專利名稱:一種利用草莓花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫毒快繁的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明“一種利用草莓花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫毒快繁的方法”屬于農(nóng)作物快繁技術(shù)領(lǐng)域,專用于草莓的脫毒快繁。
背景技術(shù):
草莓(Fragaria ananassa.Duch)是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本植物,2n=8x=56,屬于多倍體植物。草莓果實(shí)為小漿果,鮮艷亮麗,柔軟多汁,酸甜適中,芳香濃郁,是世界上七大水果之一。由于栽培草莓具有結(jié)果期長、植株小、繁殖快、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn),特別是配以大棚栽培,為冬春季的果品市場增添花色品種,尤其是在元旦、春節(jié)等重大節(jié)日供應(yīng)市場,因而深受生產(chǎn)者和消費(fèi)者的喜愛很有推廣意思和發(fā)展的潛力。
但草莓在生產(chǎn)過程中易感染病毒,從而造成草莓品種的種性退化。因此,無性繁殖數(shù)量越大,病毒傳播也越快。草莓感染病毒后易出現(xiàn)葉片皺縮、果實(shí)畸形、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量下降、植株生長緩慢等退化現(xiàn)象。病毒是引起草莓產(chǎn)量下降的一個重要因素。
本方法通過花藥培養(yǎng)的方法獲得草莓再生植株,建立一種方便實(shí)用、脫毒效果好、繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性好的草莓脫毒快繁體系,從而促進(jìn)草莓脫毒技術(shù)在生產(chǎn)上進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對目前草莓在我國的栽培面積和范圍逐年增加,因病毒侵染造成的減產(chǎn)和品質(zhì)下降的問題日漸突出的現(xiàn)狀,提出一種通過草莓花藥培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)脫毒快繁的方法。
技術(shù)方案一種利用草莓花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫毒快繁的方法,其特征在于(1)消毒處理取長度為4-6mm的草莓花蕾,在4℃冰箱冷處理72h;然后將花蕾用無菌水沖洗一次在70%酒精浸泡5s之后再用無菌水沖洗一次置于加體積比為0.1%的吐溫和質(zhì)量體積比為0.1%的升汞溶液中浸泡8min;最后用無菌水沖洗8-10次,用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水;(2)愈傷組織誘導(dǎo)分化將消毒處理好的花蕾剝?nèi)』ㄋ?,接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30~60d;
將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1的分化培養(yǎng)基中70~90d;然后將分化培養(yǎng)基中獲得的草莓苗轉(zhuǎn)接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的繼代培養(yǎng)基上,進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)20~30d;(3)生根移栽草莓苗轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根處理20~30d;苗木生根后,將生根植株經(jīng)過室外自然條件下鍛煉7-10d,移栽時開蓋加水鍛煉1-2d,以蛭石和珍珠巖混合體系作為移栽基質(zhì),移栽時的溫度控制在20-25℃范圍。
有益效果本發(fā)明針對草莓脫毒技術(shù)目前在生產(chǎn)上存在的問題,在前人研究的基礎(chǔ)上,首次建立了一種方便實(shí)用、脫毒效果好、繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性好的草莓脫毒快繁體系。草莓花藥培養(yǎng)在國內(nèi)已經(jīng)有不少報道,但是如何獲得很高的再生率,一直以來是一個比較難以解決的問題。
本發(fā)明方法將草莓花藥培養(yǎng)分化率提高到37.5%,現(xiàn)有技術(shù)提高了28.03個百分點(diǎn),突破了傳統(tǒng)分化率很低的困境。苗木生根后,移栽成活率達(dá)到90%??勺鳛樯虡I(yè)用途的草莓脫毒方法在生產(chǎn)上直接使用,從而促進(jìn)草莓脫毒技術(shù)在生產(chǎn)上進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。
