專利名稱：：淺色黃姑魚生長激素基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生長激素基因序列，尤其涉及一種淺色黃姑魚生長激素的基因序列。
背景技術(shù)：
：生長激素(growthhormone,GH)是包括魚類在內(nèi)的所有脊椎動物腦下垂體分泌的一種單鏈多肽激素。生長激素屬于GH/PRL/SL家族(superfamily)。生長激素(CH)是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)素，能影響幾乎所有的組織類型和細(xì)胞，包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)，其主要生理功能是刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長和分化；調(diào)理蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝[33]。GH發(fā)揮作用主要通過兩種方式一是誘導(dǎo)肝細(xì)胞等產(chǎn)生GH介質(zhì)，因其結(jié)構(gòu)和功能與胰島素相似，又稱"胰島素樣生長因子"(insulinlikegrowthfactor,IGFs)，再由IGFs間接起作用；二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無論哪一種方式GH都需要首先與GH結(jié)合蛋白(GHbindingprotein)結(jié)合，通過GHBP與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，再由受體介導(dǎo)產(chǎn)生生物效應(yīng)。GH是目前研究最為深入的一種腦垂體激素，能增強(qiáng)食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率，加速魚體的生長發(fā)育，被認(rèn)為是最有效的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類生長促進(jìn)因子。然而，魚類體內(nèi)天然激素含量極低，分離純化比較困難，成本較高，不可能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來，基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和日臻完善為大量生產(chǎn)廉價的魚類激素提供了保證。生長激素在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上具有重大的作用，因而得到人們越來越普遍的重視?？寺〖氨磉_(dá)魚類生長激素基因無論在科學(xué)研究還是在生產(chǎn)應(yīng)用上均具有重要的意義。淺色黃姑魚(M6eaco/6oaO俗名白奈，隸屬于鱸形目(Perciformes)，石首魚科(Sciaenidae)，黃姑魚屬[1]，是近幾年才發(fā)展起來的新的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖優(yōu)良品種之一。該魚肉質(zhì)細(xì)嫩，口感獨(dú)特，味道鮮美，尤其是其魚鰾所制的魚膠滋補(bǔ)養(yǎng)顏。"白奈魚膠"的藥用及營養(yǎng)價值僅次于金錢鯢，市場價格極高。隨著淺色黃姑魚的食用和藥用價值逐漸為消費(fèi)者所認(rèn)識和接受，成品魚國內(nèi)外市場上的需求將呈現(xiàn)多元化及逐步擴(kuò)大的趨勢。但目前對淺色黃姑魚的研究僅局限在生物學(xué)特性和人工繁殖技術(shù)方面，而對其生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究則還沒有涉及。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種淺色黃姑魚的生長激素基因序列，為淺色黃姑魚的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的理論依據(jù)。根據(jù)已知魚類GH基因的保守序列，設(shè)計合成簡并引物，采用同源克隆的方法，從淺色黃姑魚肌肉基因組DNA中擴(kuò)增到GH基因的中間片段；利用己克隆的中間片段，設(shè)計特異引物，利用單引物PCR和巢式PCR相結(jié)合的方法(也稱染色體步移法)，獲得了GH基因5'端和3'端的序列。通過序列拼接，獲得淺色黃姑魚GH基因全長序列，共3022bp，包括5'端的非編碼區(qū)和啟動子區(qū)域586bp和3'端非編碼區(qū)537bp。淺色黃姑魚GH基因含6個外顯子(分別為10bp、134bp、117bp、144bp、147bp、63bp)和5個內(nèi)含子(分別為378bp、416bp、324bp、85bp、81bp)，其開放閱讀框(0RF)共計615bp，編碼204個氨基酸殘基。同鮭科魚類和鱸形亞目魚類一樣都含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，比哺乳類GH基因多出一個外顯子和一個內(nèi)含子。5'端啟動子區(qū)域有Pit-la、Oct-1、NF-1、Spl、TBP、ICSBP、C/EBPa和MyoD等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，3'端有典型的加尾信號AATAAA。利用SSRHunter軟件分析，發(fā)現(xiàn)淺色黃姑魚的基因組GH中有2個微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別是(ATTG)12和(AC)5序列。淺色黃姑魚GH基因的5個內(nèi)含子都起始于GT，終止于AG，符合內(nèi)含子共同剪接位點(diǎn)序列(Breathnachandchambon,1981)。轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG上游87bp以內(nèi)含有TATA盒；3'端非編碼區(qū)有典型的加尾信號AATAAA。根據(jù)淺色黃姑魚GH基因序列，設(shè)計特異性引物，以淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫為模板，經(jīng)PCR篩選，獲得其GH基因的cDNA序列，長629bp，其開放閱讀框(ORF)為615bp，可以翻譯成由204個氨基酸殘基組成的前體蛋白，分子量約為23.04kDa，理論等電點(diǎn)約為7.79，利用軟件SignalP分析顯示淺色黃姑魚GH氨基酸序列前17個氨基酸是信號肽，經(jīng)轉(zhuǎn)膜剪切后形成187個氨基酸的成熟肽。淺色黃姑魚GH包含4個半胱氨酸殘基(分別位于第69、177、194、202位)，可以形成2個二硫鍵。另外，淺色黃姑魚GH的前體氨基酸序列只存在一個潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Thr)。同源性分析表明，該基因與同科的紅擬石首魚(5^'3e/7叩soceW""s，AF065165)和大黃魚(/^e"^ww'朋/7acrocea,AF231941)的GHcDNA序列的同源性最高，達(dá)到95%。而淺色黃姑魚GH前體氨基酸序列與紅擬石首魚(5Wae/70Aoce^st"s，AAF61751)和大眼鱖(5Yw'percaAyew'，AAP82460)的GH前體氨基酸序列同源性最高，為98%(le-106)。由于魚類生長的快慢與其體內(nèi)的生長激素水平緊密相關(guān)，通過增加魚體內(nèi)生長激素的含量可以促進(jìn)魚體的生長。為淺色黃姑魚的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的理論依據(jù)，本研究開展淺色黃姑魚的生長發(fā)育相關(guān)基因的研究具有科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價值。圖1是引物F1+R3的PCR擴(kuò)增結(jié)果；M:100bpDNAmarker;1:PCRproduc圖2是引物F2+R3的PCR擴(kuò)增結(jié)果；M:謂bp腿marker;1:PCRproduct圖3是引物F2+R3的菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果；M:lOObpDNAMarker;1-8:PCRproduct;圖4是引物5-GH-F與R3、R4的PCR擴(kuò)增電泳圖；M:腦bpDNAMarker;1:PCRproductwith5~GH-FandR4primes;2:PCRproductwith5~GH—FandR4primes;圖5是GH基因5'端序列克隆菌落PCR檢測電泳圖；左面弓胸R4+AP，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1-10;右面弓物R4+5"GH-FW，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1-10;圖6-(a)是3-GH-F1+R1的PCR擴(kuò)增，電泳圖；M:勵pDNAMarker;1:PCRproductwith3~GH-FlandRlprimes;圖6-(b)是3-GH-F2+R1的PCR擴(kuò)增，電泳圖；M:腿pDNAMarker;1.PCRproductwith3~GH_F2andRlprimes;圖7是GH基因3'端序列克隆PCR產(chǎn)物電泳圖；M:扁bp腿marker;1,2:PCRproducts;圖8是GH基因3'端序列克隆菌落PCR檢測電泳圖；上行弓嫩3~GH-F2+R1的PCR產(chǎn)慨下行引物3-"GH-F2+AP的PCR產(chǎn)物；圖9是淺色黃姑魚GHcDNA序列篩選電泳圖；M:勵pDNAmarker;1:PCRproduc;圖10是淺色黃姑魚GH陽性克隆PCR電泳圖；M:100bpDNAmarker;1~5:PCRproductsfromclones。具體實(shí)施方式一、淺色黃姑魚DNA的提取DNA提取的方法有很多種，具體的內(nèi)容可參考分子克隆(第三版)。下面是本實(shí)驗(yàn)從淺色黃姑魚的肌肉組織中提取DNA的方法。具體操作如下(l)取0.3g左右肌肉組織剪碎于2mlEP管中，加DNA消化緩沖液SNET500pL，20mg/ml的蛋白酶K10nL，10%SDS5(^L，混勻反應(yīng)液，放振蕩恒溫箱中55。C消化約2_3小時。(2灘化完全后，加等體積的用0.1mol/LTris-Cl(pH8.0)平衡過的苯酚。將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上，使離心管緩慢顛轉(zhuǎn)10min以溫和地混合兩相。然后，10000g離心15min。(3)取上清，加等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，密閉管口，緩慢顛轉(zhuǎn)10min以溫和地混合均勻。然后，10000g離心15min。(4)取上清，加等體積的氯仿異戊醇(24:1)，緩慢振蕩10min，再10000g離心20min.。(5)取上清，并加入2.5倍體積的無水乙醇，室溫沉淀DNA15min以上。然后，4'C,12000g離心15min收集沉淀的DNA。(6)除去上清液。將DNA沉淀浸于lml70X的乙醇里。除去70%的乙醇，室溫下空氣中干燥沉淀約1520min。(7)加入100nL無菌水溶解沉淀DNA。(8)取34nLDNA液在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察其提取DNA質(zhì)量。