專利名稱：純化彈性蛋白酶的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物蛋白酶藥品技術(shù)領域，具體涉及一種純化彈性蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
彈性蛋白酶又稱胰肽酶E，易溶于水和稀鹽溶液，廣泛存在于哺乳動物的胰臟中，在某些微生物(如綠膿桿菌等)和一些植物中也存在少量的彈性蛋白酶。彈性蛋白酶對動脈壁中的彈性蛋白是一種肽鏈內(nèi)切酶，具有專一的水解作用，能水解彈性蛋白、膠原蛋白和糖蛋白等，增強脂蛋白酯酶活性，阻止膽固醇在體內(nèi)合成并促進其轉(zhuǎn)化為膽酸，降低血漿膽固醇、LDL、VLDL和三酰甘油，升高HDL，阻止脂質(zhì)向動脈壁沉積，分解陳舊的彈性蛋白并促進新的彈性蛋白合成，維持血管彈性，抑制腎小球基底膜肥厚，降低腎臟微量蛋白的排泄。臨床上常用于治療或預防II型和IV型高脂血癥(尤其適用于II型)、動脈粥樣硬化、脂肪肝、糖尿病性腎病變和心絞痛等。
已有技術(shù)中一般采用丙酮沉淀等工藝來制備彈性蛋白酶，具體步驟如下①獲得彈性蛋白酶的提取液絞碎新鮮或冷凍的胰臟后，采用丙酮沉淀法得到彈性蛋白酶的提取液；②吸附于樹脂將步驟①所得的彈性蛋白酶的提取液用蒸餾水稀釋至合適的濃度后，吸附于用pH值為4.5且濃度為0.1M/L的乙酸銨緩沖液平衡過的Diaion Wklos弱酸性樹脂層析柱上，而且吸附于樹脂層析柱后用蒸餾水洗滌樹脂層析柱至洗滌液無色；③洗脫用pH值為7.5且濃度為1M/L的乙酸銨緩沖液洗脫步驟②中經(jīng)過洗滌的樹脂層析柱，分步收集洗脫液；④沉淀干燥洗脫液用丙酮沉淀步驟③中所得洗脫液生成沉淀物，干燥沉淀物得到粉狀彈性蛋白酶。
采用上述方法來獲得彈性蛋白酶，不但操作煩瑣，污染環(huán)境，而且重金屬含量較高且有的還超標，產(chǎn)品質(zhì)量也得不到保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述問題，提供一種能夠去除彈性蛋白酶中的重金屬的純化彈性蛋白酶的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟①攪拌下將胰臟粉投入到純化水中得到混合液，調(diào)節(jié)其pH值為3.0至6.0；②將步驟①得到的混合液靜置分層或離心分離得到上清液、或過濾得到濾液，對所得到的上清液或濾液用超濾膜進行超濾，再用洗滌液對超濾后留下的液體進行洗滌、同時用超濾膜進行超濾，得到濃縮液；當濃縮液的導電率≤3000μs/cm、pH值為4.0至6.0時結(jié)束洗滌和超濾；③將步驟②得到的濃縮液通過平衡液平衡過的樹脂層析柱，并保留在樹脂層析柱上而上柱；④對上柱后的樹脂層析柱用洗滌液分步洗滌，同時分布收集流過樹脂層析柱的洗滌液，將所收集的流過樹脂層析柱的洗滌液稀釋后的樣品(稀釋的目的在于使液體的濃度達到光度計能讀出的范圍，通常稀釋5～15倍)，用分光光度計發(fā)出波長為280nm的光波對其進行檢測，當分光光度計的讀數(shù)≤0.8時結(jié)束洗滌；⑤對步驟④的用洗滌液洗滌后的樹脂層析柱用洗脫液進行洗脫，同時收集流過樹脂層析柱的洗脫液；⑥將步驟⑤的流過樹脂層析柱的洗脫液用除菌膜除菌過濾，得到除菌過濾液；⑦對除菌過濾液用超濾膜進行超濾，再用純化水對超濾后留下的液體進行洗滌、同時用超濾膜進行超濾，得到濃縮的除菌過濾液；當濃縮的除菌過濾液的導電率≤3000μs/cm時結(jié)束洗滌和超濾；⑧將步驟⑦得到的濃縮的除菌過濾液冷凍干燥，即得到粉狀彈性蛋白酶。
上述步驟①中所述的胰臟粉為豬胰臟粉，且其與純化水按質(zhì)量比為1∶10至1∶30的比例相互混合。
上述步驟①中調(diào)節(jié)所述混合液pH值所用的試劑為無機酸或無機堿。
上述步驟②和步驟⑦中所述的超濾膜的截留分子量均為3000～10000道爾頓。
上述步驟③中所述的樹脂層析柱中的樹脂為陽離子交換樹脂，優(yōu)選CM-纖維素。
上述步驟③所述的平衡液是pH值為5至7、濃度為0.01～0.05M/L的乙酸銨溶液或其它緩沖液。
上述步驟⑤中所述的洗脫液的pH值和/或濃度大于步驟③中所述的平衡液。
上述步驟⑤中所述的洗脫液是pH值為7至9、濃度為0.5～0.7M/L的乙酸銨溶液或濃度為0.01～0.05M/L其它緩沖液。
上述步驟⑥中所述的除菌膜的孔徑為0.22μm。
上述步驟⑧還包括將所述濃縮的除菌過濾液在冷凍干燥前按5～40克/百萬單位彈性蛋白酶的量加入賦型劑。所述的賦型劑為右旋糖酐、甘露醇或蔗糖。
本發(fā)明的積極效果(1)采用本發(fā)明的純化方法后，彈性蛋白酶的重金屬含量≤25ppm符合標準，而且產(chǎn)品的收率≥15萬單位/kg胰臟粉。(2)本發(fā)明的方法不采用有機溶劑，沒有污染，操作簡便，成本低廉，產(chǎn)品外觀美觀。
