專(zhuān)利名稱(chēng)：抗重金屬鉛單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是抗重金屬鉛單克隆抗體的制備，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專(zhuān)用于特異性識(shí)別重金屬鉛單克隆抗體的制備，及其在農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中重金屬殘留的高靈敏快速檢測(cè)，特別適用于大批量樣品檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。
背景技術(shù)：
鉛是環(huán)境污染物中毒性很大的一種重金屬，在自然界中分布廣，工業(yè)用途多。隨著我國(guó)工業(yè)及交通運(yùn)輸業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境鉛污染日趨嚴(yán)重。由于鉛是多親和性毒物，易在人體的某些器官中積蓄起來(lái)造成慢性中毒危害人體健康，主要損害神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管及消化系統(tǒng)，對(duì)兒童的作用更為敏感。一些行業(yè)通過(guò)頒布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鉛的最大允許量，如糧食中的鉛現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是0.4mg/kg，蔬菜是0.2mg/kg，用于農(nóng)業(yè)的污泥，每Kg干燥污泥的鉛最高允許量為20mg。
傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法多采用化學(xué)儀器檢測(cè)，如利用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、離子色譜儀、X射線熒光光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，檢測(cè)儀器昂貴，這些檢測(cè)方法雖然能夠精確測(cè)量樣品中單種金屬的總量，但檢測(cè)相對(duì)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)用昂貴，需要進(jìn)行大量的樣品預(yù)處理，且樣品的檢測(cè)需在大型分析設(shè)備的室內(nèi)進(jìn)行，不適應(yīng)實(shí)踐中快速簡(jiǎn)便靈敏的需要。
重金屬的免疫檢測(cè)方法具有快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜而進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)?？朔藗鹘y(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)。通過(guò)化學(xué)合成高選擇性重金屬離子捕獲螯合劑，制備重金屬離子螯合物，與載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原，制備針對(duì)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中重金屬離子螯合物特異性的單克隆抗體。建立重金屬離子螯合物免疫學(xué)檢測(cè)方法，該方法的完成，將解決重金屬螯合、偶聯(lián)、單克隆抗體制備等關(guān)鍵技術(shù)，建立重金屬離子螯合物的免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)。該專(zhuān)利不僅為食品安全檢測(cè)，而且為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品等的出入境檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)的水域監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段和檢測(cè)方法。重金屬殘留的免疫學(xué)快速檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)將會(huì)實(shí)現(xiàn)很好的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的可持續(xù)健康發(fā)展、解決食品安全問(wèn)題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的是提供鉛單克隆抗體的制備方法，通過(guò)合成鉛抗原，免疫BalB/C鼠，利用雜交瘤技術(shù)制備特異性強(qiáng)的鉛單克隆抗體，并用于農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中重金屬殘留的高靈敏快速檢測(cè)。
技術(shù)方案1、鉛單克隆抗體的制備方法，包括1)抗原制備稱(chēng)取血藍(lán)蛋白15mg溶于2ml 10mM，pH7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液中形成7.5mg/ml血藍(lán)蛋白溶液；稱(chēng)取雙功能金屬螯合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸8mg溶于0.8ml超純水形成金屬螯合劑溶液；將0.8ml金屬螯合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液攪拌下逐滴滴加到2ml 7.5mg/ml血藍(lán)蛋白溶液中后，再逐滴加入0.2ml 20mM戊二醛，室溫下反應(yīng)24hr；反應(yīng)產(chǎn)物用30Kd的超濾管純化，超濾管預(yù)先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超純水充分沖洗后，超濾管內(nèi)加入反應(yīng)產(chǎn)物超濾，超濾管內(nèi)用10mM，pH7.4N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液5次除去其中未反應(yīng)的小分子金屬螯合劑，所得產(chǎn)物即為純化的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸；30mg牛血清白蛋白溶于6ml 