二、淺色黃姑魚GH基因基因組序列的克隆1引物設(shè)計魚類GH基因具有較高的保守性，根據(jù)與淺色黃姑魚親緣關(guān)系較近的斜帶石斑魚(五/z"e//7e/w;sco/o/flfe^AY038606)、紅擬石首魚(5Wae"o;woce〃ato，AF065165)和大黃魚(i^ewAwdae"acrocea，AF231941)GH基因序列，綜合比較其他魚類的GH基因序列的同源性，設(shè)計二對簡并引物，用于擴(kuò)淺色黃姑魚GH基因序列的中間片段，引物序列如下Fl:5-GCTGTCGGTGCTG(A/T)CT(T/C)TGG-3Rl:5-CCAC(C/T)GTCAGGTAGGTCTCC-3F2:5'-AGTTCAACACCTCCACCTGCTCGCT-3'R2:5-GAGCAGAACC(T/G)CAG(A/C)CAGA-3根據(jù)已克隆測序的淺色黃姑魚GH基因中間片段序列，設(shè)計三條特異引物，引物序列如下F3:5-GAGGAACAGCGTCAACTCAACAA-3F4:5-GTTCTGAAGCTGCTGTCCATC-3R3:5-GTCAATCGGACTGATGATGTAAT-32GH基因中間序列的克隆2.1PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計的三條特異引物連同二對簡并引物，分別用不同組合配對的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以F1和R3引物為例，淺色黃姑魚DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立如下反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min;以下35個循環(huán)94°C30s，59°C30s,72°C3min;72'C延伸lOmiii，最后4'C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠檢測。其它引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增也同上述一樣的反應(yīng)體系，只在反應(yīng)程序的退火溫度上和引物上稍有不同。2.2PGR產(chǎn)物凝膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離。割膠回收跟預(yù)期估計大小相近的片段。方法參照DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)使用說明書進(jìn)行(1)使用0.5XTBE制作的1.2%瓊脂糖凝膠對目的DNA進(jìn)行電泳分離。(2)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體。(3)稱量凝膠重量，計算膠塊體積。以lmg重量換算成lpL計算。(4)根據(jù)凝膠濃度，按下表所提供的參數(shù)加BufferDE-A:凝膠濃度BufferDE-A體積<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)均勻混合后于75'C加熱，每隔23分鐘混合一次，直至凝膠塊完全融化。(6)按BufferDE-A體積的50%加入BufferDE-B,均勻混合。當(dāng)回收的DNA片段小于500bp時，應(yīng)再加入終濃度為20%的異丙醇。(7)將試劑盒中DNA-prepTube按置于2mlMicrofiigeTube中，將步驟6中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500卬m)離心1分鐘。(8)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicroftigeTube中，加入500pLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘。(9)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofUgeTube中，加入700pL巳加無水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘，以同樣的方法再用700^LBufferW2洗滌一次。(10)將DNA-prepTube置于1.5ml離心管中，1200Xg離心1分鐘。(11)將DNA-prepTube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入2530pLEluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。1200Xg離心1分鐘洗脫DNA。2.3PCR產(chǎn)物連接采用T-A克隆法。此方法是利用普通DNATaq酶在PCR擴(kuò)增過程中，以非模板依賴方式在擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端加脫氧腺苷(A)的特性，使PCR產(chǎn)物在3'端多出一個未配對的堿基A。利用線性化的T載體3，端凸出一個脫氧胸苷(T)的特性，在T4DNA連接酶作用下，將PCR產(chǎn)物與T載體相連，形成重組載體。參照T載體使用說明書，建立如下連接反應(yīng)體系_連接反應(yīng)體系__<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>終體積10&將上述反應(yīng)混合物混勻后，置于PCR儀中16'C連接過夜。2.4轉(zhuǎn)化2.4.1￡co〃(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)(1)從經(jīng)37。C培養(yǎng)16-20h的新鮮平板上，用無菌牙簽挑取一白色單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37。C搖菌過夜(200300轉(zhuǎn)/分)。第二天按l:100比例取過夜的菌液500nL加入50mlLB培養(yǎng)基中，37。C劇烈搖菌2-3h(300轉(zhuǎn)/分)，待OD,值約為0.3~0.4時，停止培養(yǎng)。