專利名稱：由原核細(xì)胞制備活性t-PA的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人組織型纖維蛋白酶元激活物(t-PA，下同)表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu) 建及其在工程化改造的原核細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。其產(chǎn)物具有生物活性，可 用于血栓性疾病的治療。所在的技術(shù)領(lǐng)域與生命醫(yī)藥和生物技術(shù)有關(guān)。
技術(shù)背景人t-PA在人體內(nèi)的凝血和溶血系統(tǒng)中起著十分重要的生理作用。 t-PA由527個氨基酸編碼組成，在蛋白結(jié)構(gòu)上有18個二硫鏈，其形成的 構(gòu)形與蛋白生理功能有極為重要的作用。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，人t-PA由五個 不同的功能區(qū)構(gòu)成，它們分別是(l).環(huán)狀手指功能區(qū)；(2).生長因子功 能區(qū)；(3).和(4).兩個相似功能的區(qū)域，Kringle l和Kringle2，此功能 性區(qū)可特異性結(jié)合于纖維蛋白凝塊；(5).絲氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)激活纖溶酶 元，使其轉(zhuǎn)化為纖溶酶，降解纖維蛋白，溶解血栓。由于t-PA具有上述溶血栓的重要生理功能，在臨床上可用于治療急性 心肌梗塞、腦血栓形成、肺梗塞和其他血栓性疾病。因此世界各國科學(xué)家 對其進(jìn)行了廣泛深入的研究和開發(fā)，包括功能結(jié)構(gòu)上的改構(gòu)和各種表達(dá)系 統(tǒng)方面的(Cleary S， et al， Biochem. 1989， 28(4): 1884-91; Jarvis DL， et al， Mol Cell Biol 1989， 9(1):214-23; Anne M. F. ， et al， Biotech. And Applied Biochem. 1988， 10， 454-464: Canion丄Refino， et al， Thrombosis and Haemostasis，1993， 70(2)313-39; Kenichi F. ， et al. Circulation 1997， 95 (3) :715-722)以達(dá)到增強(qiáng)其溶栓功能和延長血液半 衰期或達(dá)到低成本生產(chǎn)之目的。以前在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中對人t-PA的大多數(shù)研究證明原核細(xì)胞可 以表達(dá)人t-PA，但最主要的問題是原核細(xì)胞表達(dá)的人t-PA在胞槳內(nèi)形成 包涵體，且不具有生物活性，因此，需要耗時、復(fù)雜繁瑣的復(fù)性工藝。研 究還發(fā)現(xiàn)其主要原因是表達(dá)的人t-PA蛋白質(zhì)在細(xì)胞漿內(nèi)不能形成正確的 蛋白質(zhì)空間構(gòu)形。隨著分子、細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜大分子蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的研究有重大突破，使人t-PA在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn) 成為可能。如前所述，由于人t-PA結(jié)構(gòu)上有18個二硫鍵，由此形成的蛋 白空間構(gòu)形對人t-PA的生物活性起著決定性的作用。細(xì)胞中蛋白質(zhì)二硫 鍵的形成是一個十分復(fù)雜的過程，是細(xì)胞內(nèi)多種與二硫化物氧化還原作用 有關(guān)的醮類相互作用有關(guān)，即細(xì)胞中與二硫鍵形成有關(guān)的DsbA、 DsbB、 DsbD和DsbC,都是細(xì)菌周質(zhì)Dsb家族中的成員，直接或間接參與二硫鍵的 形成，其中尤以DsbC的作用最強(qiáng)。研究表明DsbC是一種二硫鍵同分異構(gòu) 酶，是二瑰鐮同分異構(gòu)作用的良好催化劑。DsbC的 化還原狀態(tài)與細(xì)胞正確地拼裝多個二硫鍵的蛋白質(zhì)的能力 緊密有關(guān)。在正常狀態(tài)下，細(xì)菌周質(zhì)處于氧化態(tài)，野生型DsbC蛋白質(zhì)活性 區(qū)在細(xì)菌周質(zhì)處于還原態(tài)時才具有催化活性(ArneR.， et al. J. Baterio.， 1997， 179(21) :6602~6608)，故二硫鍵很容易在周質(zhì)形成，不會在還原態(tài) 的細(xì)菌胞內(nèi)形成。而細(xì)菌胞內(nèi)還原態(tài)是硫氧還蛋白還原酶(trsB)/谷胱甘肽還 原酶(gov)基因控制的。 一旦這二種基因發(fā)生突變，將使細(xì)菌胞內(nèi)還原態(tài)轉(zhuǎn) 變?yōu)檠趸瘧B(tài)，這將大大有利于無信號肽DsbC催化二硫鍵在氧化態(tài)的細(xì)菌 胞內(nèi)形成，提高含多個二硫鍵蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和合成。在正常狀態(tài)下，當(dāng)原核細(xì)胞表達(dá)一種含多個二硫鍵的復(fù)雜蛋白質(zhì)時， 原核細(xì)胞本身催化二硫鍵形成的相關(guān)酶功能不足，不能使表達(dá)的復(fù)雜大分子蛋白質(zhì)形成正確構(gòu)形，故不能合成有生物活性的t-PA。這是表達(dá)蛋白不具有生 物活性的主要原因。然而，通過將克隆的DsbC基因轉(zhuǎn)入表達(dá)原核宿主菌 進(jìn)行表達(dá)，將顯著增強(qiáng)其催化功能，使復(fù)雜蛋白的多二硫鍵得以形成而具 有生物活性。此外，在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)需要一種在原核細(xì)胞內(nèi)可驅(qū)動編 碼外源蛋白貭的DNA分子轉(zhuǎn)錄的原核細(xì)胞表達(dá)載體。