10mM，pH7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液中，稱(chēng)取18mg對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于1.8ml超純水中，取6ml濃度為5mg/ml的牛血清白蛋白攪拌下逐滴滴加到1.8ml的對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液中，同時(shí)加入5ml濃度為20mM的戊二醛溶液，室溫下攪拌24hr；反應(yīng)產(chǎn)物用上述30Kd超濾管方法進(jìn)行純化除去其中未反應(yīng)的小分子金屬螯合劑，所得產(chǎn)物即為純化的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液，將牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液等分成兩份，一份直接用作包被抗原，一份用于下面的反應(yīng)；稱(chēng)取43.8mg純度為99.999％的鉛顆粒溶于1ml 6M硝酸中，形成212.6mM硝酸鉛溶液；取99μl硝酸鉛溶液攪拌下分別逐滴滴加到純化過(guò)的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液中，用0.5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，室溫下反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)產(chǎn)物用上述30Kd的超濾管方法進(jìn)行純化去除未反應(yīng)的金屬離子，純化后的產(chǎn)物分別為血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb，以所含蛋白量計(jì)算獲得的鉛人工抗原的量，以血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作免疫原，以牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作為包被抗原；2)小鼠免疫將制備好的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作為免疫原免疫6-8周齡雌性健康BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量均為200μg，共免疫五次，前兩次免疫間隔3周采用等體積的抗原和佛氏完全佐劑乳化，腹腔注射，以后三次免疫間隔2周用等體積的佛氏不完全佐劑和免疫原乳化；從第四次開(kāi)始，每次免疫后一周鼠尾靜脈采血通過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體的特異性，分別用相同濃度的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶聯(lián)微量分析板，4℃過(guò)夜或37℃放置2小時(shí)；用含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；加入相同數(shù)量的血清37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；磷酸鹽緩沖液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；50μl/孔四甲基聯(lián)苯胺顯色，37℃10分鐘；加入25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀測(cè)450nm處吸光值，并計(jì)算差異％，差異％＝{牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb的吸光值-牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值}/牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值×100％；3)細(xì)胞融合通過(guò)差異率篩選BalB/c鼠，差異率超過(guò)50％的BalB/c鼠用N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液稀釋血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb直接免疫，三天后取脾臟，脾細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞用ClonaCellTM-HY試劑盒制備雜交瘤細(xì)胞，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-14天后，通過(guò)檢測(cè)融合孔上清篩選雜交瘤細(xì)胞；4)雜交瘤篩選融合孔上清用上述篩選小鼠的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行初步篩選，用相同濃度的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶聯(lián)微量分析板上，4℃放置過(guò)夜；用含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；加入相同數(shù)量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔調(diào)零，用SP2/0的上清作陰性對(duì)照，37℃1小時(shí)，含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；加入磷酸鹽緩沖液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；四甲基聯(lián)苯胺顯色，50μl/孔，37℃10分鐘；加25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀測(cè)450nm處吸光值，用牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb包被的成陽(yáng)性而用牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸包被的孔的讀數(shù)接近SP2/0讀數(shù)的融合孔即為陽(yáng)性孔；由于鉛離子是小分子不具有免疫原性，單