專利名稱：一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種三維條件下擴(kuò)增造血干細(xì)胞的技術(shù)方法，具體地說(shuō)制 備微囊化單個(gè)核細(xì)胞，利用微膠囊及微囊化材料自身的理化性質(zhì)促進(jìn)基質(zhì) 細(xì)胞生成，實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞與同源基質(zhì)細(xì)胞三維共培養(yǎng)，基質(zhì)細(xì)胞同時(shí)分 泌細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，在微膠囊內(nèi)共同構(gòu)成類造血微環(huán)境，在僅用少 量細(xì)胞因子的情況下，抑制/延緩造血干細(xì)胞走向分化，并促進(jìn)造血干細(xì)胞 的有效擴(kuò)增。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景，它在血液系統(tǒng)疾病、實(shí)體瘤、 免疫缺陷病、遺傳性疾病、自身免疫性疾病等的支持治療、免疫治療、替 代治療及基因治療中具有廣泛的用途。但造血干細(xì)胞移植在實(shí)際應(yīng)用中存 在數(shù)量限制的問(wèn)題，需要在控制分化的基礎(chǔ)上進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)增。目前，模 擬體內(nèi)造血微環(huán)境被認(rèn)為是體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的最佳方法之一。
造血微環(huán)境是由基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu) 成的三維空間。體外模擬造血微環(huán)境的方法包括(l)在三維支架上培養(yǎng)
造血細(xì)胞；(2)與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)；(3)添加造血細(xì)胞因子。但上述途徑分 別存在如下問(wèn)題(l)培養(yǎng)規(guī)模難以放大，不能滿足臨床使用要求；(2) 異源性基質(zhì)細(xì)胞及建系的基質(zhì)細(xì)胞與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，可能存在免疫排 斥問(wèn)題，而同源基質(zhì)細(xì)胞的制備過(guò)程繁瑣，需要較長(zhǎng)時(shí)間；(3)單用細(xì)胞 因子不能維持體外長(zhǎng)期造血，而且細(xì)胞因子用量大，費(fèi)用昂貴，大大限制 了造血干細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。因此，需要發(fā)展一種三維培養(yǎng)體系，不但能 免除同源基質(zhì)細(xì)胞的制備過(guò)程，而且僅需少量或者不需添加細(xì)胞因子就能 擴(kuò)增出大量造血干細(xì)胞。
基于造血干細(xì)胞的不對(duì)稱分裂原則，起始培養(yǎng)細(xì)胞中盡可能多的保留 造血干細(xì)胞是體外擴(kuò)增的關(guān)鍵。而造血干細(xì)胞從單個(gè)核細(xì)胞中分離、純化 時(shí)不可避免的會(huì)發(fā)生部分丟失，且高度純化的造血干細(xì)胞完全失去其他輔 助細(xì)胞，不僅導(dǎo)致增殖能力的降低，移植物抗白血病及移植物抗宿主效應(yīng) 也會(huì)發(fā)生變化。所以，以單個(gè)核細(xì)胞為起始培養(yǎng)細(xì)胞是最佳的選擇。
本專利提出以海藻酸鈉.-聚賴氨酸(alginate-polylysine， AP).為 復(fù)合材料、根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源及初始單個(gè)核細(xì)胞中CD34 +細(xì)胞數(shù)量確定制 備工藝及材料選擇，制備微囊化單個(gè)核細(xì)胞，并利用微膠囊膜對(duì)生物分子 的選擇性通透作用、海藻酸鈉的理化性質(zhì)和微膠囊內(nèi)的滲透壓脅迫等微環(huán)
境，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞生成，實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞與同源基質(zhì)細(xì)胞的三維共培養(yǎng)。 由于微膠囊膜的截留特性，基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)將聚集在微膠囊內(nèi)， 細(xì)胞因子在微膠囊內(nèi)也會(huì)實(shí)現(xiàn)暫態(tài)高濃度，這樣就可以少用或不用細(xì)胞因 子實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞的有效擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可規(guī)?；脑煅?細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，其將在血液生物學(xué)和臨床應(yīng)用研究中發(fā)揮重要作用。 該方法可以利用微膠囊的特定理化性質(zhì)模擬造血微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞
與多種細(xì)胞(如基質(zhì)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)三維共培養(yǎng)，有效擴(kuò)增造血干 細(xì)胞。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用技術(shù)方案為； 一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，以海藻酸鈉、聚賴氨酸為復(fù)合材料，