這種載體不但需要有 一種強(qiáng)啟子，而且還要能緊密控制這種強(qiáng)啟子驅(qū)動的調(diào)控元件。研究證實(shí) 含有由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子和其調(diào)控基因araC組成 的表達(dá)調(diào)控元件的表達(dá)載體符合上述要求。調(diào)控基因araC是一個正負(fù)調(diào) 控因子，控制著Pmd啟動子的轉(zhuǎn)錄開啟功能，其轉(zhuǎn)錄開啟功能和轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱 能力取決于誘導(dǎo)劑阿拉佰糖arabinose是否存在和使用量的多少(luz M. G.， et al. J Bacterio. 1995, 177(14) :4121—4130)。同樣，為了便于表達(dá)活性蛋白的分離純化，研究人員也一直試圖通過 一種轉(zhuǎn)膜信號多肽和目的基因的觸合，達(dá)到能將表達(dá)目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì) 分泌到培養(yǎng)液之目的。目前研究應(yīng)用的轉(zhuǎn)膜信號多肽有PelB、 LainB、 MalE、 PhoA和0i >A等(J.Pratap. ，et al.Mol. Gen.Genet (1998)258:-333)，但 各忡轉(zhuǎn)膜信號多肽和目的基因產(chǎn)物蛋白的分離率不一，可能與使用的表達(dá) 宿主細(xì)菌不同有關(guān)。人t-PA是一種具有顯著治療效果和巨大市場應(yīng)用前景的重組藥物。目 前在臨床上應(yīng)用的人t-PA，包括其突變體，都是經(jīng)由真核細(xì)胞CHO系統(tǒng)生產(chǎn)的，故不能避免遇到生產(chǎn)的人源重組T-PA產(chǎn)品雖有生物活性，但產(chǎn)量較低，產(chǎn)品成本髙昂的瓶頸。價格昂貴，非一般病人所能承受。因此采用新的途徑 開發(fā)出成本更低、半衷期更長、溶栓功能更強(qiáng)的新一代人源重組T-PA產(chǎn)品藥物， 在我國將具有廣闊的市場前景，并將產(chǎn)生良好的社會效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種融合有跨膜信號肽的突變型人組識型纖溶酶 原激活劑(坦t-PA,下同〉的、由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子 和其調(diào)控基因araC組成的表達(dá)調(diào)控元件的表達(dá)質(zhì)粒，并通過mt-PA表達(dá)質(zhì) 粒與DsbC表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化(texB)/(gov)基因突變的宿主菌，形成高表達(dá)、可 分泌的、具有生物活性人mt-PA的工程菌，因而能成為一種可進(jìn)行人mt-PA 產(chǎn)生化生產(chǎn)的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。為達(dá)成本發(fā)明的目的，提供了以下幾個方面的

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面，提供了一種突變型人t-PA分子結(jié)構(gòu)，該分子結(jié)構(gòu) 中t-PA的野生型蛋白酶功能P區(qū)內(nèi)與纖溶酶激活劑抑制因子-1結(jié)合的氨 基酸296-299(Lys-His-Arg-Arg)突變?yōu)?Ala- Ala- Ala- Ala)，因而具有更強(qiáng)溶栓功能和較長半衰期。本發(fā)明的第二方面，提供了一種含有信號肽0mpA的，由阿拉佰糖 arabinose操縱子的Pmd啟動子驅(qū)動和其調(diào)控因子araC組成表達(dá)調(diào)控元件 的原核細(xì)龐表達(dá)載體。因而，此表達(dá)載體具有緊密調(diào)控、高水平表達(dá)和分泌外源表達(dá)蛋白質(zhì)的功能。本發(fā)明的第三方面，提供了一種融合0mpA信號信與突變型mt-PA的表 達(dá)結(jié)構(gòu)，由阿拉佰糖arabinose操縱子的Pbad啟動子驅(qū)動和其調(diào)控因子 araC基因組成調(diào)控元件的mt-PA表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的第四方面，提供了一種由啟動子T7和LacZ調(diào)控的、表達(dá)同分 異構(gòu),DsbC基因的表達(dá)質(zhì)粒。在另一優(yōu)選例中，提供了一種由啟動子T7和LacZ調(diào)控的、表達(dá)無信號 肽的同分異構(gòu)酶DsbC的表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的第五方面，提供了一種由人mt-PA表達(dá)質(zhì)粒和DsbC表達(dá)質(zhì)粒 或無信號肽DsbC表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化texB/gov基因突變的原核表達(dá)宿主菌， 構(gòu)成表達(dá)人通t-PA的工程菌。在另一,例中，提供了一種人mt-PA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)DsbC表達(dá)質(zhì)粒 或無信號肽I^bC表達(dá)質(zhì)粒預(yù)先轉(zhuǎn)化的texB/gov基因突變的原核感受態(tài)表 達(dá)宿主菌，構(gòu)成表達(dá)人mt-PA的工程菌。附圉欐明圖l:野生型人t-PA和突變型人t-PA的內(nèi)切酶酶切圖譜用內(nèi)切酶Xbal 和Notl消化野生型人t-PA;用內(nèi)切酶Ncol、 Hindlll和Notl消化突變型 人t-PA，電泳分離。第一道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；第二道和第三道分別野生型和突變型人t-PA。