(2)將細(xì)菌轉(zhuǎn)入一50mL無菌離心管中，冰浴10min。(3)4000xg，4'C離心10min，回收細(xì)菌，用10mL冰冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀細(xì)胞。(4)4000xg，4。C離心10min，回收細(xì)菌，沉淀重懸于2mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2中。(5)于4"貯存?zhèn)溆?，或?0%的滅菌甘油，于-7(TC凍存。2.4.2連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(化學(xué)轉(zhuǎn)化)(1)取DH5a感受態(tài)細(xì)胞200置于冰上，加入5~10連接產(chǎn)物，輕旋混勻。(2)置冰上放置30min，其間輕輕搖動2~3次。(3)迅速于42。C水浴中熱激90s，再迅速置冰上冷卻2-3min。(4)加入800pLLB培養(yǎng)基，37°C,150rpm輕搖培養(yǎng)45-60min。(5)5000rpm離心2min,回收細(xì)胞，用100-200LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，均勻涂布于含有100嗎/mLAmp的選擇培養(yǎng)基平板上(含有5pLIPTG(200mgmL")和50pLX-gal(20mg'mU1))上，將平板放于37'C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。2.5菌液PCR鑒定用滅菌牙簽隨機(jī)挑取單菌落，接種于含有100pg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200300ipm搖菌培養(yǎng)34小時后，直接取菌液進(jìn)行PCR鑒定。用25pL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序同2.2.2對應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序。PCR反應(yīng)體系lOxfixr叫Buffer(Mg2+Plus)2.52.5mMdNTPMixture10pMFl引物0.5|xL10pMR3引物O單菌液1.0^ddH2018.375pLMai"￡x(5U/pL)0.125nL終體積25(jL擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.6序列測定將PCR鑒定為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，選送上海聯(lián)合基因科技有限公司用AB3730自動測序儀進(jìn)行序列測定。3GH基因5'端和3'端序列的克隆為了取得淺色黃姑魚GH基因的5'端和3'端序列，采用染色體步移法，根據(jù)上述己取得的中間序列，設(shè)計合成基因特異性引物(見表3-l)。在第一輪擴(kuò)增反應(yīng)中利用基因特異性引物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增；然后為了引入接頭引物，進(jìn)行加尾反應(yīng)；在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中利用嵌套特異性引物和錨式引物AAP(見表3-l)，以加poly(C)尾的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.1引物設(shè)計根據(jù)己測定的淺色黃姑魚GH基因的中間序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計，并由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成基因特異性引物、AAP與通用接頭引物Adaptorprimer見表3-1。表3-l實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Tab.3-1Oligonucleotideprimersusedinexperiments引物名稱name引物序歹寸sequence(5，—3，)用途5-GH-FW5-GATGGTGCTACGGAGAAGTCAG國3前三條用于GHR3(前已設(shè))GTCAATCGGACTGATGATGTAAT5'端序列的擴(kuò)增R4TCTGAGCGAGCAGGTGGAGGTGT3-GH-F1GCTGGCTCCGTATGGGAACT中間三條用于3-GH-F2CGAGTCGCTGAGACGAACCT3'端序列的擴(kuò)增Rl(前已設(shè))CCAC(C/T)GTCAGGTAGGTCTCCAAPGGCCACGCGTCGACTAGTACGi6后三條用于設(shè)計接Oligo(dT)n-adapterGGCCACGCGTCGACTAGTACT17頭引物AdaptorprimerGGCCACGCGTCGACTAGTAC3.2GH基因5'端序列擴(kuò)增3.2.1PCR擴(kuò)增為了檢測設(shè)計的特異引物的可用性。以淺色黃姑魚DNA為模板，以R3與5-GH-FW和R4與5-GH-FW為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x五;cr"《Buffer(Mg2+)5|jL2.5mMdNTPMixture4pL10一R3或R41.010|xM5-GH-FW1,0DNA模板1.0ddH2037.75^L五x7^(5U/(xL)0.25pL終體積50反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性4min;以下35個循環(huán)94°C30s，58°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4匸保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.2.2單引物PCR擴(kuò)增以淺色黃姑魚DNA為模板，以R3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x五jc7hBuffer(Mg。