四
圖1低溫處理不同時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響圖2雪蜜分化不定芽圖片五具體實(shí)施方式
(一)最佳處理參數(shù)的確定1確定最佳花蕾的前期處理以及消毒方法的確定1.1最佳方法確定的材料和方法取自田間健壯草莓花蕾,發(fā)育時期為單核靠邊期(大小約為4-6mm),在4℃冰箱冷處理0h、48h、72h、96h。冷處理結(jié)束后取出,在超凈臺上進(jìn)行消毒處理。
消毒時間及步驟為花蕾用無菌水沖洗一次在70%酒精浸泡5、10s之后再用無菌水沖洗一次置于0.1%升汞(加吐溫)浸泡5、8、12min最后用無菌水沖洗8-10次(10min),具體處理組合(表1)。消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水,將消毒處理好的花蕾剝?nèi)』ㄋ?,接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1培養(yǎng)基,30d統(tǒng)計(jì)污染率以及誘導(dǎo)率。
表1 草莓花蕾不同消毒處理
1.2低溫處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響從田間取來的健壯草莓植株花蕾,去除表面雜質(zhì),將一部分置于4℃冰箱,進(jìn)行低溫處理,處理時間分別為48h、72h、96h。剩余部分不經(jīng)過低溫處理直接接種到6號培養(yǎng)基中?;ɡ僭诘蜏靥幚?2h時花冠開始松動,但是經(jīng)過檢測小孢子發(fā)育時期還處于單核靠邊期。由圖1可以看出,所設(shè)置的四個處理中,低溫處理96h后,大部分花冠松開,不能用于接種。其他三個處理均能誘導(dǎo)出愈傷組織,低溫處理72h的花藥,在培養(yǎng)10d時雪蜜(錢亞明,王壯偉,蘇家樂,趙密珍.草莓新品種雪蜜與豐香的設(shè)施栽培試驗(yàn).落葉果樹,2004(6)20)3.7%開始分裂出愈傷組織。而低溫處理48h在接種后10d時雪蜜1.8%產(chǎn)生了愈傷組織。但是不經(jīng)過低溫處理直接接種的花藥從接種后的15d時雪蜜4.9%產(chǎn)生愈傷組織。因此經(jīng)過一定的低溫處理有利于花藥發(fā)育的啟動,縮短愈傷組織開始分裂的時間。所以,本研究選擇接種前花蕾低溫處理72h。
1.3消毒方法對愈傷組織誘導(dǎo)的影響本試驗(yàn)選取的消毒組合,在愈傷組織誘導(dǎo)過程中,花藥污染率控制在20%左右。表2結(jié)果表明,隨酒精和升汞消毒時間增長,污染率呈下降趨勢。由于花藥包在花蕾中,而所取得試材控制花蕾在單核靠邊期,其發(fā)育時間處于花瓣還被花萼包著,其雜菌的含量相對較低,若是消毒時間太長,對花藥的傷害也較大。將消毒處理過的花藥接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,統(tǒng)計(jì)消毒時間對誘導(dǎo)率的影響結(jié)果,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)率隨消毒時間增長而呈下降趨勢。經(jīng)過6個組合統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來看,隨著酒精消毒時間延長,污染率降低,但是愈傷組織也隨之下降,所以在酒精進(jìn)行表面消毒使用時間的選擇上,確定為5s,而升汞消毒時間在8min,污染率控制在14%左右,而誘導(dǎo)率雪蜜在41.7%。綜合考慮選擇該組合進(jìn)行消毒處理。
表2不同消毒處理對花藥污染率和愈傷組織的影響
2最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定2.1材料和方法以MS為基本培養(yǎng)基,添加6.5g·L-1的瓊脂條及不同的激素及不同濃度蔗糖(表3),pH調(diào)到5.8,高壓滅菌20min。接種后進(jìn)行暗處理,暗處理時間為7d,再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)的培養(yǎng)室培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件為溫度25℃±1℃;光照時間12h光/12h暗;光照強(qiáng)度2000Lx。
各誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)兩個重復(fù),每個重復(fù)接種三個培養(yǎng)皿,每個培養(yǎng)皿接種花藥50枚。愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)以花藥接種后30d產(chǎn)生愈傷組織的花藥個數(shù)為準(zhǔn)。
愈傷組織誘導(dǎo)率%=產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種的花藥個數(shù)×100。
