專利名稱：一種對hbv拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法。
背景技術(shù)：
拉米夫定是目前普遍使用的治療慢性乙肝的核苷類似藥物，但用藥后易引起HBV基因組突變而使HBV產(chǎn)生耐藥性，降低治療的效果。目前多數(shù)臨床資料認為，乙型肝炎患者拉米夫定治療過程中HBV出現(xiàn)YMDD基因變異是HBV耐藥的主要原因，因此YMDD基因變異檢測是拉米夫定耐藥的主要指標。
實時熒光PCR擴增是近期國內(nèi)應(yīng)用較多的HBV耐藥檢測方法。檢測原理如下其對基因點突變的檢測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度.這樣便可對基因的突變和多態(tài)性進行分析。
它的具體作法是首先對待分析的DNA片段進行PCR擴增，以增加待檢測目的片段的數(shù)量加入緩沖液，DNA引物，單核苷酸堿基，DNA聚合酶，去離子水，DNA模板，兩條熒光基團標記DNA探針探針，進行擴增反應(yīng)。擴增過程為94℃變性60秒后進入一個循環(huán)過程，循環(huán)條件為94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，循環(huán)25次，擴增完成后，立即進入熔解溫度檢測步驟將擴增產(chǎn)物溫度從45℃以0.5℃每秒的幅度進行遞增，直至溫度達到94℃。在此過程中連續(xù)檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號，結(jié)合相應(yīng)軟件的分析，得到該檢測樣品的熔解溫度，從而分析該樣品的基因的突變和多態(tài)性。
現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是1)檢測成本高昂檢測需要兩條熒光基團標記的探針才能實現(xiàn)，熒光探針制備費用相對較高；2)功能單一檢測結(jié)果只能對檢測位點是否發(fā)生突變進行檢測，但不能檢測出單個堿基的變化情況；3)檢測結(jié)果不夠準確由于檢測的目標是反應(yīng)過程中熒光強度的變化，在一個反應(yīng)體系中，由于兩條熒光探針的存在，不可避免的帶來了熒光背景的干擾，導致結(jié)果不準確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要提供一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的檢測成本高昂、功能單一和檢測結(jié)果不夠準確的問題。
為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的解決方案是一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟，首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入在反應(yīng)管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針進行擴增反應(yīng)；然后進行熒光偏振檢測及數(shù)據(jù)分析對完成上述步驟的產(chǎn)物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數(shù)值的讀取，判定檢測結(jié)果。
上述擴增步驟中還加入UNG酶?？山到馄渌鸓CR產(chǎn)物，防止非特異信號的產(chǎn)生，起到防污染的作用。
上述擴增反應(yīng)中加入4.5～5份緩沖液，1～1.2份DNA引物(HBV特異性)，0.8～1份單核苷酸，1～1.2份DNA聚合酶，0.5～0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，26～27.5份去離子水，5±0.05份DNA模板。
上述擴增步驟中還加入1～1.2份UNG酶。
上述擴增反應(yīng)的具體過程是94～95℃熱變性3～5分鐘后進入一個擴增循環(huán)，循環(huán)條件為94～95℃變性18～25秒，55～60℃退火35～40秒，70～72℃延伸28～35秒，循環(huán)32～35次，循環(huán)完成后15～18℃保持18～25分鐘使樣品冷卻。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1、檢測所需試劑成本低廉本發(fā)明中除常規(guī)PCR所需要的試劑體系外，只需要一條熒光素標記的探針便可完成。
2、功能多利用本發(fā)明，不僅可根據(jù)探針的序列，對單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)及點突變進行分析檢測，檢測結(jié)果準確，靈敏。同時能夠判斷出模板檢測部分的基因序列。這是由于在反應(yīng)體系中使用的是熒光基團標記的DNA探針，從而避免了引物以及單核苷酸對熒光染料與模板結(jié)合的競爭。進行反應(yīng)時，當模板與熒光基團標記的DNA探針發(fā)生雜交時，熒光基團標記DNA探針分子量會發(fā)生改變，熒光偏振值也會相應(yīng)改變，證明模板基因序列與探針序列互補；而當模板不能夠與熒光基團標記的DNA探針雜交時，熒光偏振值不發(fā)生改變。通過對熒光偏振值的讀取，就能夠判斷出模板檢測部分的基因序列。
3、檢測結(jié)果準確首先本發(fā)明排除了熒光背景干擾的可能，這是由于本發(fā)明在檢測中采用的是熒光偏振的檢測方法，熒光偏振的強度變化，它不受熒光素濃度改變而改變(在熒光素濃度達到檢測域值后)，而是根據(jù)試劑的反應(yīng)的情況而發(fā)生改變，避免了熒光背景的干擾，就大大減少了影響檢測結(jié)果的因素。其次，新方法是直接檢測待測樣品的熒光偏振值，而現(xiàn)有技術(shù)中的方法是通過檢測待測樣品與探針的熔解溫度，從而間接的判斷出待測樣品突變性質(zhì)。因此新方法更加直觀，影響因素更少，結(jié)果也更加準確。
