專利名稱：水稻葉綠素合成酶突變基因及其基因工程應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一個(gè)新的水稻葉綠素合成酶突變基因及其基因工程應(yīng)用，屬于基因 工程領(lǐng)域，具體地講涉及水稻葉綠素合成和水稻葉色發(fā)育的基因。
背景技術(shù)：
植物葉色是葉綠體中各種色素的綜合表現(xiàn)，正常葉中葉綠素占優(yōu)勢(shì)，通常表現(xiàn)為綠 色。葉色變異是高等植物中突變頻率較高且易于鑒定的突變性狀。迄今為止，在水稻、 小麥、大麥、玉米、大豆、棉花、煙草、玉米、向日葵、番茄、黃瓜、馬鈴薯、桑樹(shù)等 幾乎所有高等植物中都發(fā)現(xiàn)了葉色突變體。其突變基因直接或間接影響光合色素，特別 是葉綠素的合成和降解，導(dǎo)致各種色素的含量和比例改變，從而引起植物葉色變異。
水稻(Oy加sa/Zra L.)作為我國(guó)乃至世界最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量的提高 對(duì)解決未來(lái)全球糧食問(wèn)題具有十分重要的戰(zhàn)略意義。長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的雜交育種手段在 提高光能利用方面尚未取得令人滿意的效果。葉色突變體是研究水稻光能利用的理想材 料。目前，雖然在水稻中己得到一些黃綠葉突變體，但大多數(shù)研究?jī)H局限于基因的初步 定位。深入研究這些黃綠葉突變體的突變基因?qū)τ诟牧妓竟饽芾眯屎碗s交種制種 純度控制具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)自然變異的水稻黃綠葉突變體yg〃基因的圖位克隆和功能分析， 從分子水平揭示了引起水稻黃綠葉突變性狀的分子機(jī)理，且系統(tǒng)研究了該基因與葉綠體 形成、光合效率及相關(guān)光合指標(biāo)的關(guān)系，提出了利用C^;g//基因進(jìn)行水稻黃綠葉遺傳 改良的方法。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一個(gè)新的水稻葉綠素合成酶突變基因Oy;g/7及其基因工程 應(yīng)用，該突變基因O^g//可作為目的基因?qū)胨居N材料不育系當(dāng)中，以改變?nèi)~片 的葉色，用于水稻兩系雜交稻制種或遺傳育種。
技術(shù)方案
一種水稻葉綠素合成酶突變基因ay少g/厶它來(lái)自水稻(0^z" sa/h;fl L.)，長(zhǎng)度為1131 bp，相應(yīng)編碼葉綠素合成酶的376個(gè)氨基酸，包含第198位氨基酸的突變位點(diǎn)由脯氨酸 Pro (TCT)突變?yōu)榻z氨酸Ser (CCT)，全序列見(jiàn)SEQ ID NO.l 。
用轉(zhuǎn)基因的方法將該突變基因轉(zhuǎn)移到光敏核不育系材料中，獲得含有 基因，具有黃綠葉表型的不育系材料，可用于水稻兩系雜交稻制種。
有益效果
1、 本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻葉綠素合成酶突變基因(a^g〃基因)及其應(yīng)用。該基因來(lái)
自水稻(Oo^a^z/vaL.),可作為目的基因?qū)胨?，使葉片黃綠色，或通過(guò)雜交選 育，轉(zhuǎn)育黃綠色性狀，獲得葉色黃綠的水稻品種。檢測(cè)出連鎖標(biāo)記RM3838 (與黃綠 葉色突變體中的yg//基因的遺傳距離0.1cM)，可用于水稻雜交育種分子標(biāo)記輔助選 擇黃綠葉標(biāo)記基因yg/h
2、 本發(fā)明人提供的0^g/7基因功能是參與植物的葉綠素合成的最后一步反應(yīng)，mRNA 表達(dá)分析表明Owg/7基因在水稻中組成性表達(dá)。
3、 本發(fā)明的ay;g/7基因來(lái)自水稻，所編碼的蛋白質(zhì)具有葉綠素合成酶活性，其與高等 植物和藻類生物等具有較高的同源性，與燕麥的葉綠素合成酶ChlG、擬南芥葉綠素 合成酶G4、 S""/wcjW/j平戶CC6卵3葉綠素合成酶相似性分別為88.39%、 74.68% 和53.94%，與細(xì)菌葉綠素合成酶序列相似性降低為20 30%。其中motif
(WAGHDF-197)僅存在于高等植物的葉綠素合成酶中，細(xì)菌中缺乏這一 motif,黃 綠葉突變基因突變位點(diǎn)(Pro-198)位于該motif的末端。
4、 利用野生型OsFGi:/基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其轉(zhuǎn)化可使黃綠色葉的 水稻品種恢復(fù)正常綠色。本發(fā)明提供了 0^g/7基因的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用方法。
