專(zhuān)利名稱：山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒及山梨醇的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定山梨 醇濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景1872年，法國(guó)化學(xué)布斯辛特博士從山梨樹(shù)果實(shí)的果汁中分離出山梨醇， 山梨醇由此得名。山梨醇是一種重要的大噸位醫(yī)藥、化工、輕工、食品工業(yè)的原料。山梨 醇具有優(yōu)良的保鮮、保香、保色、保濕性，可使牙膏、化妝品、煙草、水 產(chǎn)品、食品等產(chǎn)品保持水分、香味、色澤和新鮮度。山梨醇廣泛用于食糖替代品。2000年6月國(guó)際糧農(nóng)和衛(wèi)生組織食品法 典委員會(huì)確認(rèn)山梨醇可以作為食品替代品添加到食品中，制作無(wú)糖甜食品、 減肥食品、抗便秘食品、抗齲齒食品、糖尿病人食品等。山梨醇用于牙膏的保濕、賦形劑，用于巻煙生產(chǎn)用的保濕劑和甜味劑， 用于化妝品生產(chǎn)時(shí)的增濕劑和軟化劑，用于生產(chǎn)乳化劑、增塑劑、除街劑、 粘結(jié)劑的原料。山梨醇用于醫(yī)藥維生素C的原料。山梨醇主要在肝臟經(jīng)山梨醇脫氫酶代 謝為果糖，大部分以原形由尿液排出。山梨醇為利尿脫水藥，因山梨醇大 部分以原形由尿液中排出，形成血液高滲，可使周?chē)M織及腦實(shí)質(zhì)脫水， 水腫液隨藥物從尿排出，從而降低顱內(nèi)壓，消除水腫。適用于治療腦水腫 及青光眼。也可用于心腎功能正常的水腫少尿。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔 酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定山梨醇濃度的方法，同時(shí)， 本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不 僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行山梨醇濃度測(cè) 定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明山梨醇濃度測(cè)定方法原理如下山梨醇+輔酶山梨醇脫氫酶山梨糖+還原型輔酶這種方法應(yīng)用山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase; EC 1.1.99.21)酶 促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。山梨醇脫氫酶酶解山梨醇反應(yīng)，將輔酶(在 340nrn處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)，從 而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量 340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測(cè)算山梨醇的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒較為理 想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L山梨醇脫氫酶 10000 U/L本發(fā)明的山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、山梨醇脫氫酶。 輔酶、山梨醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑，本發(fā)明測(cè)定山梨醇濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一 ，本實(shí)施例的山梨醇診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L山梨醇脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)山梨醇樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出山梨醇的濃 度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的山梨醇診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L山梨醇脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)山梨醇樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲 時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出山梨醇的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同， 不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。權(quán)利要求
1.一種酶比色法的山梨醇的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下山梨醇+輔酶 山梨醇脫氫酶 山梨糖+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出山梨醇的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L山梨醇脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、山梨醇脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、山梨醇脫氫酶 組成。輔酶、山梨醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的山梨醇診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定山梨醇濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、山梨醇脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出山梨醇的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101329337SQ200710024738
公開(kāi)日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司