專利名稱：：一種土壤微生物基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是一種土壤微生物基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
：土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具活力的組成部分，對維持土壤生態(tài)功能起重要作用。土壤微生物對土壤質(zhì)量的變化非常敏感，因此，土壤微生物一直被認(rèn)為是與土壤質(zhì)量及可持續(xù)發(fā)展能力最為密切相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)之一，為科學(xué)評價(jià)土壤質(zhì)量變化、預(yù)測各種人類活動對土壤環(huán)境的破壞及其潛在風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù).目前可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物還不到自然界中微生物總數(shù)的l%,還有相當(dāng)多的菌種因?yàn)闊o法人工培養(yǎng)而未被人類所認(rèn)識。分子生物學(xué)技術(shù)的引入，使研究土壤微生物生態(tài)降低了對培養(yǎng)技術(shù)的依賴性，而提取土壤DNA則成為開展土壤微生物分子生態(tài)學(xué)工作的前提。土壤成分復(fù)雜，含有大量的無機(jī)及有機(jī)化合物，存在著對某些酶反應(yīng)的抑制劑，如腐殖酸、重金屬離子等都會干擾提取反應(yīng)的進(jìn)行。且各種土壤類型組成不一，這些都為從土壤中有效提取高質(zhì)量的DNA帶來了困難。分子生物學(xué)技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)是用土壤微生物薩A的不均一性來反映土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)特征。因此，獲得高濃度.、大片段、多樣性程度高、具有代表性的土壤微生物總DNA是研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。由于土壤樣品中含有較多的腐殖質(zhì)酸和粘粒等抑制物質(zhì)，這些物質(zhì)可對內(nèi)切酶消化、PCR擴(kuò)增、雜交等后續(xù)操作產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響，因而提取與純化土壤微生物基因組總DNA在研究中尤為重要。土壤微生物基因組DNA提取分為直接和間接提取兩種方法。(1)間接法從土壤中收集細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解得到DNA。此法分離得到的DNA純度較高，但是由于微生物細(xì)胞與土壤粘附在一起，不容易分離，細(xì)胞收集過程中會丟失很多，所獲得顧A量比較少。(2)直接法通過各種手段使微生物細(xì)胞在土壤中裂解，然后抽提純化直接得到總DNA。此法獲得的DNA會受到胞外DNA以及土壤中腐殖質(zhì)酸等物質(zhì)的污染，純度不及間接法高，但是可以得到較多的DNA。土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)是DNA的提取，只有提取到的頭A量大質(zhì)純，多樣性程度高才能更全面真實(shí)地反映土壤中微生物的分布狀態(tài)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種提取純度高不需要核酸吸附材料進(jìn)一步純化，可直接用于PCR擴(kuò)增的土壤微生物基因組DNA提取方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案為提取方法l)初步裂解微生物細(xì)胞取土壤樣品與石英沙相混合放入含有850-1000W提取緩沖液的離心管中，其中土樣與石英沙重量比為1:0.5-1:2;而后將離心管置于核酸提取儀內(nèi)振蕩40-60秒，或在渦旋混合器上振蕩10-20分鐘；2)進(jìn)一步裂解微生物細(xì)胞將50-濃度為100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混勻，在30-4(TC溫洛30-60分鐘后，再加入75-125W20%(w/v)的SDS,混勻，再在60-7(TC溫洛30-60分鐘，10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘，收集上清；3)土壤微生物基因組DNA:將裂解后的緩沖液經(jīng)分離純化得粗提DNA溶液，而后將粗提液純化，即得土壤微生物基因組DNA。所述稱取的待測土樣重量為0.3-0.8g;提取緩沖液為50-120mMTris-HC1(pH8.0)、50-120mMEDTA(pH8.0)和1.0-1.6M,NaCl。所述提取緩沖液優(yōu)選為100mMTris-HCl(pH8.0),100mMEDTA(pH8.0)和1.5MNaCl。所述細(xì)胞裂解液的純化步驟2)分離后的上清液內(nèi)加入其0.1-0.3倍體積的5-10MKAc,冰洛20-60分鐘后，12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘，收集上清，而后在上清液中加入其0.3-0.7倍體積的20°/。-60%(w/v)聚乙二醇溶液和0.1-0.3倍體積的5M-15MNaCl溶液，混勻，室溫放置30分鐘，離心收集DNA沉淀，70%乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入500-700WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量為6000-10000。