專利名稱：乙醇濃度的測(cè)定方法及乙醇診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對(duì)乙醇濃度的檢測(cè)，尤其涉及酶比色法及偶聯(lián)法測(cè)定乙醇濃度的方法，以及由此制得的乙醇診斷試劑盒，屬于乙醇濃度分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。在西方國(guó)家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國(guó)，近20年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。
生物樣品中乙醇的定量測(cè)定方法主要有化學(xué)比色法、酶終點(diǎn)比色法、均相酶免疫測(cè)定法(EIA)、氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。
有多種化學(xué)比色法曾用于乙醇定量測(cè)定，微量擴(kuò)散法是其中較簡(jiǎn)單實(shí)用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍(lán)色的氧化鉻。
根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測(cè)定分為兩種乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會(huì)與甲醇和丙酮起催化反應(yīng)。
一般認(rèn)為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準(zhǔn)確性和精密度要求高的法醫(yī)學(xué)乙醇測(cè)定中應(yīng)用最廣。GC法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于特異、靈敏，且能同時(shí)分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。
乙醇的其它測(cè)定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimmunoassay)、滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測(cè)乙醇操作簡(jiǎn)單、快速，在交通執(zhí)法部門應(yīng)用較多。這類儀器中根據(jù)紅外光吸收原理設(shè)計(jì)，該法測(cè)定的乙醇濃度與酶法測(cè)得的血乙醇濃度相關(guān)性很好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定乙醇濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的乙醇診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶聯(lián)法(Couple Reaction)測(cè)定乙醇濃度的方法，利用酒精脫氫酶為作用酶、醛脫氫酶為顯色酶，對(duì)待測(cè)樣品中的乙醇進(jìn)行檢測(cè)，采用以下步驟進(jìn)行將測(cè)定的樣品與含有酒精脫氫酶、氧、輔酶、醛脫氫酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出乙醇濃度的大小。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明乙醇診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，酒精脫氫酶1000～80000U/L，醛脫氫酶 1000～80000U/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分輔酶可以放在試劑II；試劑II中的酒精脫氫酶、醛脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。以上單劑、雙劑當(dāng)中加入穩(wěn)定劑，濃度在1～4000mmol/L、或0.1％～100％體積比范圍之內(nèi)。
還可以將試劑配成如下三試劑

與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的輔酶可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的醛脫氫酶可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的酒精脫氫酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，活性濃度在1～4000mmol/L、或0.1％～100％體積比范圍之內(nèi)。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑還是雙劑，如下配方成分關(guān)系的診斷/檢測(cè)試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液100mmol/L，穩(wěn)定劑500mmol/L，輔酶 3mmol/L，酒精脫氫酶10000U/L，醛脫氫酶 10000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定乙醇濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乙醇診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乙醇濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明利用酶比色法及偶聯(lián)法測(cè)定乙醇濃度，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試過(guò)程精確度高；(3)該方法簡(jiǎn)便、易操作，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測(cè)，不需要特殊或額外儀器，測(cè)試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測(cè)定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測(cè)定各種樣品中乙醇濃度的大?。?6)本發(fā)明提供的液態(tài)乙醇診斷/檢測(cè)試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測(cè)試效果。配成雙劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測(cè)結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種乙醇濃度的測(cè)定方法及乙醇診斷試劑盒，運(yùn)用酒精脫氫酶(Alcohol dehydrogenase；EC 1.1.3.13)偶聯(lián)醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase；EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC 1.2.1.5)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。酒精脫氫酶酶解乙醇反應(yīng)產(chǎn)生乙醛，再通過(guò)(偶)聯(lián)合醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的程度/速度，測(cè)算乙醇的濃度大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制乙醇診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 500mmol/L，thio-NAD+3mmol/L，酒精脫氫酶 10000U/L，醛脫氫酶 10000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制乙醇診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50mmol/L，NADP+3mmol/L；試劑II——
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 500mmol/L，酒精脫氫酶 10000U/L，醛脫氫酶 10000U/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑I、試劑II的體積比例為2∶20∶5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
實(shí)施例三(三劑)按以下成分和用量配制乙醇診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，乙二醇 50mmol/L，NAD+3mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 500mmol/L，NADP+3mmol/L，醛脫氫酶 10000U/L；試劑III——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 500mmol/L，
酒精脫氫酶 10000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定乙醇濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑I、試劑II、試劑III的體積比例為4∶40∶5∶5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.乙醇濃度的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟3)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出乙醇濃度的大小。
2.乙醇診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，酒精脫氫酶1000～80000U/L，醛脫氫酶 1000～80000U/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙醇診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙醇診斷試劑盒，其特征在于所述輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
5.權(quán)利要求2～4中任意一種乙醇診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或者雙劑或三劑。
6.權(quán)利要求2～4中任意一種乙醇診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶比色法及偶聯(lián)法測(cè)定乙醇濃度的方法及乙醇診斷試劑盒，運(yùn)用酒精脫氫酶偶聯(lián)醛脫氫酶酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。酒精脫氫酶酶解乙醇反應(yīng)產(chǎn)生乙醛，再通過(guò)(偶)聯(lián)合醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的程度/速度，測(cè)算乙醇的濃度大小。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101082570SQ20071002476
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司