圖2:為含有分泌信號肽OmpA和人mt-PA表達(dá)序列的、由阿拉佰糖 arabinose操縱子的P咖啟動子驅(qū)動和其調(diào)控因子araC基因組成調(diào)控元件 的mt-PA表達(dá)質(zhì)粒圖譜。圖3: SDS-PAGE蛋白電泳的人邁t-PA表達(dá)圖譜第一道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo) 準(zhǔn)物；第二道、第三道、第四道和第五道分別為末誘導(dǎo)、l小時、2小時和 3小時誘導(dǎo)的mt-PA和DsbC蛋白產(chǎn)物。箭頭所指為表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在上 的為mt-PA,在下的為DsbC。圖4: SDS-PAGE蛋白電泳的分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液中的t-PA表達(dá)產(chǎn)物，箭頭為 表達(dá)產(chǎn)物.。第一道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物；第二道為3小時誘導(dǎo)的mt-PA蛋 白產(chǎn)物；第三道為l小時誘導(dǎo)的mt-PA蛋白產(chǎn)物。箭頭所指為表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn) 物。圖5:細(xì)胞培養(yǎng)液中的人mt-PA表達(dá)產(chǎn)物的生物活性檢測。第一道和第二道 分別為3小時誘導(dǎo)和l小時誘導(dǎo)的mt-PA蛋白產(chǎn)物。箭頭所指白色條帶為有 生物活性表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。圖6:細(xì)菌內(nèi)表達(dá)人mt-PA的生物活性檢測。第一道和第二道分別為1號和2 號工程菌2小時誘導(dǎo)的mt-PA蛋白產(chǎn)物。箭頭所指白色條帶為有生物活性表 達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。具體實(shí)詹方式一、野生鏖人t-PA的突變其方法是釆用基因突變技術(shù)，使野生型人t-PA 的野生型蛋白酶功能P區(qū)內(nèi)與纖溶酶激活劑抑制因子-1結(jié)合的氨基酸 296-299(Lys-His-Arg-Arg)突變?yōu)?Ala- Ala- Ala- Ala)。并在突變區(qū)形 成新的核普鶄內(nèi)切酶Notl位點(diǎn)。 1).以野生型人t-PA為模板，用人工合成的引物1和引物2，引物3和引物4分別進(jìn)行ra擴(kuò)增。引物設(shè)計如下引物l: (27鵬r，并引入Ncol內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)5, 一gcjccat^gagc c縛atcttac caag -3， 引物2: (34mer，并引入Notl內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)5， 一 ccgctccgggcgatgcagcggccgcggcaaagat-3，引物3: (34鵬r,并引入Notl內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)5, -ttgccfecggccgctgcatcgcccggagagcggtW引物4: (33 mer，并引入Hindlll內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)5, -gc)aagctt|tcacggtcgcatgttgtcacgaatc-3，PCR擴(kuò)増產(chǎn)物分鰣經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體。轉(zhuǎn)化細(xì) 菌后，進(jìn)行擴(kuò)繒、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。將中含上述謝A片段的T-easy載體質(zhì)粒DNA分別用Ncol和Notl， Notl 和Hindlll完全,切消化，將Ncol-Notl和Notl-Hindlll 二個DNA片段，分離純化后備用。二、含有核糖體銪合位點(diǎn)(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA的原核細(xì)胞表達(dá)載體 pBAD331).人工合成如下含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA DNA 片段:(5，-3，，核糖體結(jié)合位點(diǎn)為淺黑色區(qū)；在其5'-末端引入Nhel、在其3'-末 端分別引入Ncol和Sacl內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)tttccjgctag 4aggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc tggtttcgctaccgtag cca tg漆c gagct c ggta2).分別用Mhel和S敏l內(nèi)切酶消化分泌信號肽OmpADNA片段和原核細(xì)胞 表達(dá)載體pBi^33，經(jīng)電泳分離純化后，進(jìn)行拼接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。然后篩選 成功轉(zhuǎn)化的if株進(jìn)行質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，抽提純化。最后用前述二種Nhel和Sacl 內(nèi)切酶消化證實(shí)。三、含磁余分港翁號勝O鵬pA和mt-PA表達(dá)序列的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1) .用bfcoi和Hindlll內(nèi)切酶消化含有分泌信號肽OmpA的原核細(xì)胞表達(dá) 載體醉AD33,分離純化；2) .