專利名稱：硝酸測(cè)定試劑盒及硝酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硝酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硝酸濃度的方 法，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉，亞硝酸鈉為白色至淡黃色粉末或顆粒狀，味微 咸，易溶于水。外觀及滋味都與食鹽相似，并在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、建筑業(yè)
中廣為使用，由亞硝酸鹽引起食物中毒的機(jī)率較高。1995年版中華人民共和 國藥典對(duì)蒸餾水檢測(cè)增加了硝酸鹽與亞硝酸鹽檢査。亞硝酸鹽可被氧化變?yōu)?硝酸鹽，硝酸鹽在無氧環(huán)境中受微生物的作用還原為亞硝酸鹽，是致癌物質(zhì)。
目前有按照國標(biāo)GB/T 5009.33做成的試劑盒，與標(biāo)準(zhǔn)色卡來比較進(jìn)行定 量，然而按照國標(biāo)方法檢測(cè)亞硝酸鹽指標(biāo)，步驟繁瑣，而且有些試劑必需現(xiàn) 配現(xiàn)用，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。它的檢測(cè)原理在酸性溶液中亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺 酸作用生成重氮化合物，再與a-萘胺起偶合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮染料，顯 色深淺與亞硝酸鹽含量成正比。加入鋅粉的目的是將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。
紫外分光光度法的原理硝酸根離子在紫外區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，利用它在 220nm波長處的吸光度可定量測(cè)定硝酸鹽。氯化物在此波長不干擾測(cè)定，溶解 的有機(jī)物在220nm處也會(huì)有吸收，而硝酸根離子在275nm處沒有吸收。因此， 在275nm處作另一次測(cè)量，以校正硝酸鹽值。紫外分光光度法操作過程簡(jiǎn)單。
還有利用離子色譜法紫外測(cè)定海水中亞硝酸鹽、硝酸鹽，這是利用離子色 譜法結(jié)合紫外檢測(cè)的方法。其他還有主要對(duì)肉制品、乳制品和蔬菜中亞硝酸 鹽檢測(cè)的光度法(格里斯試劑比色法、催化(褪色)光度法、流動(dòng)注射-分光光度法、順序注射-分光光度法、導(dǎo)數(shù)光度法)、示波極譜法、熒光法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm 波長處吸光度的變化，得以測(cè)定硝酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用 以實(shí)現(xiàn)該方法的硝酸測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀 或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行硝酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明硝酸濃度測(cè)定方法原理如下
硝酸+還原型輔酶硝酸還原酶亞硝酸+水+輔酶
這種方法應(yīng)用硝酸還原酶(Nitrate reductase; EC 1.7.1.1; EC 1.7.1.2; EC 1.7.99.4)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/終點(diǎn)比色法。硝酸還原酶酶解硝酸反應(yīng)，最終 將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nrn處吸光度下降的程度/速度，通過測(cè) 量340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測(cè)算硝酸的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明硝酸測(cè)定試劑盒較為理想
緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
硝酸還原酶 10000 U/L ,
本發(fā)明的硝酸測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、硝酸還原酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、硝酸還原酶。 還原型輔酶、硝酸還原酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使 用。
無論是單劑、雙劑，本發(fā)明測(cè)定硝酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的硝酸測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
硝酸還原酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)硝酸樣品與試劑的體 積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出硝酸的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的硝酸測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
硝酸還原酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C,反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)硝酸樣品與試劑1、 試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約 0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出硝酸的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不 另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度^^便于^r^應(yīng)用,
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法技術(shù)的硝酸濃度測(cè)定方法，其方法原理如下硝酸+還原型輔酶 硝酸還原酶亞硝酸+水+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出硝酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種硝酸測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L硝酸還原酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硝酸測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、硝酸還原酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硝酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、硝酸還原酶組成雙劑試劑；試劑1，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、硝酸還 原酶組成。還原型輔酶、硝酸還原酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述硝酸測(cè)定試劑盒，其特征在于:還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、 甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的硝酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定硝酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出硝酸的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101329257SQ20071002471
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司