獨(dú)的金屬離子也足以形成抗原表位，作必須借助螯合劑二乙三胺五乙酸形成半抗原與抗體反應(yīng)，為了進(jìn)一步確定得到陽(yáng)性孔所分泌抗體是針對(duì)金屬鉛而不與二乙三胺五乙酸反應(yīng)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)一步確定抗體的特異性，用牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜，0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃1.5小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；各種濃度1，2，5，10，20，50mM二乙三胺五乙酸溶液與等體積的融合孔上清充分混勻室溫反應(yīng)45分鐘，50μl/孔加入到酶聯(lián)板上，37℃1小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；磷酸鹽緩沖液溶液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘，加入25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀上450nm處讀數(shù)，用不加乙二胺四乙酸的孔作陽(yáng)性對(duì)照吸光值A(chǔ)0，加乙二胺四乙酸孔的吸光值A(chǔ)， 若A＝A0，則A對(duì)應(yīng)的加乙二胺四乙酸的濃度則為乙二胺四乙酸的最佳濃度，且所選乙二胺四乙酸濃度必須大于金屬離子的最大濃度。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在(1)抗原實(shí)用性強(qiáng)鉛抗原合成與抗體制備技術(shù)具有重要的使用價(jià)值和實(shí)際意義。上述方法利用雙功能金屬螯合劑，有效地合成鉛抗原，免疫Balb/C鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備特異性識(shí)別重金屬鉛的單克隆抗體，為重金屬鉛免疫速測(cè)試劑盒的研制解決了一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，為重金屬鉛高效快速簡(jiǎn)便的殘留分析開(kāi)山辟路，必將迅速推動(dòng)我國(guó)鉛免疫速測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)。
(2)抗原和抗體穩(wěn)定性好此法合成的鉛抗原具有較好的穩(wěn)定性，-20℃冰箱至少可以存放4年不影響其免疫原性。液氮保存的雜交瘤細(xì)胞至少可以保持3年，抗體的穩(wěn)定性也比較好，純化的抗體-20℃冰箱可存放2年。
(3)抗原制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行抗原的整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需要特殊的儀器設(shè)備，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)檢測(cè)曲線進(jìn)行初步探索。方法如下包被用10mM、pH7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液稀釋包被抗原牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb，50μl/孔加到96孔酶聯(lián)微量分析板(Corning Co.)上，4℃放置過(guò)夜或37℃放置2h；洗滌PBST洗滌5次；封閉PBST稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃1.5小時(shí)；洗滌PBST洗滌5次；加樣用含2mM二乙三胺五乙酸(Sigma Co.)的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液將鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(Sigma Co.)逐級(jí)稀釋成2，0.2，0.02，0.002，0.0002，0.00002，0.000002mM，稀釋好的鉛溶液室溫放置30min，再與稀釋到一定倍數(shù)的融合孔上清等體積混勻室溫反應(yīng)45分鐘后，50μl/孔加入到酶聯(lián)板上，37℃1小時(shí)；洗滌PBST洗滌6次；加酶標(biāo)二抗PBS溶液1000倍稀釋HRP-羊抗鼠抗體(華美公司)，50μl/孔，37℃1小時(shí)；洗滌PBST洗滌6次顯色新鮮配置的四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘終止反應(yīng)加2M的硫酸，25μl/孔酶聯(lián)儀(Thermo Co.)上450nm處讀數(shù)，空白基質(zhì)作陽(yáng)性對(duì)照吸光值Bo，待測(cè)樣品吸光值B并計(jì)算抑制率，通過(guò)數(shù)據(jù)處理計(jì)算Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]，抗體的IC50＝2.67±0.034mM，結(jié)果表明，制備的抗體對(duì)鉛具有很好的識(shí)別作用，可用于研制鉛免疫速測(cè)試劑盒。
實(shí)施例2自來(lái)水樣品中檢測(cè)鉛殘留量牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb稀釋成0.5μg/ml包被微量分析板，陽(yáng)性孔上清稀釋10倍作為工作濃度，1％明膠作封閉物，抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)(HBS)含1mM DTPA pH值為5.0、離子強(qiáng)度為0mol/L，微量分析板中每孔50μl；