所得粗提DNA溶液用與其等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后再用與上層水相等體積的氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后加入0.1-0.2倍體積的3MNaAc溶液和0.6-1.0倍體積的異丙醇溶液，混勾后室溫放置30-60分鐘，離心收集DNA沉淀，70%(v/v)乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入30-50l^TE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為25:24:1,氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為24:1。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1.提取產(chǎn)物純度高，本發(fā)明通過核酸提取儀或渦旋混合器振蕩進(jìn)行細(xì)胞破碎，并通過二次細(xì)胞裂解和二次純化，得到高純度基因組DNA可直接用于PCR的擴(kuò)增。2.提取成本低，本發(fā)明在提取土壤微生物基因組顧A的過程中，不需使用商品化的純化試劑盒進(jìn)行純化，因而降低了成本。3.適用范圍廣，可用于多種土壤、活性污泥以及水體沉淀物等樣品中微生物基因組DNA的提取。圖1為三種方法所得DNA電泳圖譜；其中l(wèi)為本發(fā)明，2為利用美國Q-BIOGENE公司生產(chǎn)的FastDNASPINforsoilKIT,3為周氏方法，M為Marker入-HindIII,最大片段為23.13Kb。圖2為以三種方法提取DNA為摸板的PCR結(jié)果圖，其中1、2為本發(fā)明提取的基因組DNA，3、4為釆用美國Q-BIOGENE公司生產(chǎn)的FastDNASPINforsoilKIT試劑盒提取的基因組DNA，5、6為周氏方法提取的基因組DNA,M為MarkerDL2000。圖3為采用本發(fā)明提取4種土壤的基因組DNA電泳圖譜；其中l(wèi)為水稻田土，2為旱田棕土，3為草墊土，4為旱田黑土，M為Marker入-EcoT14。具體實(shí)施方式實(shí)施例1以東北農(nóng)田黑土為例(參見表2),釆用三種方法提取土壤微生物基因組DNA:表2供試土壤理化性質(zhì)/gkg—1釆樣深度sampling有機(jī)質(zhì)pHOrganicmatter全氮TotalN全磷TotalP全鉀TotalK土壤顆粒(mm)物理組成(WParti%clesize(mm)depth(cm)沙粒Sand(0.01-1.0)粉粒Silt(0.001-0.01)粘粒Clay(〈0.001〉0-206.5837.832.560.6126.0051.439.626.6方法一是本發(fā)明提供的方法1)初步裂解微生物細(xì)胞取0.5g土與0.5g石英沙放入1.5ml旋蓋離心管，加入提取緩沖液，用核酸提取儀(美國Q-biogene公司，型號FP220)振蕩40S,震蕩速度為5.5m/s。2)進(jìn)一步裂解微生物細(xì)胞將濃度為100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解的細(xì)胞液中混勻，37。C溫洛30min后，再加入100W20%(w/v)的SDS,混勻，再在65。C溫浴30min，而后以].2000轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5min，收集上清；3)初步純化裂解液步驟2)分離后的上清液內(nèi)加入其0.2倍體積的8MKAc,冰洛20min后，以14000轉(zhuǎn)/分鐘，l(TC下離心20min，收集上清，而后在上清液中加入其0.5倍體積的20y。(w/v)分子量為8000的聚乙二醇溶液和0.1倍體積的5MNaCl溶液，混勻，室溫放置30min,以14000轉(zhuǎn)/分鐘，l(TC下離心20min,收集DNA沉淀，而后用70%乙(v/v)醇洗滌沉淀2次，自然干燥后，加入500mTE溶解，得到粗提腿A溶液，所述TE溶液為10mMTris和lmMEDTA，pH8.0;70%乙醇為4。C預(yù)冷；異丙醇為4°C預(yù)冷。4)進(jìn)一步純化裂解液將所得粗提DNA溶液用與其等體積的酴、氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后再用與上層水相等體積的氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后加入上層水相0.l倍體積的3MNaAc溶液和0.6體積的倍異丙醇溶液，混勻后室溫放置30min,以14000轉(zhuǎn)/分鐘，l(TC下離心20min,收集DNA沉淀，70%(v/v)乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入50WTE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為25:24:1,氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為24:1,所述TE溶液為lOmMTris和lmMEDTA,pH8.0。5)測定所得DNA溶液濃度及純度，并用瓊脂糖電泳檢測目的DNA片段大小及純度。瓊脂糖凝膠濃度為0.6%,電壓50V,電泳2小時(shí)，EB染色30分鐘；檢測提取核酸的濃度和純度使用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的核酸-蛋白含量測定儀(SmartSpecPlusSpectrophotometer)。方法二利用美國Q-BI0GENE公司生產(chǎn)的FastDNASPINforsoilKIT進(jìn)行提取(提取方法見使用說明書)方法三周氏方法(ZhouJZ,MaryAB.TiedjeJM.1996.DNArecoveryfromsoilsofdiversitycomposition.ApplEnvironMicrobiol。62(2):316-322)表1.