5、 用轉(zhuǎn)基因的方法將0^g/7基因轉(zhuǎn)移到光敏核不育系材料中，可獲得含有0^g/7基 因，具有黃綠葉表型的不育系材料，用于水稻兩系雜交稻制種。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l水稻葉綠素合成酶突變基因的分子克隆
1、突變基因^g/7位點(diǎn)的定位
利用水稻黃綠葉突變體249黃(yg/7)分別與葉色正常的不同水稻品種培矮64、 USSR5、 W002和02428等進(jìn)行正反雜交，得到的F2群體進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明yg// 的黃綠葉表型由隱性單基因控制。從;^/7突變體與培矮64衍生的f2群體(12,300株) 中，選取了 2741個(gè)黃葉隱性單株用于該突變體基因精細(xì)定位。2005年夏在中國(guó)農(nóng)業(yè)科 學(xué)院作物科學(xué)研究所網(wǎng)室種植，在3葉1心期鑒定表型，同時(shí)取樣提取DNA。從f2群 體中隨機(jī)挑出11個(gè)黃綠葉單株和34個(gè)綠葉單株，用候選標(biāo)記對(duì)這個(gè)小群體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，而后分析候選標(biāo)記與突變位點(diǎn)的連鎖關(guān)系。發(fā)現(xiàn)位于第5染色體中部的SSR標(biāo) 記引物RM516、 RM164 (RM系列引物公知公用，見(jiàn)網(wǎng)站www.gramene.org)與突變基 因連鎖。用RM516和RM164分析f2群體，把突變基因初步定位在SSR標(biāo)記RM516 和RM164之間，與RM516、 RM164分別相距4.8cM和13.1cM。選取位于RM516和
RM164之間的SSR標(biāo)記引物，對(duì)親本進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果只有SSR標(biāo)記RM3838和 RM5454 (www.gramene.org)在親本間表現(xiàn)出多態(tài)。利用這兩個(gè)標(biāo)記對(duì)整個(gè)F2群體進(jìn) 行分析，結(jié)果表明二者與突變位點(diǎn)分別相距0.0cM和&8cM。進(jìn)一步利用水稻基因組數(shù) 據(jù)設(shè)計(jì)了 23對(duì)SSR引物，編號(hào)為yl y23。結(jié)果只有yl (SEQIDN0.3， 4)、 y5 (SEQ IDN0.5， 6)和y22 (SEQIDN0.7， 8)在親本間檢測(cè)出多態(tài)性，其中，標(biāo)記yl位于 RM516和RM3838之間，標(biāo)記y5和y22位于RM3838和RM5454之間。用這幾個(gè)多態(tài) 性標(biāo)記對(duì)F2代群體2741個(gè)隱性單株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變基因(命名為， "http://ow greew /ea/7)位于yl和RM3838之間，距yl， RM3838和y22的遺傳距離分別為0.2cM、0.1cM 和0.7cM。隨后根據(jù)日本晴和9311基因組的序列信息(www.ncbi.nlm.nih.gov)，在SSR 標(biāo)記yl和RM3838之間，設(shè)計(jì)了 26對(duì)CAPS標(biāo)記，經(jīng)多態(tài)性分析，找出了7對(duì)具有多 態(tài)CAPS標(biāo)記，其中標(biāo)記P25 (SEQIDN0.19， 20)和P26 (SEQIDN0.21， 22)與應(yīng)〃 基因位點(diǎn)共分離，其它標(biāo)記P20 (SEQIDN0.15， 16)、 P5 (SEQ ID N0.9， 10)、 P23 (SEQIDN0.17， 18)、 P8 (SEQIDNO.ll， 12)和Pll (SEQIDNO.B， 14)重組交 換單株數(shù)分別為8、 8、 1、 5和5。因此，_yg/7基因位點(diǎn)被精細(xì)定位在BAC AC136221 上的標(biāo)記P23與P8之間，物理距離為llkb。
表l基于PCR基礎(chǔ)的分子標(biāo)記_
標(biāo)記類型標(biāo)記名稱 引物序列 擴(kuò)增片斷大小(bp)~限制性內(nèi)切酶
yl 5'GCGGTTGAAGGCGTCGTA3' 116