將實(shí),一中對人t-PA進(jìn)行PCR反應(yīng)后，分離純化備用的Nco1-Notl的 DNA片段和Mot1-Hindlll的DNA片段與分離純化的Ncol-Hindlll的原核細(xì)胞表 達(dá)載體pBiyM3片段進(jìn)行拼接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。然后進(jìn)行擴(kuò)增、抽提和純 化質(zhì)粒DNA。最后用酶切圖譜證實(shí)對pBAD33/mt-PA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。四、含同分,酶DsbC表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1).應(yīng)用PCR法對DsbC基因進(jìn)行改造。以DsbC基因?yàn)槟０澹萌斯ず铣?的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物設(shè)計如下引物l:(Mmer，在其5'-端引入Ndel內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊),"Cggatacatat tgatgaagaa aggt-3'引物2: (25鵬r,在其5，-端引入Ndel內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)5， — gcjaagct咖tatttaccgctggtca -3，PCR擴(kuò)鳙產(chǎn)物分別經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體。轉(zhuǎn)化細(xì) 菌后，進(jìn)行擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。應(yīng)用Wel和Hindlll內(nèi)切酶消化含有DsbC的T-easy質(zhì)粒DNA，分離純化 DsbC酶切片段備用2) .用恥el和HindUl內(nèi)切酶消化原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Peal-n(源自 stratagene公司)，分離純化備用3) .將l)和2)中的DsbC醃切片段和原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Peal-n酶切片段進(jìn) 行拼接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，進(jìn)行擴(kuò)增、抽提、純化，最后用酶切圖譜證 實(shí)對Pcal-nCNbC表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。五、含無信兮勝同分異構(gòu)酶DsbC表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1).應(yīng)用POt法對DsbC基因進(jìn)行改造。以DsbC基因?yàn)槟０?，用人工合成的?物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物設(shè)計如下引物1:(效ibct，在其5'-端引入Ndel內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊) <formula>formula see original document page 14</formula>， 引物2: (25鵬r,在其5，-端引入Ndel內(nèi)切酶位點(diǎn)，字符框邊)<formula>formula see original document page 14</formula>，PCR擴(kuò)權(quán)產(chǎn)物分別經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體。轉(zhuǎn)化細(xì) 菌后，進(jìn)行擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。應(yīng)用附el和Hindi 11內(nèi)切酶消化含有DsbC的T-easy質(zhì)粒DNA，分離純化 DsbC酶切片段備用；2) .用恥el和Hindlll內(nèi)切酶消化原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Peal-n(源自 stratagene公司)，分離純化備用；3) .將l)和2)中的DsbC酶切片段和原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒Peal-n酶切片段進(jìn) 行拼接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，進(jìn)行擴(kuò)增、抽提、純化，最后用酶切圖譜證 實(shí)對無信號肽Pcd-n/DsbC表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。六、構(gòu)建ft^C平表達(dá)、有生物活性的分泌型人mt-PA工程菌應(yīng)用本發(fā)明中構(gòu)建pBAD33/mt-PA表達(dá)質(zhì)粒和Pcal-n/DsbC表達(dá)質(zhì)?；驘o 信號肽的P^i/DsbC表達(dá)質(zhì)粒，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方法，共轉(zhuǎn)化texB/gov基因 突變的原棟感受態(tài)表達(dá)宿主菌Qrigami(DE3),篩選高表達(dá)、有生物活性的 mt-PA菌株，確定表達(dá)人mt-PA的工程菌。七、表達(dá)艙人nrt-PA的生物活性檢淵采用纖維素板法檢測本發(fā)明中表達(dá)的mt-PA生物活性。具體操作如下 首先，按0.W(重量/體積)a-酪氨酸和每毫升含IO微克的纖溶蛋白酶原的比例，共聚膠形成濃度為12W的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙酰胺膠； 其次，上樣后，在溫度攝氏4度，低電壓電泳過夜。