表3不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理
注由于IAA、KT高溫分解,故采取先將培養(yǎng)基高溫滅菌后,再加入IAA、KT分裝的配制方法。
2.2不同激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響本試驗(yàn)采用的以MS為基本培養(yǎng),設(shè)計(jì)9種不同激素組合配比,20d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。發(fā)現(xiàn)組合1-3培養(yǎng)基接種花藥后第二天即出現(xiàn)了褐化,而且經(jīng)過40d還未分裂出愈傷組織。而組合4-9已經(jīng)可以肉眼看到愈傷組織,而且未發(fā)生接種花藥后褐化枯死的現(xiàn)象。30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率,結(jié)果顯示當(dāng)蔗糖濃度為30g/L時,提高BA濃度而降低NAA濃度的組合4、6、9對愈傷組織形成有很好的促進(jìn)作用,愈傷組織形態(tài)上表現(xiàn)為緊密,表面黃綠色有顆粒狀,在分化階段的分化能力強(qiáng)。其中組合6誘導(dǎo)率顯著高于其他幾個組合,雪蜜有87.2%分裂成愈傷組織(表4),而且愈傷組織形態(tài)表現(xiàn)為致密、黃綠色,有利于植株的分化。雖然組合5表現(xiàn)為愈傷組織生長速度快,但質(zhì)地膨松,表面色澤暗,而后表現(xiàn)為水漬狀,沒有分化能力。因此綜合考慮選用組合6(MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1)為本研究愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素種類和濃度的配方。
2.3不同蔗糖組合對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響表4顯示,在誘導(dǎo)率方面蔗糖濃度為30g·L-1的組合4、6、8對愈傷組織的誘導(dǎo)率高于同激素組合下60g·L-1的組合5、7、9。從愈傷組織的形態(tài)上看,30g·L-1組合愈傷組織生長良好,表現(xiàn)為黃綠色,而60g·L-1蔗糖濃度組合則表現(xiàn)為后期褐色,進(jìn)而轉(zhuǎn)為水漬狀,不能分化植株。表明30g·L-1蔗糖濃度對花藥的分裂啟動,愈傷組織增殖都有很好的促進(jìn)作用。30d統(tǒng)計(jì)愈傷組織在蔗糖濃度為30g·L-1,MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)率為87.2%。因此在本試驗(yàn)中選取添加蔗糖濃度為30g·L-1。
表4不同激素組合和蔗糖組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響
注英文字母表示不同處理差異,大寫字母代表Duncan分析中差異見顯著水平(0.01),小寫字母為顯著水平(0.05)以下同。
3最佳再生培養(yǎng)基的確立3.1材料與方法將繼代2次的愈傷組織轉(zhuǎn)到以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同激素的分化培養(yǎng)基,大約70d后就分化出草莓植株(表5)。
表5不同分化培養(yǎng)基處理
注由于ZT高溫分解,故采取先將培養(yǎng)基高溫滅菌后,再加入ZT分裝的配制方法。
分化率%=分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100。
3.2不同激素對再生的影響將愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1、PH=5.8附加不同激素濃度的分化培養(yǎng)基中(表6),結(jié)果顯示,多數(shù)愈傷組織在分化培養(yǎng)基上,顏色變綠,質(zhì)地變結(jié)實(shí),愈傷組織表面呈顆粒狀。隨著培養(yǎng)時間的延長,不同分化培養(yǎng)基上的愈傷組織出現(xiàn)了不同的結(jié)果,部分愈傷組織分化出叢生不定芽(圖2);有的愈傷組織接觸培養(yǎng)基的一面容易變褐,并逐漸死亡。本實(shí)驗(yàn)表明,在同樣以基本培養(yǎng)基添加同種類激素和濃度(BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1)情況下雪蜜草莓花藥愈傷組織分化率較高,達(dá)到37.5%。花藥培養(yǎng)分化速度慢,一般在置于分化培養(yǎng)基上70d后才開始進(jìn)入分化。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,當(dāng)NAA濃度由0.5mg·L-1提高到1.0mg·L-1時,分化率均降低,可見草莓花藥植株的分化只在外源生長素濃度很低的條件下發(fā)生。生長素濃度高,雖然愈傷組織生長速度很快,但是愈傷組織外部形態(tài)會表現(xiàn)出水漬狀,并且隨時間的推移,逐漸變?yōu)楹稚焕谠偕仓甑姆只?。從試?yàn)結(jié)果看,當(dāng)其他兩個激素濃度不變,隨著玉米素濃度由1.5mg·L-1增加到2.0mg·L-1時,前三個處理雪蜜愈傷組織分化率由30.9%提高到37.5%,后三個處理雪蜜愈傷組織分化率由28.6%提高到3 1.7%,從而說明玉米素在芽分化過程中具有顯著的促進(jìn)作用。