4、對實驗操作條件要求降低因為避免了熒光強度背景干擾的可能，產(chǎn)生熒光污染的可能性也降低，因此對實驗操作條件要求降低，操作性得到提高。
5、減輕工作人員的勞動強度現(xiàn)有技術(shù)的檢測發(fā)生在擴增過程中，在此過程中需要連續(xù)檢測，而本發(fā)明的檢測是在產(chǎn)物擴增完成后進行，因此減輕了勞動強度。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細的說明。
實施例1一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟1)擴增及摻入該步驟對從標本中提取的DNA片段進行PCR擴增，擴增的同時，熒光標記的探針摻入到HBV目的基因中。
具體方法是加入5份緩沖液，1份DNA引物(HBV特異性)，1份單核苷酸，1份DNA聚合酶，0.5份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，27.5份去離子水，5份DNA模板，1份UNG酶，進行擴增反應(yīng)。
反應(yīng)過程為94℃熱變性4分鐘后進入一個擴增循環(huán)，循環(huán)條件為94℃變性20秒，57℃退火40秒，72℃延伸30秒，循環(huán)35次；循環(huán)完成后15℃保持20分鐘使樣品冷卻。
2)熒光偏振檢測及數(shù)據(jù)分析對完成步驟1的產(chǎn)物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數(shù)值的讀取，判定檢測結(jié)果，確定HBV拉米夫定耐藥特異性。
實施例2一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟1)擴增及摻入該步驟對從標本中提取的DNA片段進行PCR擴增，擴增的同時，熒光標記的探針摻入到HBV目的基因中。
具體方法是加入4.5份緩沖液，1.2份DNA引物(HBV特異性)，0.8份單核苷酸，1.2份DNA聚合酶，0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，26份去離子水，5.05份DNA模板，1.2份UNG酶，進行擴增反應(yīng)。
反應(yīng)過程為95℃熱變性5分鐘后進入一個擴增循環(huán)，循環(huán)條件為95℃變性25秒，55℃退火40秒，70℃延伸35秒，循環(huán)32次，循環(huán)完成后18℃保持25分鐘使樣品冷卻。
2)熒光偏振檢測及數(shù)據(jù)分析對完成步驟1的產(chǎn)物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數(shù)值的讀取，判定檢測結(jié)果，確定HBV拉米夫定耐藥特異性。
權(quán)利要求
1.一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于依次包括下述步驟首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入反應(yīng)管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針，進行擴增反應(yīng)；然后進行熒光偏振檢測及數(shù)據(jù)分析對完成上述步驟的產(chǎn)物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數(shù)值的讀取，判定檢測結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增步驟中還加入UNG酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增反應(yīng)中加入4.5～5份緩沖液、1～1.2份DNA引物(HBV特異性)、0.8～1份單核苷酸、1～1.2份DNA聚合酶、26～27.5份去離子水、5±0.05份DNA模板和0.5～0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)。
4.如權(quán)利要求3所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增步驟中還加入1～1.2份UNG酶。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增反應(yīng)的具體過程是94～95℃熱變性3～5分鐘后進入一個擴增循環(huán)，循環(huán)條件為94～95℃變性18～25秒，55～60℃退火35～40秒，70～72℃延伸28～35秒，循環(huán)32～35次，循環(huán)完成后15～18℃保持18～25分鐘使樣品冷卻。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法。現(xiàn)有技術(shù)檢測成本高昂、功能單一、檢測結(jié)果不夠準確。本發(fā)明提供一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，包括下述步驟首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入反應(yīng)管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針，進行擴增反應(yīng)；然后進行熒光偏振檢測及數(shù)據(jù)分析對完成上述步驟的產(chǎn)物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數(shù)值的讀取，判定檢測結(jié)果。優(yōu)點是檢測所需試劑成本低廉、功能多、檢測結(jié)果準確、對實驗操作條件要求降低、減輕工作人員的勞動強度。
文檔編號C12Q1/68GK101024855SQ20071001758
公開日2007年8月29日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者崔崇軍, 雷紅文, 張菊 申請人:陜西陽光生物工程股份有限公司