次日用2. 5%的TritonX-100漂洗聚丙載胺膠1小時，去除膠中的十二烷基硫酸鈉(SDS)。然后，用大量的蒸餾水漂洗聚丙酰胺膠以去除Triton X-100;再其次，將上述的聚丙酰胺膠用pH為8. 3、濃度為0. 1摩爾的甘氨酸 緩沖液在攝氏37溫度孵化5小時。最后用卡馬氏亮蘭對聚丙酰胺膠染色 15分鐘并進(jìn)行脫色。結(jié)果評估有生物活性的人t-PA及其衍生物在膠中顯示為一條亮白 的條帶。其截弱與t-PA及其衍生物的便用量和活性有關(guān)。序列表Street :廣州S際企業(yè)孵化器A區(qū)610房City :廣州State -廣東Country :中頃PostalCode : 510633〈110〉 LastNane :王<110〉 FirstNane :尚武Ssqueiice〈210〉 1〈211〉 Length : 95SequenceName : OmpA信號肽 SequenceDescription :<212> Type : DNA<213> Organismfeme -細(xì)菌〈400> PreSequenceString : 1tttccgctag caggaggaaa cgatgaaaaa gacagctatc gcgattgcag tggcactggc 60 tggtttcgct accgtAgcca tggccgagct cggta 95〈210〉 2〈2ID Length : 23SequenceName c OnpA信號肽SequenceDoscription : <212〉 Type : PRT 〈213〉 Qrg柳ismName :細(xì)菌 <400〉 RreSequenoeStriiJg : 5Met Lys Lys Thr Ala lie Ala lie Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe 15 10 15Ala Thr Val Ala Met Ala Glu Leu Gly 加 24〈210〉 3〈211〉 Length : 1609Sequ抑crite一 人源突變型纖溶酶原激活劑(nt-PA) Sequenccfi^icription : 〈212〉 Type : 0NA<213> Qrgani^Na e : AX序列 <400> RreSeq卿eeString : 3gcgccat鵬a^ccagatcttaccaagtgatctgcagagatgaaaaaacgcagatgatat60accagcaacmtcc^tcat驟ctgegccctgtgctcagaagcaaccgggtggaatattgct120ggtgcaacagt驟鄉(xiāng)ggcacagtgccactc鄰tgcctgtcaa幼gttgcatgcgagcc朋180ggtgtttcaatgccagc鄉(xiāng)ccctgtacttctcagatttcgtgtgcragt240gccccgaaggatttgctg碟aagtgctgtgaaatagataccagggccacgtgctacgagg300accagggcatcagctacaggggcacgtggagcacagcggagagtggcgccgagtgcacca360actggaacaggcccagaagccctac鄰cgggcggaggccagacgccatca420ggctgggcctg^aaccacaactactgcagaaacccagatcgagactcaaagccctggt480gctacgtcttaagtacagctcagagttetgcagcacccctgcctgctctg540agggaaacagtttgggaatgggtcagcctaccgtggcacgcac鄰cctca600ccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggcaaggtttaca660cagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattactgccggaatc720ctgatgfi^gatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctgacgtgggagt780actgtgatgttccacctgcggcctgagacagtacagccagcctcagtttc840gcatcaaagga^gctcttcgccgacatcgcctcccacccctggc鄉(xiāng)ctgccatctttg900ccgcggccgctgcatcgccc鵬柳cggttcctgtgcgggggcatactcatcagctcct960gctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccaccacctgacgg1020tgatct敏gc腳tggtccctggcgaggaggagcagaaatttgaagtcg讓saaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgacattgcgctgc1140tgcagctgaaate鵬ttcgtcc鄰ctgtgcccaggagagcagcgtggtccgcactgtgt1200gccttcccccg欲g靜cctgc鄰ctgccggactggacggagtgtgagctctccggctecg1260gc幼gcatgaggecttgtctectttctattcgg^cggctgaagg鄉(xiāng)ctcatgtcagac1320tgtacccatccagc鄰ctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtcaccgac朋ca1380tgctgtgtgccg糊cggcgggccccaggcaaacttgcacgacgcctgcc1440agggc與ttcg^M8fccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgactttggtgggca1500tcatcagctgggfcct能gctgt碟acaga鄰gatgtcccgggtgtgtacaccaaggtta1560agac紹gattcgtgacaacat柳accgtgaaagcttgc翻<210> 4
<211> Length : 531