5'AGGGTGCTGAGTCACAATAGGT3' SSR標(biāo)記 y5 5'CCCCAAACTAATTTCCTCCT3' 100
5'ACATCTGTAACCAATCCTCCC3
y22 5'CTGCCCTTGAATAATGACG3' 177
5'GCGACTGATCGGTACTCCT3' P5 5'GGCTAGTTATGGGTTAGAGGGTA3 709
5'TCCCTTTTCAAATCACACGA3' P8 5'CGTGCAGGTTGTGTGACTCT3' 922
5'GTTACAGAGCCAGCCAGGAG3
Pll 5TTTGATCGCCGTCATGTTTA3' 934
CAPS標(biāo)記 5'CCGGTGGTGAAGTCGTAGAT3'
P20 5'GCAGTTATTGGAAGTCAGC3' 685
5'ATTACATCTACGTGCAAAGTC
3,
P23 5'CAACCACCTCAAGCTCTTT3' 197
5'ATATTTCCTTCCCTACCCA3' P25 5'GGAATTAGTGCCACCAAAC3' 834
5'GGGAATCAACAAGAAACGA3,
P26 5'CCTCATTTTCCTTGGAGCAG3'740 峰I
5'TCTTCGCACCTAAGGTCACA3'
利用基因分析與預(yù)測(cè)軟件(www.so他erry.com)對(duì)這llkb區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測(cè),發(fā) 現(xiàn)僅有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORFs), —個(gè)為葉綠素合成酶基因 (Chlorophyll synthetase),我們把它稱為R 丄/ (GenBank登錄號(hào)EF432576);另一個(gè) 為e/w基因(Embryogenic abscisi acid-inducible gene)。
2、 突變基因j^/的克隆
用RT-PCR的方法，引物為SEQIDN0.23, SEQIDN0.24;將野生型O^G"和突
變體目的基因區(qū)域編碼區(qū)cDNA擴(kuò)增出來(lái)，直接回收，并重復(fù)測(cè)序，然后用DNAstar 分析軟件進(jìn)行比對(duì)分析。RT-PCR擴(kuò)增程序如下:94。C 2 min, 94°C 40s， 59°C 40s， 72°C lmin, 共35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min, 4°C Pause。
序列分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增出野生型ayK 丄7基因的編碼區(qū)cDNA(簡(jiǎn)稱野生型基因， GenBank登錄號(hào)EF432576)和擴(kuò)增出突變體O^g//基因的編碼區(qū)cDNA (簡(jiǎn)稱突變基 因yg//， SEQIDNO.l),進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者之間在第8外顯子上存在單堿基差異，由 胸酰嘧啶(T-592)變成了胞嘧啶(C)，造成脯氨酸(Pro-198)到絲氨酸(Ser)突變。
脯氨酸是一種亞氨基酸，其側(cè)鏈?zhǔn)堑优ca碳連接形成的雜環(huán)結(jié)構(gòu)。盡管其亞氨 基可與其它氨基酸形成肽鍵，但側(cè)鏈限制了 a碳的自由旋轉(zhuǎn)，因此脯氨酸經(jīng)常在蛋白質(zhì) 的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件p轉(zhuǎn)角中存在；絲氨酸是側(cè)鏈不帶電荷的極性氨基酸，其側(cè)鏈可與其它 極性基團(tuán)形成氫鍵。如果葉綠素合成酶中脯氨酸突變成絲氨酸，酶的活性可能受到影響。
3、 突變基因yg/7、野生型F( Z7基因的序列信息與特性分析
野生型基因的編碼區(qū)cDNA編碼區(qū)為1131bp，編碼376個(gè)氨基酸的41kDa 蛋白，N端具有47個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，為質(zhì)體膜蛋白，該蛋白為一個(gè)新的葉綠素合 成酶，催化葉綠素酸酯(Chlorophyllide)與植醇焦磷酸(Phytyl-PP)或雙牦牛兒基焦磷 酸(Geranylgeranyl-PP)植醇化，生成葉綠素a。通過(guò)搜索水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表 明FG"為單拷貝基因，由15個(gè)外顯子，14個(gè)內(nèi)含子組成。YGL1與高等植物和藻類 生物等具有較高的同源性。與燕麥的葉綠素合成酶ChlG、擬南芥葉綠素合成酶G4、 辦"ec/wc^to印.戶CC紹ft 葉綠素合成酶相似性分別為88.39%、 74.68%和53.94%,與 細(xì)菌葉綠素合成酶序列相似性降低為20 30%。此外，序列分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)motif (WAGHDF-197)僅存在于葉綠素合成酶當(dāng)中，細(xì)菌葉綠素合成酶缺乏。
