專利名稱：果糖濃度的測(cè)定方法及果糖診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對(duì)果糖濃度的檢測(cè)，尤其涉及利用酶比色法測(cè)定果糖濃度的方法，以及由此制得的果糖診斷試劑盒，屬于果糖濃度分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
國(guó)家相關(guān)部門于日前發(fā)布實(shí)施了《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)糠氨酸和果糖兩種特定物質(zhì)在液態(tài)乳中的含量，來判定是否添加了“復(fù)原乳”，乳中果糖含量(mg/L)與糠氨酸含量(每100g蛋白質(zhì)所含毫克數(shù))比值小于2時(shí)，則可判定添加了復(fù)原乳。
摻雜使假乳往往口感較差，有些不法奶商常常在摻假奶中加入價(jià)格便宜的白砂糖來改善鮮奶口感。測(cè)蔗糖就是為了遏制部分奶商的這種不法行為。測(cè)蔗糖的方法之一是先將蔗糖在強(qiáng)酸性條件加熱分解生成葡萄糖和果糖，然后再測(cè)果糖含量。果糖為分析精液質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定果糖濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的果糖診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶比色法測(cè)定果糖濃度的方法，利用果糖脫氫酶為作用酶和顯色酶，對(duì)待測(cè)樣品中的果糖進(jìn)行檢測(cè)，采用以下步驟進(jìn)行首先，將測(cè)定的樣品與含有輔酶、果糖脫氫酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
然后，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出果糖的濃度大小。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明果糖診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，果糖脫氫酶1000～80000U/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分輔酶可以放在試劑II；試劑II中的果糖脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，濃度在1～4000 mmol/L或0.1％～100％體積比范圍之內(nèi)。
無論是單劑還是雙劑，輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關(guān)系的診斷/檢測(cè)試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液 100mmol/L，穩(wěn)定劑 500mmol/L輔酶3mmol/L，果糖脫氫酶 8000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定果糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的果糖診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行果糖濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶比色法測(cè)定果糖濃度，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試過程精確度高；(3)該方法簡(jiǎn)便、易操作，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測(cè)，不需要特殊或額外儀器，測(cè)試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測(cè)定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測(cè)定各種樣品中果糖濃度的大??；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)果糖診斷/檢測(cè)試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測(cè)試效果。配成雙劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測(cè)結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種酶比色法測(cè)定果糖濃度的方法及果糖診斷試劑盒，運(yùn)用果糖脫氫酶(Fructose dehydrogenase；EC 1.1.1.124；EC 1.1.99.11)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。果糖脫氫酶酶解果糖并將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的程度/速度，測(cè)算果糖的濃度大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制果糖診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 500mmol/L，NADP+3mmol/L，果糖脫氫酶 8000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)果糖樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出果糖的濃度大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制果糖診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 50mmol/L，NAD+3mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L乙二醇 500mmol/L果糖脫氫酶 8000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)果糖樣品與試劑I、試劑II的體積比例為2∶20∶5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出果糖的濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.果糖濃度的測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度/速度，測(cè)算出果糖的濃度大小。
2.果糖診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，果糖脫氫酶1000～80000U/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.權(quán)利要求2或3所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或雙劑。
5.權(quán)利要求2或3所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶比色法測(cè)定果糖濃度的方法及果糖診斷試劑盒，運(yùn)用果糖脫氫酶酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法，果糖脫氫酶酶解果糖并將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的程度/速度，測(cè)算果糖的濃度大小。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。將診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101082573SQ20071002476
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司