52.5mMdNTPMixture4^iL10|iMR31.0DNA模板1.0ddH2038.75^LraA:aia五jcTa《(5U/pL)0.25|xL終體積_50pL反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min;以下35個循環(huán)94°C30s，52°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4'C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.2.3PCR產(chǎn)物直接純化回收直接取PCR產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒(V-gene)純化回收。具體操作步驟參照PCR清潔試劑盒說明書進(jìn)行，其步驟如下1)在PCR反應(yīng)液中，加入3個體積的BufferPCR-A，若需加的BufferPCR-A不足lOOpL，則加入100|aLBufferPCR-A。2)將DNA-prepTube置于2mlMicrofogeTube中，將步驟1中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘。3)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2mlMicrofogeTube中，加入500(aLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘。4)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2mlMicroAgeTube中，加入700pL已加無水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘，以同樣的方法再用700ulBufferW2洗滌一次。注意確認(rèn)在BufferW2中巳按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇。1)將DNA-prepTube置于1.5ml離心管中，12000Xg離心1分鐘。2)將DNA-prepTube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入2530pLEluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。12000Xg離心1分鐘洗脫DNA。3.2.4加尾反應(yīng)在冰上向微量離心管中加入以下成分PCR產(chǎn)物加尾反應(yīng)體系DEPC-treatedWater6.5TerminalTransferase5xBuffer52mMdCTP2.5jxL純化的PCR產(chǎn)物_10總體積24^輕柔混勻，于PCR儀上94。C孵育23min，立即于冰上冷卻2min，簡短離心后置于冰上，加入lpL末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)，輕旋混勻，置于PCR儀上37t:孵育60min，接著7(TC加熱10min終止反應(yīng)，簡短離心后產(chǎn)物貯于-20'C備用。3.2.5第二次PGR擴(kuò)增以加poly(C)尾的PCR產(chǎn)物為模板，建立以下反應(yīng)體系，包括_第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10x￡x7^Buffer(Mg2+)2.5mMdNTPMixture10|iMAAP10pMR45.0pL4.0pL1.0|xL1.0pL加Poly(C)尾的PCR產(chǎn)物1.0nLddH2017.3pL￡x~(511批)_0.2|xL終體積25PCR反應(yīng)參數(shù)為94t:預(yù)變性5min;以下35個循環(huán)94。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸5min;循環(huán)結(jié)束后72'C延伸10min，最后4"C保溫。取510pLPCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增效果。此PCR產(chǎn)物作為連接PCR產(chǎn)物。3.2.6PGR產(chǎn)物割膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離。割膠回收跟預(yù)期估計大小范圍相近的一段膠。方法參照DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)使用說明書進(jìn)行，方法同2.2。3.2.7連接、轉(zhuǎn)化涂平板方法步驟同2.3與2.4。3.2.8克隆PGR擴(kuò)增檢測隨機(jī)挑取幾個單菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，直接取菌液進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增鑒定。第一次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，R4+AAP為引物，檢測插入片段的大小。反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)程序同3.2.5。第二次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，以5-GH-FW+R4為引物，檢測插入片段是否為目的片段。