待測(cè)樣品準(zhǔn)備自來(lái)水樣品量取三份自來(lái)水(實(shí)驗(yàn)室)400μl，分別加入1000μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.801μl至三份水樣中，配制成0.04mM的液體樣品；采用鉛ELISA檢測(cè)方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè)，操作如下1)包被牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 0.95μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，4℃冰箱過(guò)夜或37℃放置2小時(shí)，PBST洗滌5次并倒置、在吸水紙上拍干；2)封閉1％明膠作封閉物，微量分析板每孔100μl，37℃反應(yīng)1.5小時(shí)，倒凈，PBST洗滌5次并倒置、在吸水紙上拍干；3)加抗體及抗體與待測(cè)樣品的混合液液體樣品與反應(yīng)基質(zhì)等體積混勻成待測(cè)液，稀釋10倍的鉛抗體上清與待測(cè)液等體積充分混合，以每孔50μl加到微量分析板中，37℃反應(yīng)1小時(shí)，倒凈，PBST洗滌6次并倒置、在吸水紙上拍干；4)加酶標(biāo)二抗用pH7.4、0.15mol/L的PBS緩沖液液將商品化的HRP-羊抗鼠抗體稀釋1000倍，50μl/孔，37℃反應(yīng)1小時(shí)，倒凈，PBST洗滌8次并倒置、在吸水紙上拍干；5)顯色四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘；6)終止反應(yīng)并讀數(shù)加2M的硫酸，25μl/孔終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀上450nm處讀出吸光值，空白基質(zhì)作陽(yáng)性對(duì)照，Bo＝0.932，待測(cè)樣品吸光值B＝0.463。
7)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出結(jié)合率B/Bo＝49.7％，代入公式1Logit(B/Bo)＝Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1得到Logit(B/Bo)＝0.012代入如下檢測(cè)方程Logit(B/Bo)＝-1.0434LogC-2.6768 公式2其中C為微量分析板孔中測(cè)得的速滅威濃度，求得C＝0.00263mM。待測(cè)樣品中鉛殘留量為0.00263mM。
權(quán)利要求
1.鉛單克隆抗體的制備方法，包括1)抗原制備稱(chēng)取血藍(lán)蛋白15mg溶于2ml 10mM，pH 7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液中形成7.5mg/ml血藍(lán)蛋白溶液；稱(chēng)取雙功能金屬螯合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸8mg溶于0.8ml超純水形成金屬螯合劑溶液；將0.8ml金屬螯合劑溶液攪拌下逐滴滴加到2ml 7.5mg/ml血藍(lán)蛋白溶液中，隨后滴加0.2ml 20mM戊二醛室溫下攪拌24hr；反應(yīng)產(chǎn)物用30Kd的超濾管純化，超濾管預(yù)先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超純水充分沖洗后，超濾管內(nèi)加入反應(yīng)產(chǎn)物超濾，超濾管內(nèi)用10mM，pH 7.4N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液5次除去其中未反應(yīng)的小分子金屬螯合劑，所得產(chǎn)物即為純化的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸；30mg牛血清白蛋白溶于6ml pH為7.4、10mM的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液，稱(chēng)取18mg對(duì)氨基苯-二乙三胺五乙酸溶于1.8ml超純水中，取6ml含量為5mg/ml的牛血清白蛋白逐滴滴加到1.8ml的對(duì)氨基苯-二乙三胺五乙酸溶液中，同時(shí)加入5ml濃度為20mM的戊二醛溶液，室溫下攪拌24hr；反應(yīng)產(chǎn)物用上述30Kd的超濾管方法進(jìn)行純化除去其中未反應(yīng)的小分子金屬螯合劑，所得產(chǎn)物即為純化的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液，將牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液等分成兩份，一份直接用作包被抗原，一份用于下面的反應(yīng)；稱(chēng)取43.8mg含量為99.999％的鉛顆粒溶于1ml優(yōu)級(jí)6M硝酸中，形成212.6mM硝酸鉛溶液；取99μl硝酸鉛溶液攪拌下分別逐滴滴加到純化過(guò)的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸中，用0.5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，室溫下反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)產(chǎn)物用上述30Kd的超濾管方法進(jìn)行純化去除未反應(yīng)的金屬離子，純化后的產(chǎn)物分別為血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb以所含蛋白進(jìn)行計(jì)量為15mg鉛的人工抗原含量的溶液，以血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作免疫原，以牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作為包被抗原；2)小鼠免疫將制備好的血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作為免疫原免疫6-8周齡雌性BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，前兩次免疫間隔3周采用由等體積的抗原和佛氏完全佐劑乳化，腹腔注射，以后三次免疫間隔2周用等體積的佛氏不完全佐劑和免疫原乳化；從第四次開(kāi)始，每次免疫后一周，鼠尾靜脈采血用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體的特異性，分別用相同濃度的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶聯(lián)微量分析板，4℃過(guò)夜或37℃放置2小時(shí)；用含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；加入相同數(shù)量的血清37