具體實施例方式
(實施例1)①將2kg的市售豬胰臟粉攪拌溶解在50kg純化水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)其pH值至4.0，繼續(xù)攪拌2小時得到混合液；②靜置步驟①所得的混合液，使其分層并收集上清液；用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜超濾濃縮上述上清液，再用0.01M/L的乙酸銨溶液超濾洗滌，直至溶液電導率至2000μs/cm為止，得到濃縮液1L。
③將步驟②得到的濃縮液流入樹脂層析柱中，并保留在樹脂層析柱上而上柱。本實施例的樹脂層析柱中的樹脂為CM纖維素，使用前先用pH值為5.5、濃度為0.05M/L的乙酸銨溶液平衡。
④上柱完畢后，用平衡液以與濃縮液流入樹脂層析柱相同的流速洗滌所述樹脂層析柱，并分步收集洗滌液，直至分步所收集的洗滌液稀釋10倍后的樣品在波長為280nm下的分光光度計的讀數(shù)小于0.8。
⑤洗滌完畢后，用pH值為8、濃度為0.6M/L的乙酸銨溶液洗脫上述樹脂層析柱，并收集洗脫液。
⑥將步驟⑤中所得的洗脫液用孔徑為0.22μm的除菌膜除菌過濾，得到除菌過濾液。
⑦除菌過濾液用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜濃縮，并用純化水洗滌至溶液的電導率為2000μs/cm，得到濃縮的除菌過濾液。
⑧按10克/百萬單位彈性蛋白酶的量向步驟⑦所得濃縮的除菌過濾液中加入右旋糖酐，真空冷凍干燥即得粉狀彈性蛋白酶。
經(jīng)測定，本實施例得到的彈性蛋白酶的重金屬含量≤25ppm，產(chǎn)品的收率≥15萬單位/kg胰臟粉。
(實施例2)①將2kg的市售豬胰臟粉攪拌溶解在60kg純化水中，用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至3.0，繼續(xù)攪拌2小時得到混合液；②離心步驟①所得的混合液，使其分層并收集上清夜；用截留分子量為3000道爾頓的超濾膜超濾濃縮上述上清液，再用純化水超濾洗滌，直至溶液電導率至3000μs/cm為止，得到濃縮液1L。
③將步驟②得到的濃縮液流入樹脂層析柱中，并保留在樹脂層析柱上而上柱。本實施例的樹脂層析柱中的樹脂為CM纖維素，使用前先用pH值為7、濃度為0.05M/L的乙酸銨溶液平衡。
④上柱完畢后，用平衡液以與濃縮液流入樹脂層析柱相同的流速洗滌所述樹脂層析柱，并分步收集洗滌液，直至分步所收集的洗滌液稀釋5倍后的樣品在波長為280nm下的分光光度計的讀數(shù)小于0.8。
⑤洗滌完畢后，用pH值為9、濃度為0.5M/L的乙酸銨溶液洗脫上述樹脂層析柱，并收集洗脫液。
⑥將步驟⑤中所得的洗脫液用孔徑為0.22μm的除菌膜除菌過濾，得到除菌過濾液。
⑦除菌過濾液用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜濃縮，并用純化水洗滌至溶液的電導率為2500μs/cm，得到濃縮的除菌過濾液。
⑧按10克/百萬單位彈性蛋白酶的量向步驟⑦所得濃縮的除菌過濾液中加入甘露醇，真空冷凍干燥即得粉狀彈性蛋白酶。
經(jīng)測定，本實施例得到的彈性蛋白酶的重金屬含量≤25ppm，產(chǎn)品的收率≥15萬單位/kg胰臟粉。
(實施例3)①將2kg的市售豬胰臟粉攪拌溶解在20kg純化水中，用氨水調(diào)節(jié)其pH值至6.0，繼續(xù)攪拌2小時得到混合液；②用濾布過濾步驟①所得的混合液，收集濾液；用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜超濾濃縮上述濾液，再用純化水超濾洗滌，直至溶液電導率至1600μs/cm為止，得到濃縮液1L。
③將步驟②得到的濃縮液流入樹脂層析柱中，并保留在樹脂層析柱上而上柱。本實施例的樹脂層析柱中的樹脂為CM纖維素，使用前先用pH值為7、濃度為0.05M/L的乙酸銨溶液平衡。
④上柱完畢后，用平衡液以與濃縮液流入樹脂層析柱相同的流速洗滌所述樹脂層析柱，并分步收集洗滌液，直至分步所收集的洗滌液稀釋15倍后的樣品在波長為280nm下的分光光度計的讀數(shù)小于0.8。
⑤洗滌完畢后，用pH值為7、濃度為0.7M/L的乙酸銨溶液洗脫上述樹脂層析柱，并收集洗脫液。
⑥將步驟⑤中所得的洗脫液用孔徑為0.22μm的除菌膜除菌過濾，得到除菌過濾液。
⑦除菌過濾液用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜濃縮，并用純化水洗滌至溶液的電導率為2500μs/cm，得到濃縮的除菌過濾液。
⑧按10克/百萬單位彈性蛋白酶的量向步驟⑦所得濃縮的除菌過濾液中加入蔗糖，真空冷凍干燥即得粉狀彈性蛋白酶。