反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)程序同3.2.1。3.2.9序列測定和分析選兩次PCR鑒定均為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海聯(lián)合基因科技有限公司用AB3730自動測序儀進(jìn)行序列測定。在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/上對序列進(jìn)行Blastn進(jìn)行分析。3.3GH基因3'端序列的克隆3.3.1PCR擴(kuò)增為了檢測設(shè)計的特異引物的可行性。以淺色黃姑魚DNA為模板，以R1與3-GH-F1和Rl與3-GH-F2為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x五x7i^Buffer(Mg2+)5nL2.5mMdNTPMixture爭10pM3-GH-F1或3-GH-F21.0pLIO一RI1.0DNA模板1.0pLddH2037.75pL7hXaifl￡xrfl《(5U/nL)0.25pL終體積50nL反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性4min;以下35個循環(huán)94°C30s，52°C(或57。C)30s，72。C4min;72。C延伸10min，最后4"C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.3.2單引物PCR擴(kuò)增以淺色黃姑魚DNA為模板，以3-GH-Fl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x五x7i^Buffer(Mg2+)5(iL2.5mMdNTPMixture4|iL10nM3-GH-Fl1.0DNA模板1,0ddH2038.75pL￡jcT^(5U/nL)0.25nL終體積50nL反應(yīng)參數(shù)為94"C預(yù)變性5min;以下35個循環(huán)94°C30s，52°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4'C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.3.3PCR產(chǎn)物直接純化回收方法步驟同3.2.3。3.3.4加尾反應(yīng)方法步驟同3.2.4。3.3.5第二次PCR擴(kuò)增以加poly(C)尾的PCR產(chǎn)物為模板，建立以下反應(yīng)體系，包括第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10x五jc7i^Buffer(Mg2+)5.0^2.5mMdNTPMixture4.0&lO^MAAP1.0^10^M3-GH陽F21.0加Poly(C)尾的PCR產(chǎn)物1.0ddH2037.75(iLMaia￡x7i^(5U/nL)0.25^終體積50PCR反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性5min;以下40個循環(huán)94。C變性30s，56。C退火30s，72。C延伸5min;循環(huán)結(jié)束后72。C延伸10min，最后4'C保溫。取510pLPCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增效果。此PCR產(chǎn)物作為連接PCR產(chǎn)物。3.3.6PCR產(chǎn)物割膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離。割膠回收跟預(yù)期估計大小范圍相近的一段膠。方法參照DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)使用說明書進(jìn)行。方法同2.2。3.3.7連接、轉(zhuǎn)化涂平板方法步驟同2.3、2.4。3.3.8陽性克隆檢測隨機(jī)挑取幾個單菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，直接取菌液進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增鑒定。第一次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，3-GH-F2+AAP為引物，檢測插入片段的大小。反應(yīng)體系為25pL，反應(yīng)程序同3.3.5。第二次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，以3-GH-Fl+Rl為引物，檢測插入片段是否為目的片段。反應(yīng)體系為25piL，反應(yīng)程序3.3.1。3.3.9序列測定和分析PCR鑒定均為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海聯(lián)合基因科技有限公司用3730自動測序儀進(jìn)行序列測定。在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/對序列進(jìn)行Blastn進(jìn)行分析。4淺色黃姑魚GH基因全長序列的拼接運(yùn)用CLUSTAL軟件，將所得的五段DNA序列進(jìn)行比對拼接為一條完整的DNA序列，即為GH基因組全長DNA序列。圖1是淺色黃姑魚GH基因全長拼接圖。