SequenceNaae :人簾突變型纖溶酶原激活劑(mt-PA) SequenceDescription <212〉 Type :附 〈213> QrganisBNaBe :人工序列 〈400〉 PreSequenceString : 4
<formula>formula see original document page 18</formula>Arg Gin Tyr Ser Ala Asp lie Ala Ala Ala Ala Ser lie Ser Ser Cys Arg Phe Pro Pro Arg Val Val Pro Tyr lie Val His lie Ala Leu Leu Glu Ser Ser Val Gin Leu Pro Asp His Glu Ala Leu His Val Arg Leu Leu Asn Ai^ Thr Arg Ser Gly Gly Asp Ser Gly Gly Leu Val Gly lie Val Pro Gly ValGin Pro Gin Phe Arg lie 275 280 Ser His Pro Trp Gin Ala 290 295 Pro Gly Glu Arg Phe Uu 305 310 Trp lie Leu Ser Ala Ala 3加 325 His His Leu Thr Val lie 3加 320 Gly Glu Glu Glu Gin Lys 350 355 Lys Glu Phe Asp Asp Asp 365 370 Gin Leu Lys Ser Asp Ser 380 385 Val Arg Thr Val Cys Leu 395 400 Trp Thr Glu Cys Glu Leu 410 415 Ser Pro Phe Tyr Ser Glu 425 430 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys 440 445 Val Thr Asp Asn Met Leu 455 460 Pro Gin Ala Asn Leu His 470 475 Pro Leu Val Cys Leu Asn 485 4恥 lie Ser Trp Gly Leu Gly 500 505 Tyr Thr Lys Val Thr Asn 515 520Lys Gly Gly Leu Phe 285Ala lie Phe Ala Ala 300Cys Gly Gly lie Leu 315His Cys Phe Gin Glu 330Leu Gly Arg Thr Tyr 345Phe Glu Val Glu Lys 360Thr Tyr Asp Asn Asp 375Ser Arg Cys Ala Gin 390Pro Pro Ala Asp Leu 405Ser Gly Tyr Gly Lys 420Arg Leu Lys Glu Ala 435Thr Ser Gin His Leu 450Cys Ala Gly Asp Thr 465Asp Ala Cys Gin Gly 480Asp Gly Arg Met Thr 495Cys Gly Gin Lys Asp 510Tyr Leu Asp Trp lie 525Arg Asp Asn Met Arg Pro 531〈210〉 5〈211> Length : 728SequenceNaae : DsbC Sequemad)escription :<212〉 Type :腿<213> OrganinNMe :細(xì)菌<400〉 PreSequenceString : 5cggcatatgaagaaaggttttatgttgtttactttgttegcggcgttttcaggctttgct60c郷ctgatgacgc驟c幼ttcaacaaacgttagccaaaatgggcatcaaaagcagcgat120attcagcccgcgcctgtagct餘catgaagacagttctgactaacagcggcgtgttgtac180atcaccgatg3tggteaacat&tcattcaggggcc幼tgtatgacgttagtggcacggct240ccggtcaatgtcac(^at幼gatgctgtteaagcagttgaatgcgcttgaaaaagagatg300atcgtttataaagcgccgcaggaaaaacacgtcatcaccgtgtttactgatattacctgt360ggttac紹ccaoaaa^tgcatgagcaaatggcagactacaacgcgctggggatcaccgtg420cgttatcttgctttcccgcgcca肪ggctggacagcgatgc鄰agaaagaaatgaaagct480atct餘tgtgc^a^ataaaaacaaagcgtttgatgatgtgatggc鄉(xiāng)taaaagcgtc540gcaccagcc3gttgcp^gt鵬tattgccgaccattacgcacttggcgtccagcttggc600gttagcggtactcc醻cagttgtgctgagcaatggcacacttgttccgggttaccagccg660aaagagatgaaagaattcctcgacgaacaccaaaaaatgaccagcggtaaataaaagctt720gc722<210〉 6〈211> Length : 2S5SequenceNam : DsbC SequeneeDescription :<212> Type : PRT〈213〉 Organis Na e :細(xì)菌<400> PreSequenceString : 6 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu 1 5 Gly Phe Ala Gin Ala Asp Asp 加Lys Met Gly lie Lys Ser Ser 35Gly Met Lys Thr Val Leu Thr 恥Asp Asp Gly Lys His lie lie 65Gly Thr Ala Pro ￥al A幼Val抑 85 9020Ph6 Thr Leu 10Ala Ala lie 25Asp lie Gin 40Asn Ser Gly 55Gin Gly Pro 70Thr Asn LysLeu Ala Ala Gin Gin Thr Pro Ala Pro Val Leu Tyr Met Tyr Asp Met Leu