表6不同激素濃度組合對愈傷組織分化率的影響
4最佳繼代培養(yǎng)基的確立4.1材料和方法當(dāng)分化的組培苗長至1cm左右時,小心切下接種到增殖培養(yǎng)基,增殖培養(yǎng)基選擇用MS附加BA和NAA的不同濃度對比處理(表7),增殖培養(yǎng)時,每種培養(yǎng)基設(shè)二個重復(fù),每個重復(fù)接種五瓶,每瓶繼代組培苗株數(shù)為3株,增殖培養(yǎng)過程中30d繼代1次,統(tǒng)計(jì)每組處理芽增殖數(shù)量。
表7增殖培養(yǎng)基處理
4.2繼代培養(yǎng)基的確定將誘導(dǎo)出的雪蜜草莓健壯苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上,培養(yǎng)30d后,調(diào)查芽的增殖情況,結(jié)果見表8。叢生芽的生長方式有兩種,一種是在母株的根基部產(chǎn)生愈傷組織,然后在愈傷組織上直接分化出不定芽,另外一種方式是直接在母株的一個腋芽長出新的植株。在BA濃度為0.5mg·L-1時,添加NAA會增加其增殖率,增殖系數(shù)由3.9提高到4.7。當(dāng)BA濃度增加時,分化率提高,同時玻璃化現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)。一般認(rèn)為,培養(yǎng)基中BA含量的高低,直接影響玻璃化苗的發(fā)生與否,只有細(xì)胞分裂素與生長素的合理搭配,才能達(dá)到理想的生長分化效果。本研究經(jīng)過綜合考慮,選取激素濃度BA為0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1,芽的增殖系數(shù)為4.7,與BA為0.5mg·L-1時,NAA濃度為0.0、0.05mg·L-1存在顯著差異。
表8各增殖培養(yǎng)基的增殖效果
5試管苗生根培養(yǎng)基和移栽方法的確立將繼代幾次生長健壯的草莓花藥組培苗轉(zhuǎn)接接到1/2MS(大量元素減半,其他成分不變)和1/2MS+NAA0.2g·L-1培養(yǎng)基,30d后觀察其根的生長情況。
在增殖培養(yǎng)基上的草莓苗,一般也會有大量的根長出,但是在增殖培養(yǎng)基長出的根在根基部有愈傷組織出現(xiàn),移栽后會影響其成活率,因此再生植株要轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根處理。結(jié)果表明,1/2MS培養(yǎng)基發(fā)根晚,而且在根部會產(chǎn)生大量的愈傷組織,在添加了生長素后,生根早,而且生根率高,且根部愈傷組織明顯減少。
移栽前,將生根植株經(jīng)過光照鍛煉7-10d,移栽時開蓋加水鍛煉1-2d,一般以蛭石和珍珠巖混合體系作為為移栽基質(zhì)。移栽后注意口罩保濕,移栽時的溫度控制在20-25℃范圍,移栽成活率達(dá)到90%。
(二)實(shí)施例取自田間健壯雪蜜草莓花蕾,發(fā)育時期為單核靠邊期(大小約為4-6mm),在4℃冰箱冷處理72h。冷處理結(jié)束后取出,在超凈臺上進(jìn)行消毒處理。
消毒時間及步驟為花蕾用無菌水沖洗一次在70%酒精浸泡5s之后再用無菌水沖洗一次置于0.1%升汞(加0.1%吐溫)浸泡8min最后用無菌水沖洗8-10次(10min)。消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水,將消毒處理好的花蕾剝?nèi)』ㄋ?,接種到MS+BA0.5mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+KT0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
將繼代2次(30d)的愈傷組織轉(zhuǎn)到以MS為基本培養(yǎng)基,同時添加BA1.5mg·L-1、NAA0.5mg·L-1和ZT2.0mg·L-1的分化培養(yǎng)基中,大約70d后就分化出草莓植株。本發(fā)明方法將草莓花藥培養(yǎng)分化率提高到37.5%,比現(xiàn)有技術(shù)9.47%(查中萍,柳俊,劉定富.影響草莓花藥培養(yǎng)因素的分析.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(1)24~28)提高了28.03個百分點(diǎn)。
將誘導(dǎo)出的草莓健壯苗轉(zhuǎn)接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1繼代培養(yǎng)基上,進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)2~3次。然后轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根處理。