采用擠出/外部凝膠化法制備AP微囊化單個(gè)核細(xì)胞；將微囊化單個(gè)核細(xì)胞 加入到擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置37t:、空氣中含體積5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2-3天定期更換培養(yǎng)基，即為造血干細(xì)胞擴(kuò)增體系。 具體為
1) 單個(gè)核細(xì)胞的分離釆用密度梯度離心法，用Ficoll淋巴細(xì)胞分
離液密度梯度離心分離臍血或骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞；其中含有占總細(xì)胞個(gè) 數(shù)O. 7-3. 1。/。的CD34 +細(xì)胞;
2) 微囊化單個(gè)核細(xì)胞的制備
A. 將p-L-古洛糖醛酸重量含量30-40 %、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 60-70 %的海藻酸鈉配制成1. 0-3. 0%w/v海藻酸鈉溶液I ;
將L-古洛糖醛酸重量含量60-70 %、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 30-40%的海藻酸鈉配制成0. 8-2. 5y。w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: 5-5: l體積比例混合，得
海藻酸鈉溶液m;
B. 將單個(gè)核細(xì)胞重懸于海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中含有細(xì)胞8 x 1 05-2 x 1 07個(gè)；
C. 采用擠出/外部凝膠化法將海藻酸鈉細(xì)胞懸液加入pH=7. 0-7. 4質(zhì)量 濃度0. 8-1. 6°/。氯化錦的水溶液中，獲得直徑大小在300-500ium之間的海藻 酸鈣膠珠；
將海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，聚賴氨酸的分子量20 -35Mw、 w/v濃度為0.04-0.1%,聚賴氨酸溶液與海藻酸鈣膠珠的體積比為 8-14: 1,反應(yīng)成膜時(shí)間為5-20min,膜厚在5 - 50 |i m范圍內(nèi)；得到非液
化的微膠囊；
將50-100 iaM檸檬酸鈉溶液按體積比8-14: 1加入非液化的微膠囊中， 靜置3-8分鐘；得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的液
化微膠囊；
3)將微膠囊按體積比1: 8-15置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)，單個(gè)核細(xì)胞能
夠在微膠囊內(nèi)存活，并發(fā)生顯著增殖；
擴(kuò)增培養(yǎng)基為于IMDM培養(yǎng)液中添加2-5ng/ml白介素-3， 15-25ng/ml 干細(xì)胞因子，5-10ng/ml人FLT-3配體，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，終體 積濃度10%胎牛血清，pH=7.0-7.2。
當(dāng)所述擠出/外部凝膠化法為靜電液滴發(fā)生法時(shí)，通過(guò)控制微膠囊制備 儀的操作條件來(lái)調(diào)整微膠囊粒徑，其操作條件為電壓40 - 85v、頻率IOO -160Hz、泵速5-16ml/小時(shí)、針頭孔徑4-8#。
單個(gè)核細(xì)胞為人、鼠等多來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞，如人臍血、人骨髓或鼠骨髓。
培養(yǎng)時(shí)間5-15天，擴(kuò)增培養(yǎng)基的組成根據(jù)所選定的單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源及 初始單個(gè)核細(xì)胞中CD34 +細(xì)胞數(shù)量確定。
為滿足造血干細(xì)胞擴(kuò)增對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散和三維生長(zhǎng)環(huán)境等的特殊要求，本 專利提出以海藻酸鈉、聚賴氨酸為材料，制備AP微膠囊，包括液化型與非 液化型；并釆用單個(gè)核細(xì)胞，包括人、鼠等細(xì)胞來(lái)源；
根據(jù)單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源及初始單個(gè)核細(xì)胞中CD34 +細(xì)胞數(shù)量釆用海藻酸
鈉組合配置，按照海藻酸鈉基質(zhì)強(qiáng)度、與膜材料交聯(lián)程度及物質(zhì)傳遞等標(biāo) 準(zhǔn)，確定海藻酸鈉濃度、海藻酸鈉(3-L-古洛糖醛酸與a-D-甘露糖醛酸比例 及聚賴氨酸的分子量和成膜時(shí)間，釆用靜電液滴發(fā)生法、氣流噴射法等擠 出/外部凝膠化方法對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行微囊化包封，制備微囊化單個(gè)核細(xì)胞 并培養(yǎng)，以有效擴(kuò)增造血干細(xì)胞。
經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，微膠囊內(nèi)部分單個(gè)核細(xì)胞生成基質(zhì)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞 與同源基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，基質(zhì)細(xì)胞同時(shí)分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)，在微 膠囊內(nèi)共同形成類造血微環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)，在僅用少量細(xì)胞因子的情況下， 抑制/延緩造血干細(xì)胞走向分化，有效擴(kuò)增造血干細(xì)胞，并可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化培 養(yǎng)；細(xì)胞存活率>96%,細(xì)胞含量180-250 cells/個(gè)微膠囊，微膠囊粒徑可 在300-500 nm精確可控；