三種方法所得DM濃度及純度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表l可知，方法1所提取的土壤基因組薩A產(chǎn)量最少，但產(chǎn)物的純度接近試劑盒所提取的結(jié)果，方法三提取的DNA產(chǎn)量最高，但其純度最低，含有大量腐殖質(zhì)等雜質(zhì)，因而方法三提取產(chǎn)物必須經(jīng)過核酸純化試劑盒純化后才能擴(kuò)增出產(chǎn)物來。由圖1可以看出，方法一的產(chǎn)物條帶較為整齊，方法二的碎片段較多，方法三的產(chǎn)物雜質(zhì)較多，三種方法均可得到大片段的基因組DNA。實(shí)施例2以實(shí)施例1三種方法所提取的基因組DNA為摸板，擴(kuò)增16SrRNA基因部分片段，PCR擴(kuò)增引物為27F:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'519R:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，在前引物5'端加上一個(gè)GC夾5,-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcccggggg-3,。PCR反應(yīng)體系為buffer溶液為lOOmMTris、lOOmMEDTA和1.5MNaCl,pH8.0;MgCl2反應(yīng)終濃度2.0mM;dNTP反應(yīng)終濃度0.2mM;前引物Pl反應(yīng)終濃度0.5幽；后引物P2反應(yīng)終濃度0.5南；Taq酶(Takara公司)1U;反應(yīng)才^板1W;反應(yīng)體系總量25吣。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C,5min;變性94°C,10s，退火63°C,30s,10次循環(huán)，每次循環(huán)退火溫度下降1°C。延伸68°C,2min;變性94°C,2min,退火53°C，30s,25次循環(huán)；延伸68°C,2rain;末次延伸68°C,10min。(參見圖2)由圖2所知直接以方法三提取的土壤基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增沒有得到產(chǎn)物，釆用試劑盒(PromegaWizardDNAClean-Up)純化后再進(jìn)行擴(kuò)增得到了目的產(chǎn)物。方法一和方法二所獲得DNA直接擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，說明方法一的提取產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，可以直接用于PCR擴(kuò)增。實(shí)施例3采用本發(fā)明的方法同時(shí)提取四種土壤水稻田土、旱田棕土、草墊土、旱田黑土，前三種土壤樣品采至中科院沈陽生態(tài)所沈陽生態(tài)站，黑土釆至中科院黑龍江海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站。提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為6%，電壓50V，電泳2小時(shí)，同時(shí)檢測提取核酸的濃度和純度(參見表4)。表4.四種土壤基因組DNA提取結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由提取結(jié)果說明本發(fā)明提供的方法完全適合于四種土壤的基因組DNA提取，提取產(chǎn)量在60l^g/ml以上，0D腦m/0D2^在1.78-1.99之間,OD260nm/OD23。nm介于1.70-2.03，說明提取結(jié)果純度較高。電泳結(jié)果(參見圖3)說明所提取的DNA條帶較為整齊，且碎片段較少。實(shí)施例4與實(shí)施例l不同之處在于提取方法l)初步裂解微生物細(xì)胞取O.3g土壤樣品與0.15g石英沙相混合放入含有1000W提取緩沖液的離心管中，而后將離心管置于在渦旋混合器上振蕩10分鐘；提取緩沖液為50mMTris-HC1(pH8.0)、120mMEDTA(pH8.0)和1.0M，NaCl。2)進(jìn)一步裂解微生物細(xì)胞將濃度為100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混勻，在3(TC溫洛60分鐘后，再加入75W20%(w/v)的SDS，混勻，再在7(TC溫浴60分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，收集上清；3)初步純化裂解液步驟2)分離后的上清液內(nèi)加入其0.3倍體積的5MKAc，冰洛60分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，收集上清，而后在上清液中加入其0.7倍體積的60y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.3倍體積的15MNaCl溶液，混勻，室溫放置30分鐘，離心收集MA沉淀，70%乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入700WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量為10000。4)進(jìn)一步純化裂解液所得粗提DNA溶液用與其等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后再用與上層水相等體積的氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后加入0.2倍體積的3MNaAc溶液和1.0倍體積的異丙醇溶液，混勻后室溫放置60分鐘，離心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入3(^TE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為25:24:1，氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為24:1。