突變基因少gW在第8個(gè)外顯子上發(fā)生單堿基突變，其他的序列信息及特性與野生 型K Z/基因相同。
4、 突變基因yg/7、 TGZJ基因的表達(dá)分析
應(yīng)用定量RT-PCR方法，比較了突變基因yg/7和野生型基因yGi:7的表達(dá)水平，結(jié)果表 明，突變基因^g/7^FG"基因在根、莖、葉和穗中都表達(dá)，且在突變體和野生型之間沒(méi) 有差異。暗光處理?xiàng)l件和不同發(fā)育時(shí)期，突變體植株體內(nèi)的突變基因:^//和野生型植株 體內(nèi)K U基因的表達(dá)也沒(méi)有差異。這些結(jié)果表明yg/7基因與y( "基因組成性表達(dá)特性，
且單堿基突變并不影響觀〃基因在膽〃突變體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)。 5、脯氨酸到絲氨酸改變引起葉綠素合成酶活性下降
利用體外原核表達(dá)重組蛋白，應(yīng)用兩種底物GGPP和PhyPP，對(duì)重組酶進(jìn)行酯化活 性分析。結(jié)果表明與野生型重組酶相比(設(shè)重組酶YGL1催化底物Chlidea酯化GGPP 和PhyPP活性值為1 )，突變體重組酶ygll催化底物Chlide a酯化底物GGPP和PhyPP 的活性都下降，分別為野生型重組酶酯化活性的為35.22%和21.75%，表明ygll單個(gè)氨 基酸的改變影響酶的酯化活性。
實(shí)施例2葉綠素合成酶基因r( zj的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用試驗(yàn)及葉綠素合成酶突變基因膽/7 的功能驗(yàn)證
(一) 含有K "編碼區(qū)cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建
用Pst I和Spe I (公知公用)雙酶切潮霉素抗性表達(dá)載體pCUbi1390 (中國(guó)農(nóng)科院生物 所路鐵鋼研究員提供；中國(guó)農(nóng)科院博士論文，彭昊，2005),回收載體片段，備用；以PCR 介導(dǎo)在y( 丄7基因cDNA序列兩端分別加入Pst I/Spe I接頭(接頭引物序列為SEQ ID N0.25, 26)接入pMD18-T載體，測(cè)序確認(rèn)后，酶切、電泳并回收目的片段，并將其連接進(jìn)入上 述表達(dá)載體得到FGZ/基因重組載體。
(二) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化
以農(nóng)桿菌菌株EHA105為介導(dǎo)，將yGZJ基因重組載體導(dǎo)入具有;;g//等位基因受體 材料黃葉粳品系yg/2 (該品系是由黃綠葉突變體yg/7與武運(yùn)粳8號(hào)雜交，然后經(jīng)過(guò)3代 回交，5代自交得到的具有黃綠葉特征的黃葉粳稻品系，經(jīng)分子鑒定含有突變基因;^/7):
(1) 28"培養(yǎng)含重組K U的農(nóng)桿菌16 hr，收集菌體，并稀釋到含有l(wèi)OOpmol/L 的N6液體培養(yǎng)基中至濃度為OD6(W-0.5，獲得菌液；
(2) 將培養(yǎng)至一個(gè)月的水稻成熟胚胚性愈傷組織與上述菌液混合侵染30min，濾 紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，Sigma公司購(gòu)買)中，24'C共 培養(yǎng)3天；
(3) 將上述愈傷接種在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司購(gòu)買)的N6固體篩選 培養(yǎng)基上第一次篩選16天；
(4) 挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入200mg/L潮霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選， 每15天繼代一次；