與已有的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法相比，本發(fā)明有其明顯的優(yōu)勢(shì)第一， 微囊化細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽浜鸵?guī)?；囵B(yǎng)，在培養(yǎng)規(guī)模上可以滿足臨 床使用要求；第二， APA微膠嚢及材料的特殊理化性質(zhì)可以促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞生 成，免除基質(zhì)細(xì)胞繁瑣的制備過(guò)程，實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞與同源基質(zhì)細(xì)胞微膠 囊內(nèi)的三維共培養(yǎng)；第三，在微膠囊的三維空間內(nèi)，造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì) 胞充分接觸，基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)既可直接作用于造血 干細(xì)胞，又可在局部實(shí)現(xiàn)暫態(tài)富集，加之微膠囊膜的控釋性，大大增強(qiáng)了 滋養(yǎng)成份在三維空間中對(duì)造血干細(xì)胞的生物學(xué)作用，從而大大減少細(xì)胞因 子用量，降低成本。因此，在僅用少量或不用細(xì)胞因子的情況下，利用微 膠囊包封、培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞，在抑制或延緩造血干細(xì)胞走向分化的同時(shí)，
可以實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞有效和規(guī)模化擴(kuò)增。
本發(fā)明具有操作方便、簡(jiǎn)單、細(xì)胞活性高、可規(guī)模化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例的相差顯微鏡照片(baFlOOum)，可見AP微囊化單 個(gè)核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7天后可形成三維細(xì)胞聚集體；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的共聚焦顯微鏡照片；單個(gè)核細(xì)胞微囊化包封 (day 0)和培養(yǎng)后(day 15)的死活染色照片(bar=80 ja m)，可見微囊化 包封及培養(yǎng)過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響(中間部位的綠色代表活細(xì)胞)；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的不同細(xì)胞載量的微囊化單個(gè)核細(xì)胞的增殖曲 線A和代謝曲線B，可見隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸增多，乳酸生成 增多；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例1的微囊化單個(gè)核細(xì)胞HE染色照片(ba^80jam)。 可見微膠囊內(nèi)的細(xì)胞聚集體結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞外有明顯(嗜酸紅染)的細(xì)胞 外基質(zhì)；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例1微囊化單個(gè)核細(xì)胞CD45染色的免疫熒光共聚焦 圖片(bar4 00 um)。 A為CD45染色陽(yáng)性細(xì)胞，B為同一部位的光鏡照片，C 為A和B的疊加。C圖顯示微膠囊內(nèi)疊加部位(紅染部位)為造血細(xì)胞，未 疊加部位(非紅染部位)為基質(zhì)細(xì)胞。可見微膠囊內(nèi)的細(xì)胞聚集體中，大 部分為造血細(xì)胞，小部分為基質(zhì)細(xì)胞(A和B疊加部位為造血細(xì)胞，未疊 加部位為基質(zhì)細(xì)胞)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，
1) 單個(gè)核細(xì)胞的分離
人臍帶血中的有核細(xì)胞的獲取將重量濃度0. 125%的甲基纖維素溶液 按4: 1的體積比加入人的臍帶血中，室溫靜置，沉降紅細(xì)胞；取上清液 1500rpm/min離心，沉降物即有核細(xì)胞。
密度梯度離心，將密度為1. 077/ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液按l: 1 的體積比加于有核細(xì)胞上，1500rpm/mim, 30min,吸取中間層的單個(gè)核細(xì)胞； 其中含有CD34 +細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞總個(gè)數(shù)的0. 9 % ; PBS洗滌 (1500rpm/min， 5min)后調(diào)整細(xì)胞密度待用。
2) 微囊化單個(gè)核細(xì)胞的制備
.A.將p-L-古洛糖醛酸重量含量31.2%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 68. 8 %的海藻酸鈉配制成1. 5%w/v海藻酸鈉溶液I ;
將P-L-古洛糖醛酸重量含量66%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為34% 的海藻酸鈉配制成0. 9%w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按5: l體積比例混合，得海藻酸 鈉溶液III;
