本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留
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，具體地說是一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及其降解活性的鑒定方法。具體為1)降解菌的富集馴化；2)分離篩選；3)復(fù)壯、純化；4)驗(yàn)證降解菌；5)鑒定降解菌株的降解活性，通過玉米生測法初篩出高活性降解菌，再利用高效液相色譜法最終確定高效降解菌株的降解率。本發(fā)明提供的方法能夠高效，廉價(jià)地篩選出以芐嘧磺隆為唯一碳源的高活性降解菌株，可以為降解菌劑的制備提供有效的菌種資源。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101328467SQ200710011800公開日2008年12月24日申請日期2007年6月20日優(yōu)先權(quán)日2007年6月20日發(fā)明者張惠文,張成剛,張曉黎,旭李,蘇振成申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所