(5) 挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入含有150mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上分化；
(6) 分化成苗的再生水稻植株即為所獲得的葉綠素合成酶基因7G"的轉(zhuǎn)基因植株。
(三) 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定及yg/7基因功能驗(yàn)證
葉綠素合成酶基因的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)PCR分子檢測(cè)、Southern blot分析、Tj
代分離實(shí)驗(yàn)及恢復(fù)表型植株葉綠素含量分析，證實(shí)了葉綠素合成酶基因yG丄j轉(zhuǎn)化成功。
其表型為轉(zhuǎn)基因前的黃綠色(yg/7基因?yàn)殡[性基因)轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)基因后的綠色CFGi^基
因?yàn)轱@性基因)。驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因前的黃葉粳品系的黃綠葉性狀是由:^/7基因控制的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，少g/7突變基因的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用方法同野生型FGZJ的轉(zhuǎn)基因應(yīng) 用。用轉(zhuǎn)基因的方法將該突變基因轉(zhuǎn)移到光敏核不育系材料中，獲得含有<9"^//基因，
具有黃綠葉表型的不育系材料，可用于水稻兩系雜交稻制種。 本發(fā)明所涉及公知公用品種如下-
水稻黃綠葉突變體249黃(yg/門(公知公用品種，龔紅兵，陳亮明，刁立平等(2001)水 稻葉綠素b減少突變體的遺傳分析及其相關(guān)特性.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，34:686-689)
培矮64 (公知公用品種，羅孝和，袁隆平(2000)水稻光親合系的選育.雜交水稻， 2000,15:1-3)
USSR5 (公知公用品種，江玲，徐俊鋒，魏祥進(jìn)等(2007)水稻品種USSR5早熟性的 遺傳分析.遺傳學(xué)報(bào)2007， 34(1): 46-55，中國(guó)農(nóng)科院種質(zhì)資源庫(kù)對(duì)外提供)
W002(公知公用品種，張堅(jiān)勇，萬(wàn)向元，肖應(yīng)輝等(2004)水稻品種食味品質(zhì)性狀穩(wěn) 定性分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2004,37(6):788-794本實(shí)驗(yàn)室對(duì)外提供)
02428 (公知公用品種，李和標(biāo)(1989)水稻光親合資源一一02428.中國(guó)種業(yè)1989， 4: 4)
序列表
〈110〉南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉水稻葉綠素合成酶0sYGLl基因及其轉(zhuǎn)基因工程應(yīng)用
<130〉說(shuō)明書(shū)
<140> 00
<141〉 2007-06-05
<歸26
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 1131 〈212〉腿
〈213〉 Oryza sativa (水稻) 〈220〉
<221> Osygll gene
<222〉 (1)..(1131) 〈223〉 〈400〉 1
atggccacctcccacctcctcgccgccgcctcctccaccgccgcctcctccgccaccttc60
cgccctcccctcctcagcctccgctccccgccgccctcttctctccgcctcaaccgcagg120
cgccacttcc鄉(xiāng)tggtccgCgCggCCgElg3ccgaca犯g鄉(xiāng)cga鄉(xiāng)ccaatgcgccc180
g卿卿ctcccgcggg鄉(xiāng)ctccagcttcaaccagctgcteggcatcaagggcgcc犯g240
C33g3g犯Cggattegcettcaacttactaagecagtgaeatggcctccg300
cttgtatggggagtgctttgtggagcagctgcctctggaaatttccactggacsgttg犯360
gatgttgcaaaatctattgtctgeatgataatgtctggtccatgtcttacaggateicELCEL420