實(shí)施例5與實(shí)施例l不同之處在于1)初步裂解微生物細(xì)胞取O.8g土壤樣品與1.6g石英沙相混合放入含有900W提取緩沖液的離心管中，而后將離心管置于核酸提取儀內(nèi)振蕩60秒；提取緩沖液為120mMTris-HCl(pH8.0)、50mMEDTA(pH8.0)和1.6MNaCl。2)進(jìn)一步裂解微生物細(xì)胞將濃度為100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混勻，在3(TC溫浴40分鐘后，再加入125W20%(w/v)的SDS，混勻，再在6(TC溫洛50分鐘，11000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清；3)初步純化裂解液步驟2)分離后的上清液內(nèi)加入其0.3倍體積的lOMKAc，冰浴40分鐘后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集上清，而后在上清液中加入其0.3倍體積的40y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.2倍體積的10MNaCl溶液，混勻，室溫放置30分鐘，離心收集DNA沉淀，70%乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入600WTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量為6000。權(quán)利要求1.一種土壤微生物基因組DNA提取方法，其特征在于按如下步驟操作:1)初步裂解微生物細(xì)胞:取土壤樣品與石英沙相混合放入含有850-1000μl提取緩沖液的離心管中，其中土樣與石英沙重量比為1:0.5-2；而后將離心管置于核酸提取儀內(nèi)振蕩40-60秒，或在渦旋混合器上振蕩10-20分鐘；2)進(jìn)一步裂解微生物細(xì)胞:將50-100μl濃度為100mg/ml的溶菌酶加入初步裂解液中混勻，在30-40℃溫浴30-60分鐘后，再加入75-125μl20％(w/v)的SDS，混勻，再在60-70℃溫浴30-60分鐘，10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘，收集上清；3)土壤微生物基因組DNA:將裂解后的緩沖液經(jīng)分離純化得粗提DNA溶液，而后將粗提液純化，即得土壤微生物基因組DNA。2.按權(quán)利要求1所述的土壤微生物基因組DNA提取方法，其特征在于所述稱取的待測土樣重量為0.3-0.8g;提取緩沖液為50-120mMTris-HCl、50-120mMEDTA和1.0-1.6M,NaCl。3.按權(quán)利要求1所述的土壤微生物基因組DNA提取方法，其特征在于所述提取緩沖液優(yōu)選為100mMTris-HCl，100mMEDTA和1.5MNaCl。4.按權(quán)利要求1所述的土壤微生物基因組顧A提取方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液的純化步驟2)分離后的上清液內(nèi)加入其0.1-0.3倍體積的5-lOMKAc,冰浴20-60分鐘后，12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘，收集上清，而后在上清液中加入其0.3-0.7倍體積的2(T/。-60y。(w/v)聚乙二醇溶液和0.1-0.3倍體積的5M-15MNaCl溶液，混勻，室溫放置30分鐘，離心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入500-70(HUTE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量為6000-10000。5.按權(quán)利要求1或4所述的土壤微生物基因組DNA提取方法，其特征在于所得粗提DNA溶液用與其等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提,取上層水相；而后再用與上層水相等體積的氯仿和異戊醇的混合液抽提，取上層水相；而后加入0.1-0.2倍體積的3MNaAc溶液和0.6-1.0倍體積的異丙醇溶液，混勻后室溫放置30-60分鐘，離心收集DNA沉淀，70°/。(v/v)乙醇洗滌沉淀，自然干燥后，加入30-5(mTE溶解，得到DNA溶液；其中酚、氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為25:24:1,氯仿和異戊醇按體積份數(shù)比為24:1。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是一種土壤微生物基因組DNA提取方法。具體將土壤樣品與石英沙相混合放入提取緩沖液中，而后將離心管置于核酸提取儀內(nèi)振蕩40-60秒，或在渦旋混合器上振蕩10-20分鐘；加將50-100μl溶菌酶，30-40℃溫浴30-60分鐘后，再加入75-125μlSDS混勻，再在50-60℃溫浴30-60分鐘，離心得上清液；經(jīng)進(jìn)一步分離純化，即得土壤微生物基因組DNA。采用本發(fā)明方法提取的土壤基因組DNA純度高，OD_260nm/OD_280nm值可達(dá)1.6以上，產(chǎn)量可達(dá)100ug/ml，全程用時(shí)約10小時(shí)；整個(gè)過程中不需用純化試劑盒進(jìn)一步純化，可以直接應(yīng)用于PCR擴(kuò)增，以所得DNA為模板，可以順利擴(kuò)增出目的產(chǎn)物。文檔編號C12N15/31GK101372689SQ200710012539公開日2009年2月25日申請日期2007年8月22日優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日發(fā)明者吳敏娜,張惠文,張成剛,李新宇,蘇振成申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所