苗木生根后,將生根植株經(jīng)過光照鍛煉7-10d,移栽時開蓋加水鍛煉1-2d,一般以蛭石和珍珠巖混合體系作為為移栽基質(zhì)。移栽后注意用塑料薄膜罩口保濕,移栽時的溫度控制在20-25℃范圍,移栽成活率達(dá)到90%。
權(quán)利要求
1.一種利用草莓花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫毒快繁的方法,其特征在于(1)消毒處理取長度為4-6mm的草莓花蕾,在4℃冰箱冷處理72h;然后將花蕾用無菌水沖洗一次在70%酒精浸泡5s(秒)之后再用無菌水沖洗一次置于加體積比為0.1%的吐溫和質(zhì)量體積比為0.1%的升汞溶液中浸泡8min(分鐘);最后用無菌水沖洗8-10次,用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水;(2)愈傷組織誘導(dǎo)分化將消毒處理好的花蕾剝?nèi)』ㄋ帲臃N到MS(QU Shen-Chun,HUANG Xiao-De,ZHANG Zhen,YAO Quan-HONG,TAO Jian-Min,QIAO Yu-Shan,ZHANG Jun-Yi.Agrobacterium-mediated transformation of Malus robusta with tomato iron transportergene[J],Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2005,31(3)235-240)+BA(6-芐氨基嘌呤)0.5mg·L-1+NAA(萘乙酸)2.0mg·L-1+KT(細(xì)胞激動素)0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30~60d(天);將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+ZT(玉米素)2.0mg·L-1+瓊脂6.5g·L-1的分化培養(yǎng)基中70~90d;然后將分化培養(yǎng)基中獲得的草莓苗轉(zhuǎn)接到MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的繼代培養(yǎng)基上,進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)20~30d;(3)生根移栽草莓苗轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA0.2g·L-1+瓊脂6.5g·L-1的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根處理20~30d;苗木生根后,將生根植株經(jīng)過室外自然條件下鍛煉7-10d,移栽時開蓋加水鍛煉1-2d,以蛭石和珍珠巖混合體系作為移栽基質(zhì),移栽時的溫度控制在20-25℃范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種利用草莓花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫毒快繁的方法”,屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。將取自田間健壯草莓花蕾,發(fā)育時期為單核靠邊期(大小約為4-6mm),在4℃冰箱冷處理72h(小時)。然后將花蕾分別用70%酒精、0.1%升汞(加吐溫)消毒之后用無菌吸水紙吸干花蕾表面的水,將消毒處理好的花蕾剝?nèi)』ㄋ?,接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,然后轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基中,再將誘導(dǎo)出的草莓健壯苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上,最后轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根處理。本方法將草莓花藥培養(yǎng)分化率提高到37.5%,比現(xiàn)有技術(shù)提高了28.03個百分點(diǎn),突破了傳統(tǒng)分化率很低的困境。苗木生根后移栽成活率90%,從而促進(jìn)草莓脫毒技術(shù)在生產(chǎn)上進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。
文檔編號C12N5/04GK101049090SQ20071002280
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者喬玉山, 渠慎春, 蔡斌華, 王三紅, 高志紅, 徐長寶, 楊曉春, 侯喜林, 吳震 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)