C3gac幼tt3acgactggtatgatcgagat8t卿tgCg6Ltaaatgaaccttaccgtcct480
attccttcaggcgctatatcgtcattsctc犯3tttgggCsctgttgtta540
gc鄉(xiāng)gcttggcctgggtgctctgttagatgtatgggcaggacatgatttttctattatt600
ttttatcttgctgttggtgggtccttgctttcttacatatattcagctccacctctgaag660
CtC33gC3g3atggatggattgg朋3ttttgctcttggtgcgagctacattggcttgccc720
tggtgggctggccaggcattatttgg肌ccctteictcctgatattgttgtcctgacttct780
ttgtatagcatagctgggct3ggg3ttgCtELttgtaaeitgactttaagagtgttg鄉(xiāng)ga840
g3t3g3gCtCtggggcttcagtcactcccggUgcUUggt3tgg犯8Ctgc雄gtgg900
ateitgtgtaggage get ttgacataactcaattatccgttgcaggctaccttttcagttcc960
ggcaagccttattatgeectggcactgetaggactcacaattcctcaggtggtctttcag1020
ttccaatacttCCtC犯gg2Lccctgtgaagtatgaegteaaataccaggc幼gcgcgcaa1080
ccgttcttcgtcttgggccttctggtgaccgcccttgc幼ccagccactg1131
〈210〉 2
<211> 376 〈212> PRT
〈213〉 Oryza sativa(水稻) <220〉
<221> OsYGLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列 〈222〉 (1)..(376) 〈223〉 < 2
Met Ala Thr Ser His Leu Leu Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ala Ala Ser
15 10 15
Ser Ala Thr Phe Arg Pro Pro Leu Leu Ser Leu Arg Ser Pro Pro Pro
20 25 30
Ser Ser Leu Arg Leu Asn Arg Arg Arg His Phe Gin Val Val Arg AlaAla
Ala
65
Gin
Thr
Gly
Met
Asp 145 lie
Ala
Ala
Leu
Gly 225 Trp
Val
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Leu
Ala 305 Gly
Val
Val
Val
Glu
50
Gly
Glu
Trp
Asn
lie 130 Trp
Pro
Leu
Gly
Leu 210 Trp
Trp
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Pro 290 lie
Lys
Val
Lys
Thr 370 <210> 3 <211> <212〉 <213〉 <220> 〈221〉 <222> 〈223〉 <400〉 3
35 Thr
Gly
Asn
Pro
Phe 115 Met
Tyr
Ser
Leu
His 195 Ser
lie
Ala
Thr
Phe 275 Val
Asp
Pro
Phe
Tyr 355 Ala
Asp
Ser
Asp
Pro 100 His
Ser
Asp
Gly
Leu 180 Asp
Tyr
Gly
Gly
Ser 260 Lys
Ala
lie
Tyr
Gin 340 Gin
Leu
Lys Glu Thr 55
Ser Phe Asn 70
lie Trp Lys 85
Leu Val Trp
Trp Thr Vsl
Gly Pro Cys 135
Arg Asp lie 150
Ala lie Ser 165
Ala Gly Leu
Phe Ser lie
lie Tyr Ser 215
Asn Phe Ala
230 Gin Ala Leu 245
Leu Tyr Ser
Ser Val Glu
Phe Gly Met 295
Thr Gin Leu
310 Tyr Ala Leu 325
Phe Gin Tyr
Ala Ser Ala
Ala Thr Ser 375
40 I>ys
Gin
lie
Gly
Glu 120 Leu
Asp
Glu
Gly
lie 200 Ala
Leu
Phe
lie
Gly 280 Glu
Ser
Ala
Phe
Gin
360.