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；磷酸鹽緩沖液溶液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘；加25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀上測(cè)450nm處吸光值，并計(jì)算差異％，差異％＝{牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb的吸光值-牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值}/牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值×100％；3)細(xì)胞融合通過(guò)差異率篩選BalB/c鼠，差異率超過(guò)50％的BalB/c鼠用N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸緩沖液稀釋血藍(lán)蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb直接免疫，三天后取脾臟，脾細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-14天后，通過(guò)檢測(cè)融合孔上清篩選雜交瘤細(xì)胞；4)雜交瘤篩選融合孔上清用上述篩選小鼠的間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行初步篩選，用相同濃度的牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶聯(lián)微量分析板上，4℃放置過(guò)夜；用含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；加入相同數(shù)量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔調(diào)零，用SP2/0的上清作陰性對(duì)照，37℃1小時(shí)，含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；加入磷酸鹽緩沖液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；含0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘；加25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀測(cè)450nm處吸光值，用血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb包被的成陽(yáng)性而用牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸包被的孔的接近SP2/0的融合孔即為陽(yáng)性孔；由于鉛離子是小分子不具有免疫原性，單獨(dú)的金屬離子也足以形成抗原表位，作必須借助螯合劑二乙三胺五乙酸形成半抗原與抗體反應(yīng)，為了進(jìn)一步確定得到陽(yáng)性孔所分泌抗體是針對(duì)金屬鉛而不與二乙三胺五乙酸反應(yīng)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)一步確定抗體的特異性，用牛血清白蛋白-對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜，0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋明膠至1％，100μl/孔，37℃1.5小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；各種濃度1，2，5，10，20，50mM二乙三胺五乙酸溶液與等體積的融合孔上清充分混勻室溫反應(yīng)45分鐘，50μl/孔加入到酶聯(lián)板上，37℃1小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；磷酸鹽緩沖液溶液1000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，50μl/孔，37℃1小時(shí)；0.5％土溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌6次；四甲基聯(lián)苯胺50μl/孔，37℃顯色10分鐘，加入25μl/孔的2M硫酸終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀上450nm處讀數(shù)，用不加乙二胺四乙酸的孔作陽(yáng)性對(duì)照吸光值A(chǔ)0，加乙二胺四乙酸孔的吸光值A(chǔ)，若A＝A0，則A對(duì)應(yīng)的加乙二胺四乙酸的濃度則為乙二胺四乙酸的最佳濃度，且所選乙二胺四乙酸濃度必須大于金屬離子的最大濃度。
全文摘要
本發(fā)明是重金屬鉛單克隆抗體的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專(zhuān)用于特異性識(shí)別重金屬鉛的單克隆抗體的制備。重金屬鉛離子與載體蛋白通過(guò)雙功能金屬螯合劑對(duì)氨基苯基－二乙三胺五乙酸偶聯(lián)獲得完全抗原，經(jīng)免疫Balb/C鼠，脾細(xì)胞和Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得了穩(wěn)定的分泌特異性強(qiáng)的抗鉛單克隆抗體，該抗體只針對(duì)Pb－DTPA有抑制，而不與DTPA起反應(yīng)。本發(fā)明抗原實(shí)用性強(qiáng)，抗原和抗體穩(wěn)定性好。抗原制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行抗原的整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需要特別的儀器設(shè)備，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/18GK101041696SQ20071002047
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 朱曉霞 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)