B. 將單個(gè)核細(xì)胞均勾重懸于海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中細(xì)胞為6 x 106個(gè)；
C. 釆用靜電液滴發(fā)生法，操作條件為電壓45v、頻率120Hz、泵速 8ml/小時(shí)、針頭孔徑5#，將海藻酸鈉細(xì)胞重懸液滴入pH=7. 0-7. 4質(zhì)量濃 度1.1%氯化鈣的水溶液中，靜置20分鐘得海藻酸鈣膠珠，膠珠直徑 300-400)im精確可控；
將分子量35Mw、 w/v濃度0.05%的聚賴氨酸按體積比10: 1加入海藻 酸鈣膠珠中，成膜時(shí)間為10min，膜厚約25nim;得到非液化的微膠囊；
將55pM檸檬酸鈉溶液按體積比10: l加入非液化的微膠囊中，靜置 5分鐘；收集液化的微膠囊；
釆用靜電液滴法在生理?xiàng)l件下制備AP微囊化單個(gè)核細(xì)胞，制備過(guò)程對(duì) 細(xì)胞活性沒(méi)有損害，如圖2;
3)將液化的微膠囊按體積比1: 10置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37"擴(kuò)增15 天，單個(gè)核細(xì)胞能夠在微膠囊內(nèi)存活，并發(fā)生顯著增殖，如圖3;
在APA微膠囊內(nèi)培養(yǎng)過(guò)程中，部分單個(gè)核細(xì)胞借助微膠囊及材料的特 殊理化性質(zhì)生成基質(zhì)細(xì)胞，如圖5,基質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，
共同在微膠囊內(nèi)構(gòu)建三維造血微環(huán)境，促進(jìn)造血干細(xì)胞在體外的有效擴(kuò)增。
擴(kuò)增培養(yǎng)基為于IMDM培養(yǎng)液中添加3ng/ml白介素-3， 20ng/ml干細(xì) 胞因子，8ng/ml人FLT-3配體，1. 8ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10% 胎牛血清，pH=7. 0-7. 2。
造血干細(xì)胞在微膠囊內(nèi)重構(gòu)的造血微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增，即在添 加少量細(xì)胞因子的情況下，APA微囊化單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)7天后，CD34 +細(xì)胞及集落形成細(xì)胞(CFU-C)的擴(kuò)增倍數(shù)分別可達(dá)13倍和9倍。
釆用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞在體外的有效擴(kuò)增，批量獲得干細(xì)胞， 滿足組織工程研究中對(duì)種子細(xì)胞的需求。利用AP微膠囊的特定微環(huán)境，干 細(xì)胞可與多種細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)。
實(shí)施例2
一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，
1) 單個(gè)核細(xì)胞的分離
密度梯度離心，將密度為1. 077/ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液按1. 5: 1的體積比加于人骨髓液上，1500rpm/mim, 30min,吸取中間層的單個(gè)核細(xì) 胞；其中含有CD34 +細(xì)胞的數(shù)量細(xì)胞總個(gè)數(shù)的1.9%; PBS洗滌 (1500rpm/min, 5min)后調(diào)整細(xì)胞密度待用；
2) 微囊化單個(gè)核細(xì)胞的制備
A.將P-L-古洛糖醛酸重量含量37%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為63 %的海藻酸鈉配制成1. 0%w/v海藻酸鈉溶液I ;
將P-L-古洛糖醛酸重量含量62%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為38% 的海藻酸鈉配制成2. 5。/。w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: l體積比例混合，得海藻酸 鈉溶液III;
B. 將單個(gè)核細(xì)胞重懸于海藻酸鈉溶液m中，每ml溶液中細(xì)胞為3xl06
個(gè)；
C. 將重懸液滴入p^7. 0-7. 4質(zhì)量濃度0. 9%氯化鈣的水溶液中，靜置 15分鐘得海藻酸鈣膠珠，控制膠珠直徑大小在300-500nm之間；
將分子量30麗、質(zhì)量濃度0. 07 %的聚賴氨酸溶液按體積比12: 1加入 海藻酸鈣膠珠中，成膜時(shí)間為12min,膜厚約40pm范圍；得到非液化的微 膠囊；
將80nM杼檬酸鈉溶液按體積比10: l加入非液化的微膠囊中，靜置6
分鐘；收集液化的微膠囊；
3)將液化的微膠囊按體積比1: 10置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37。C擴(kuò)增15 天，單個(gè)核細(xì)胞能夠在微膠囊內(nèi)存活，并發(fā)生顯著增殖。
擴(kuò)增培養(yǎng)基為于頂DM培養(yǎng)液中添加3ng/ml白介素-3, 20ng/ml干細(xì) 胞因子，8ng/ml人FLT-3配體，1. 8ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10% 胎牛血清，pH=7. 0-7. 2。
造血干細(xì)胞在微膠囊內(nèi)重構(gòu)的造血微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增，即在添 加極少量細(xì)胞因子的情況下，AC微囊化單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)6天后，CD34 +細(xì)胞及集落形成細(xì)胞(CFU-C)的擴(kuò)增倍數(shù)分別可達(dá)16. 47倍和12. 3倍。