His
Ala
Leu
Arg
Val 105 Asp
Thr
Ala
Asn
Leu 185 Phe
Pro
Gly
Gly
Ala 265 Asp
Thr
Val
Leu
Leu 345 Pro
Asn
Leu
Leu
90
Leu
Val
Gly
lie
Glu 170 Gly
Tyr
Pro
Ala
Thr 250 Gly
Arg
Ala
Ala
Leu 330 Lys
Phe
Ala
Gly
75
Gin
Cys
Ala
Tyr
Asn 155 Val
Ala
Leu
Leu
Ser 235 Leu
Leu
Ala
Lys
Gly 315 Gly
Asp
Phe
Pro
60
lie
Leu
Gly
Lys
Thr 140 Glu
lie
Leu
Ala
Lys 220 Tyr
Thr
Gly
Leu
Trp 300 Tyr
Leu
Pro
Val
45 Glu
Lys
Thr
Ala
Ser 125 Gin
Pro
Thr
Leu
Val 205 Leu
lie
Pro
lie
Gly 285 lie
Leu
Thr
Val
Leu 365
Lys
Gly
Lys
Ala 110 lie
Thr
Tyr
Gin
Asp 190 Gly
Lys
Gly
Asp
Ala 270 Leu
Cys
Phe
lie
Lys 350 Gly
Ala
Ala
Pro
95
Ala
Val
lie
Arg
lie 175 Val
Gly
Gin
Leu
lie 255 lie
Gin
Val
Ser
Pro 335 Tyr
Leu
Pro
Lys
80
Val
Ser
Cys
Asn
Pro 160 Trp
Trp
Ser
Asn
Pro 240 Val
Val
Ser
Gly
Ser 320 Gin
Asp
Leu
18 DNA
人工合成
yl正向引物 (l).. (18)gcggttg83g gcgtcgta <210> 4
18
22 PRT
人工合成
yl反向引物 (l).. (22)
<211> <212〉 <213〉 <220> 〈221〉 <222〉 〈223〉 〈400〉 4
Ala Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala 15 10 15
Ala Thr Ala Gly Gly Thr 20
<210〉 5 <211> <212> <213> 〈220〉 〈221〉 <222> 〈223> 〈400〉 5
CCCC333Ct3 <210> 6
〈211〉 <212> 〈213〉 <220> <221> 〈222〉 〈223〉 〈400〉 6 acatctgtaa <210> 7 <211> <212〉 〈213〉 〈220〉 〈221> <222> 〈223〉 <400> 7 ctgcccttga <210> 8 <211〉 <212> <213> <220〉 <221> <222> <223>
20 DNA
人工合成
y5正向引物 (l).. (20)
atttcctcct
21 腿
人工合成
y5反向引物 (l).. (21)
ccaatcctcc c
19 DNA
人工合成
y22正向引物 (l).. (19)
ataatgscg
19 腿
人工合成
y22反向引物 (l).. (19)
20
21
19〈400〉 8
gcgactgatc ggtactcct <210> 9
〈211〉 23
<212> DNA
〈213>人工合成
<220>
<221> P5正向引物 <222> (l)..咖 <223> <400> 9
ggCt3gtt3t gggtt3g3gg gta
〈210〉 10 〈211> 20 〈212〉腿 <213>人工合成 <220>
〈221〉 P5反向引物 〈222〉 (l)..咖 〈223〉 〈400〉 10
tcccttttca aatcacacga 〈210〉 11 <211> 20
<212> DNA
〈213〉人工合成 〈220〉
〈221〉 P8正向引物 〈222〉 (l)..咖 〈223> 〈 11
cgtgcaggtt gtgtgactct 〈210> 12
<211> 20
〈212〉 DNA
<213〉人工合成 <220>
〈221〉 P8反向引物
〈222〉 (l)..咖 <223> 〈400〉 12
gttacagagc cagccaggag <210〉 13
〈211〉 20
<212> DNA
<213〉人工合成
<220>
〈221〉 Pll正向引物
〈222> (1)..(20)
說(shuō)明書(shū)第10/13頁(yè)
19
23
20
20
〈223〉 <400> 13
tttgatcgcc gtcatgttta 〈210〉 14
〈211〉 20
<212> DNA
<213>人工合成
<220〉
〈221> Pll反向引物 〈222〉 (1)..(20) <223〉 <揚(yáng) 14
CCggtggtg3 3gtcgtag3t 〈210〉 15
〈211> 19
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈220〉
<221〉 P20正向引物 〈222〉 (1)..(19) 〈223〉 <400> 15
gcagttattg gaagtcagc <210> 16