LeuPhe Leu Val lie Val LysSer 15 Ala 30 Ala 45 Thr 60 Ser 75 GinLeu Asn Ala Leu Glu 95Glu Lys His Val lie 110Cys His Lys Leu His 125lie Thr Val Arg Tyr 140Asp Ala Glu Lys Glu 155Asn Lys Ala沐e Asp 170Ala Ser Cys Asp Val 185Gin Leu Gly Val Ser 200Thr Leu Val Pro Gly 215Asp Glu His &lti Lys 230Lys Glu Met Thr Val Phe Glu Gin Met ■Leu Ala Phe Met Lys Ala Asp Val Met Asp lie Ala Gly Thr Pro Tyr Gin Pro Met Thr Serlie Thr Ala Pro lie Ala Asp Ala Lys GlyVal 100 Asp 115 Asp 130 Arg 145 Trp 160 Gly 175 His 190 Val 205 Glu 220 Lys 235Tyr lie Tyr Gin Cys Lys Tyr Val MetLys Thr Asn Gly Ala Ser Ala Leu LysAla Cys Ala Leu Lys Val LeuPro Gly Leu Asp Asp Ala GlySer Asn Glu PheGin 105 Tyr 120 Gly 135 Ser 150 Lys 165 Pro 180 Val 195 Gly 210 Leu 225<210> 7〈211〉 Length :艦SequencePfe(Be :無信號肽DsbC Seq股n欲Detsc:ription :〈212〉 Type : DMA <213〉 OrganiMNaae :人工序列 <400> PreSequenecString : 7tacatatggat鹛cgcggca attcaacaaacgttagccaa aatgggcatc aaaagcagcg60atattca^ccge脾tgta gct肪catga^ac縛ttct gactaacagc ggcgtgttgt120acatcaccgat靜tggtaaa catatcattcag鵬ccaat gtatgacgtt鄰tggcacgg180ctccggtcaatgtcaecaat aagatgctgttaaagcagtt gaatgcgctt gaaaaagaga240tgatcgtttataaagcgccg caggaaaaacacgtcatcac cgtgtttact gatattacct300gtggttactgccacaaactg catgagcaaatggcagacta eaacgcgctg gggatcaccg360tgcgttotcttgctttcccg cgcca鵬gct卿cagcga tgcagagaaa gaaatgaaag420ctatct碟tgtgegsttagat aaaaacaaagcgtttgatga tgtgatggca ggtaaaagcg480tcgcaccagccagttfcgac gt鵬tattgccgaccatta cgcacttggc gtccagcttg540gcgtt鄉(xiāng)ggt狄t鄰餘ca gttgtgct辟gcaatggcac acttgttccg ggttaccagc600cgaaagagat gaaa^attc ctcgacg幼c accaaaaaat gacc鄰cggt aaataa 656<210> 8〈211〉 Length : 216SequenceNaws :無信號肽DsbC SequenceD^tcripticm :〈212〉 Type :附<213> Qrganis Na e : Al序列〈400〉 PreSeqU m String : 8Met AspAspAla JUa lieGinGinThrLeuAlaLysMetGlyHe151015Lys SerSerAsp lie GinProAlaProValAlaGlyMetLysThr幼2530Val LeuThrA郎Ser GlyValLeuTyrlieThrAspAspGlyLys354045His lielieGin gly Pro84 tTyrAspValSerGlyThrAlaPro恥5560Yal AsnValThr Asn LysMetLeuLeuLysGinLeuAsnAlaLeu筋7075Glu LysGluMet lie ValTyrLysAlaProGinGluLysHisVal808590lie ThrValPte "Hit AsplieThrCysGlyTyrCysHisLysLeu鄉(xiāng)100艦His GluGinMet Ala AspTyrAsnAlaLeuGlylieThrValArg110115120Tyr UuAlaPhe l￥o ArgGinGlyLeuAspSerAspAlaGluLysl肪130135Glu MetLysAla I.le TrpCysAlaLysAspLysAsnLysAlaPhel抑145150Asp AspValktet Ala GlyLysSerValAlaProAlaSerCysAsp版160165Val AsplieAla細(xì)p HisTyrAlaLeuGlyValGinleuGlyVal170175180Ser GlyThr Pro Ala ValValL uSerAsnGly ThrLeuValPro185190195Gly TyrGin Pro Lys GluMetLysGlu PheLeu AspGluHisGin娜205210Lys Met Thr Ser Gly Lys
權(quán)利要求