經(jīng)測定，本實施例得到彈性蛋白酶的重金屬含量≤25ppm，產(chǎn)品的收率≥15萬單位/kg胰臟粉。
顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種純化彈性蛋白酶的方法，具有以下步驟①攪拌下將胰臟粉投入到純化水中得到混合液，調(diào)節(jié)其pH值為3.0至6.0；②將步驟①得到的混合液靜置分層或離心分離得到上清液、或過濾得到濾液，對所得到的上清液或濾液用超濾膜進行超濾，再用洗滌液對超濾后留下的液體進行洗滌、同時用超濾膜進行超濾，得到濃縮液；當濃縮液的導電率≤3000μs/cm、pH值為4.0至6.0時結(jié)束洗滌和超濾；③將步驟②得到的濃縮液通過平衡液平衡過的樹脂層析柱，并保留在樹脂層析柱上而上柱；④對上柱后的樹脂層析柱用洗滌液分步洗滌，同時分布收集流過樹脂層析柱的洗滌液，將所收集的流過樹脂層析柱的洗滌液稀釋后的樣品，用分光光度計發(fā)出波長為280nm的光波對其進行檢測，當分光光度計的讀數(shù)≤0.8時結(jié)束洗滌；⑤對步驟④的用洗滌液洗滌后的樹脂層析柱用洗脫液進行洗脫，同時收集流過樹脂層析柱的洗脫液；⑥將步驟⑤的流過樹脂層析柱的洗脫液用除菌膜除菌過濾，得到除菌過濾液；⑦對除菌過濾液用超濾膜進行超濾，再用純化水對超濾后留下的液體進行洗滌、同時用超濾膜進行超濾，得到濃縮的除菌過濾液；當濃縮的除菌過濾液的導電率≤3000μs/cm時結(jié)束洗滌和超濾；⑧將步驟⑦得到的濃縮的除菌過濾液冷凍干燥，即得到粉狀彈性蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟①中所述的胰臟粉為豬胰臟粉，且其與純化水按質(zhì)量比為1∶10至1∶30的比例相互混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟①中調(diào)節(jié)所述混合液pH值所用的試劑為無機酸或無機堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟②和步驟⑦中所述的超濾膜的截留分子量均為3000～10000道爾頓。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟③中所述的樹脂層析柱中的樹脂為陽離子交換樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于所述陽離子交換樹脂為CM-纖維素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟③所述的平衡液是pH值為5至7、濃度為0.01～0.05M/L的乙酸銨溶液或其它緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑤中所述的洗脫液的pH值和/或濃度大于步驟③中所述的平衡液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑤中所述的洗脫液是pH值為7至9、濃度為0.5～0.7M/L的乙酸銨溶液或濃度為0.01～0.05M/L其它緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑥中所述的除菌膜的孔徑為0.22μm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑧還包括將所述濃縮的除菌過濾液在冷凍干燥前按5～40克/百萬單位彈性蛋白酶的量加入賦型劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的純化彈性蛋白酶的方法，其特征在于所述的賦型劑為右旋糖酐、甘露醇或蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化彈性蛋白酶的方法，包括以下步驟①攪拌下將胰臟粉投入到純化水中得到混合液；②將混合液靜置分層或離心分離得到上清液、或過濾得到濾液，對上清液或濾液進行超濾，再對超濾后的液體進行洗滌、再超濾，得到濃縮液；③將濃縮液通過樹脂層析柱而上柱；④對樹脂層析柱分步洗滌，分布收集洗滌液；⑤對樹脂層析柱進行洗脫，收集洗脫液；⑥將洗脫液除菌過濾，得到除菌過濾液；⑦對除菌過濾液進行超濾，再對超濾后的液體進行洗滌、再超濾，得到濃縮的除菌過濾液；⑧將濃縮的除菌過濾液冷凍干燥，即得。采用本發(fā)明的純化方法后，彈性蛋白酶的重金屬含量≤25ppm符合標準，而且產(chǎn)品的收率≥15萬單位/kg胰臟粉。
文檔編號C12N9/66GK101058806SQ200710020819
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日
發(fā)明者張寒春, 蔣文群 申請人:常州千紅生化制藥有限公司