〈211〉 21
<212〉腿
<213>人工合成
<220>
<221〉 P20反向引物 <222〉 (l)..加 <223> <400> 16
attacatcta cgtgcaaagt c <210> 17
<211> 19
<212〉 DNA
〈213>人工合成
<220>
<221> P23正向引物 <222> (1)..(19) <223> <德 17
caaccacctc aagctcttt <210> 18
〈211〉 19
<212> 賺
<213>人工合成
<220>
<221> P23反向引物 <222> (1)..(19) <223> <400> 18
說(shuō)明書(shū)第11/13頁(yè)
20
20
19
21
13
atatttcctt ccctaccca 19 <210〉 19
<211> 19
<212〉 DNA
<213〉人工合成
<220>
<221〉 P25正向引物 <222〉 (1).. (19) <223> <400> 19
gg33tt3gtg CC3CC幼aC 19
<210> 20 <211〉 19 〈212〉 DNA <213>人工合成 <220>
<221〉 P25反向引物 <222> (1)..(19) <223〉 <400> 20
gggaatcaeic aageiaacggi 19 <210> 21
<211> 20
<212〉 DNA
<213>人工合成
<220>
<221〉 P26正向引物 <222〉 (1)..(20) <223> <德21
cctcattttc cttggagcag 20 〈210〉 22
<211〉 20
<212〉 DNA
<213>人工合成
<220〉
<221> P26反向引物 〈222> (l)..咖 <223〉 <400> 22
tcttcgcacc taaggtC3C3 20 <210> 23
<211〉 19
<212> DNA
<213>人工合成
<220〉
〈221〉 RT-PCR擴(kuò)增0sYGLl與Osygll編碼區(qū)cDNA的正向引物 <222> (1〉..(19) <223〉 <400> 23
cagtctccaa tggccacct 19 〈210〉 24 <211> 20
<212〉 DNA <213〉人工合成 <220>
〈221〉 RT-PCR擴(kuò)增0sYGLl與Osygll編碼區(qū)cDNA的反向引物
〈222> (l)..咖 <223> 簡(jiǎn)〉24
tgctttcatc agtggctggt 20 <210> 25
<211〉 27
<212〉 醒
<213〉人工合成
<220>
<221>接頭正向引物
<222> (1)..(27) <223> 〈衡25
aactgcagag tctccaatgg ccacctc 27 〈210> 26
〈211〉 28
<212〉腿
<213>人工合成
〈220〉
〈221〉接頭反向引物
<222> (1)..(28) <223〉 〈400〉 26
ggactagtgc tttcatcagt ggctggtt 28
權(quán)利要求
1.一種水稻葉綠素合成酶突變基因Osygl1，它來(lái)自水稻(Oryza sativa)，長(zhǎng)度為1131bp，相應(yīng)編碼葉綠素合成酶的376個(gè)氨基酸，包含水稻葉綠素合成酶基因OsYGL1的第198位氨基酸的突變位點(diǎn)由脯氨酸Pro(CCT)突變?yōu)榻z氨酸Ser(TCT)，全序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。
2. 權(quán)利要求1所述一種水稻葉綠素合成酶突變基因的基因工程應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)水稻葉綠素合成酶突變基因Osygl1的核苷酸序列及基因工程應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。Osygl1的cDNA序列SEQ ID NO.1及編碼的氨基酸序列SEQ IDNO.2?；騉sYGL1為水稻中一個(gè)葉綠素合成酶基因，OsYGL1參與水稻的葉綠素a和葉綠素b的合成，mRNA表達(dá)分析表明該基因呈組成性表達(dá)。該基因的突變(Osygl1基因)導(dǎo)致水稻黃綠葉的表型。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明了該基因的黃綠葉功能，利用本發(fā)明Osygl1突變基因控制的黃綠葉性狀可以作為遺傳標(biāo)記用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的品種鑒定以及水稻遺傳育種。
文檔編號(hào)C12N9/00GK101096676SQ20071002355
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者萬(wàn)建民, 冰 何, 喜 劉, 劉世家, 吳自明, 欣 張, 玲 江, 王春明, 程治軍, 寧 蘇, 陳亮明 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)