1. 一種由原核細(xì)菌跨膜信號肽OmpA融合mt-PA的表達(dá)序列，由阿拉佰糖(arabinose)操縱子PBAD啟動子和其調(diào)控基因araC組成表達(dá)調(diào)控元件的表達(dá)質(zhì)粒。其主要特征為a).人組織型纖維蛋白溶酶元激活物(t-PA)的分子中與纖維蛋白溶酶元激活物抑制因子1(PAI-1，下同)結(jié)合區(qū)域中位于P區(qū)氨基酸296-299 lys-His-Arg-Arg突變成Ala-Ala-Ala-Ala，并在突變區(qū)形成新的Not1內(nèi)切酶位點(diǎn)的突變型人mt-PA(下同)，其他氨基酸及其排序與野生型t-PA一致；b).人mt-PA的N-末端以Nco1酶切點(diǎn)連接于原核表達(dá)載體pBAD33分泌信號肽OmpA的C-末端，分泌信號肽OmpA的N-末端含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列-AGGAGG-；分泌信號肽OmpA由24個氨基酸組成；c).本發(fā)明所用的原核表達(dá)載體pBAD33為新構(gòu)成的含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(-AGGAGG-)分泌信號肽OmpA的原核細(xì)胞表達(dá)載體pBAD33。此分泌信號肽OmpA分別以N-端的Hhe1和C-端的Sac1連接于原型表達(dá)載體，成為由阿拉佰操縱子的PBAD啟動子驅(qū)動、具有緊密調(diào)控和高水平表達(dá)的一種分泌型原核細(xì)胞表達(dá)載體。
2. —種畬有同分異構(gòu)酶DsbC或無信號肽DsbC的、由T7啟動子和LacZ組 成表達(dá)調(diào)控元件的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。其主^iW在于a) .原狹黼應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒的骨架是以pcal-n表達(dá)載體為基礎(chǔ)的，此載體經(jīng) Ndel和HiadMl消化后，切除了鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)片段(Calmodelin-bindingunit);b) .細(xì),闕分異,DsbC或無信號肽DsbC是以Ndel和Hindlll酶切片段 重組于前,pcrf-A形成由T7啟動子和LacZ組成表達(dá)調(diào)控元件的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcsd-Dlibco
3. —種同分獰構(gòu)酶DdjC或無信號肽DsbC原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的感受態(tài)宿主 笛Oi%amip>i3)。其主要特征在于a) .該宿主菌的琉氧還蛋白還原酶(trsB)/谷胱甘肽還原酶(gov)基因己經(jīng)突變， 其胞漿還感S^變?yōu)橛欣诙疰I形成的氧化態(tài)；b) .此複主菌是為同分異構(gòu)酶DsbC或無信號肽DsbC原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒所 轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主菌；c) .這些轉(zhuǎn)化的細(xì)菌表達(dá)同分異構(gòu)酶DsbC或無信號肽DsbC蛋白質(zhì)；d) .上述遂，化的細(xì)菌也能被表達(dá)人mt-pa的表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化；e) .此複主菌也能用于其他多二硫鍵的復(fù)雜大分子蛋白質(zhì)的表達(dá)。 本權(quán)承澳求不僅限于描敘的宿主笛Origami(DE3)，也包括其他的表達(dá)宿主菌，如BL21、 BL21plus, BL21(DE3)plysS、 Origami(DE3) 、 Origami B(DE3)和 Origami(DE3脅sS。
4. 一種高表達(dá)分泌性人mt-PA的工程菌。其主要^在于a) .此工雜菌由本發(fā)明的權(quán)利要求第1、第2和第3項(xiàng)所述的表達(dá)質(zhì)粒和原 核細(xì)鑫感受,達(dá)宿主菌共同構(gòu)成的一個的系統(tǒng)工程菌；b) .此工藿菌分泌髙表達(dá)、有生物活性的人mt-PA蛋白到培養(yǎng)液。3
5. 權(quán)利要求4所述工程菌表達(dá)蛋白對治療急性心肌梗塞、腦血栓形成和肺梗塞 等相關(guān)疾病齣翻劑中的用途。
6. 除本發(fā)明新述mt-PA外，包含mt-PA的突變體K2S(由Kringle2和絲氨酸蛋 白酶,p區(qū)綴成)及其變構(gòu)衍生物、尿激酶及其變構(gòu)衍生物和其他有藥用價值的基 因在本發(fā)明^t利要求第2和第3項(xiàng)所述的表達(dá)質(zhì)粒和原核細(xì)胞宿主菌共同構(gòu)成 的一個的,DsbC或無信號肽DsbC感受態(tài)原核表達(dá)菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種高表達(dá)含多個二硫鍵的非糖大分子蛋白質(zhì)或糖基對其功能無重要影響的蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。更具體的是用于表達(dá)有生物活性的突變型人纖維蛋白溶酶元激活劑(mt-PA)的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其主要特征為1)突變型人纖維蛋白溶酶元激活劑表達(dá)序列(mt-PA)；2)構(gòu)建由阿拉佰糖(arabinose)操縱子P_BAD啟動子和其調(diào)控基因araC組成的表達(dá)調(diào)控元件的、含有細(xì)菌OmpA分泌信號肽的原核表達(dá)載體及其表達(dá)mt-PA的表達(dá)質(zhì)粒；3)構(gòu)建同分異構(gòu)酶DsbC或無信號肽DsbC的表達(dá)質(zhì)粒；4)表達(dá)質(zhì)粒mt-PA和DsbC或無信號肽DsbC的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化trxB/gov突變的感受態(tài)宿主菌，構(gòu)建成高水平表達(dá)、有生物活性的分泌型人mt-PA工程菌。
文檔編號C12N15/63GK101225398SQ20071002637
公開日2008年7月23日 申請日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日
發(fā)明者朱雅南, 王尚武 申請人:王尚武;朱雅南