采用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞在體外的規(guī)?；囵B(yǎng)，批量獲得干細(xì) 胞，滿足組織工程研究中對(duì)種子細(xì)胞的需求；利用AC微膠囊的特定微環(huán)境， 干細(xì)胞可與多種細(xì)胞(包括基質(zhì)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1. 一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，其特征在于:以海藻酸鈉、聚賴氨酸為復(fù)合材料，采用擠出/外部凝膠化法制備AP微囊化單個(gè)核細(xì)胞；將微囊化單個(gè)核細(xì)胞加入到擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置37℃、空氣中含體積5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天定期更換培養(yǎng)基，即為造血干細(xì)胞擴(kuò)增體系。
2. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于具體步驟如下，1) 單個(gè)核細(xì)胞的分離用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離 臍血或骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞；2) 微囊化單個(gè)核細(xì)胞的制備A. 將p-L-古洛糖醛酸重量含量30-40%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 60-70%的海藻酸鈉配制成1.0-3.0G/。w/v海藻酸鈉溶液I ;將P-L-古洛糖醛酸重量含量60-70%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 30-40%的海藻酸鈉配制成0.8-2.5%w/v海藻酸鈉溶液II;將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: 5-5: l體積比例混合，得 海藻酸鈉溶液III;將單個(gè)核細(xì)胞均句重懸于海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中含有細(xì)胞8 x 105-2 x 1 07個(gè)；B. 釆用擠出/外部凝膠化法將海藻酸鈉細(xì)胞重懸液加入PH=7. 0-7. 4質(zhì) 量濃度0.8-1. 6%氯化鈣的水溶液中，靜置10-30分鐘，獲得直徑大小在 300-5 00|um之間的海藻酸鉤凝膠珠；將海藻酸鉤凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，海藻酸鈣膠珠與聚賴氨 酸溶液的體積比為1: 8-14,聚賴氨酸的分子量20 - 35碰、w/v濃度 0.04-1.0%,反應(yīng)成膜時(shí)間為5-20min,膜厚在5 - 50 )i m范圍內(nèi)，形成非液化的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊；將lO-lOO]aM檸檬酸鈉溶液按體積比8-14: l加入非液化的微膠囊中， 靜置3-8分鐘，得到海藻酸鈉/聚賴氨酸半透膜包封的內(nèi)部為液態(tài)環(huán)境的液 化微膠囊；3) 4液化的微膠囊按體積比1: 8-15置于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，擴(kuò)增培養(yǎng)基 為于IMDM培養(yǎng)液中添加2-5ng/ml白介素-3， 15-25ng/ml干細(xì)胞因子， 5-10ng/ml人FLT-3配體，1. 2-2. 5ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10% 胎牛血清，pH=7. 0-7. 4。.
3. 按照權(quán)利要求l所述,其特征在于當(dāng)所述擠出/外部凝膠化法為靜 電液滴發(fā)生法時(shí)，通過(guò)控制微膠囊制備儀的操作條件來(lái)調(diào)整微膠囊粒徑， 其操作條件為電壓40 - 85v、頻率IOO-160Hz、泵速5-16ml/小時(shí)、針頭 孔徑4 - 8 # 。
4. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于 所述單個(gè)核細(xì)胞為人臍血、人骨髓或鼠骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞。
5. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)時(shí)間5-15天， 培養(yǎng)基的組成根據(jù)所選定的單個(gè)核細(xì)胞及CD34 +細(xì)胞含量確定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，包括單個(gè)核細(xì)胞的分離；微囊化單個(gè)核細(xì)胞的制備和培養(yǎng)；造血干細(xì)胞的擴(kuò)增。本發(fā)明不但能實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞的有效擴(kuò)增，還能進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，從而推動(dòng)了血液生物學(xué)和臨床應(yīng)用研究的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK101381701SQ20071001276
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日
發(fā)明者于煒婷, 李雙月, 為 王, 馬小軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所