5色黃姑魚GHcDNA序列的獲得5.1引物設(shè)計根據(jù)拼接的淺色黃姑魚GH基因序列設(shè)計一對特異引物，以其來擴(kuò)增GHcDNA的全長序列，設(shè)計的引物序列如下qcGH-Fl:5-ACCAGACCAGCCATGAACA隱3qcGH-Rl:5陽GGCTACAGCGTGCAGTTG-35.2淺色黃姑魚GHcDNA的PCR擴(kuò)增淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫總菌液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x五jc7i^Buffer(Mg2+)5|jL2.5mMdNTPMixture10(xMqcGH-Fl1.0^10拜qcGH-Rl1.0cDNA文庫總菌液1.0pLddH2037.75pL7a扁fl5jcr叫(5U4iL)0.25pL終體積50}xL反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性5min;以下前5個循環(huán)94°C30s，50°C30s，72°Clmin;72。C延伸3min，再反應(yīng)35個循環(huán)94°C30s，58。C30s,72°Clmin;72。C延伸10min，最后4'C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.3PCR產(chǎn)物凝膠回收方法步驟同2.2。5.4連接、轉(zhuǎn)化方法步驟同2.3和2.4。5.5菌液PCR鑒定陽性克隆用滅菌牙簽隨機(jī)挑取單菌落，接種于含有100pg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200300rpm搖菌培養(yǎng)34小時后，分別直接取菌液進(jìn)行PCR鑒定。25^L反應(yīng)體系如下反應(yīng)程序同GH基因cDNA序列PCR擴(kuò)增，本節(jié)的2.3.2。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.6序列測定和序列分析將菌液PCR鑒定為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海聯(lián)合基因科技有限公司用AB3730自動測序儀進(jìn)行序列測定。http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/對序列進(jìn)行blastn對序列進(jìn)行比對分析、ClustalX1.83對脊椎動物中GH前體的氨基酸序列進(jìn)行比對、Mega2.0軟件對它們進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析、DNAstar對各序列同源性進(jìn)行計算。6結(jié)果6.1GH基因中間序列的PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計的兩條特異引物連同前面第一節(jié)設(shè)計的簡并引物，分別用不同組合配對的引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中以F1和R3，F(xiàn)2禾QR3，F(xiàn)3和R2以及F4和Rl為引物時分別可以擴(kuò)增出與預(yù)期目的片段大小一致的產(chǎn)物。例如圖l、2是引物F1和R3與引物F2和R3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。通過割膠純化回收，連接PMD18—T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌，LB平板選擇培養(yǎng)，隨機(jī)挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR檢測。其中，引物F2+R3的菌落PCR檢測結(jié)果如圖3所示。最后選菌液送上海聯(lián)合基因科技有限公司測序。通過序列分析得到，F(xiàn)l+R3擴(kuò)出634bp(圖l)，含第二內(nèi)含子416bp;F2+R3獲得520bp(圖2)，在F1+R3區(qū)域內(nèi)，包含第二內(nèi)含子416bp;F3+R2獲得504bp，包括第三內(nèi)含子324bp;F4+R1獲得500bp，包含第四和第五內(nèi)含子，分別為85bp和81bp。6.2GH基因5'端序列的擴(kuò)增首先以特異引物5-GH-FW與兩個反向特異引物R4、R3分別以淺色黃姑魚DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳結(jié)果見圖4。從圖中可知，在58t:退火溫度下都可擴(kuò)出與預(yù)期目的片段大小相一致的條帶，其中5-GH-FW和R3的PCR產(chǎn)物大小約760bp，而與R4的PCR產(chǎn)物大小在240bp左右。然后以R3為引物，淺色黃姑魚DNA為模板進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增。一般情況下，都看不見其PCR產(chǎn)物的特異性亮帶，用PCR純化試劑盒直接回收其PCR產(chǎn)物。為了引入5'端的接頭引物，進(jìn)行Poly(C)的加尾反應(yīng)，然后采用嵌套引物R4和接頭引物AAP，PCR反應(yīng)體系10x^jc7i^Buffer(Mg2+)2.5mMdNTPMixture10nMqcGH-Fl10pMqcGH隱Rl各菌液ddH202.50.5nLO單1.018.375pL0.125^L以加尾產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。從電泳結(jié)果來看，PCR產(chǎn)物呈一片彌散，將與預(yù)期大小片段相近的一段彌散帶割膠回收，在本實(shí)驗(yàn)中割取900bp2000bp之間的凝膠帶回收。連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇性平板上獲得許多個分離良好的白色菌落。隨機(jī)挑取10個單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增篩選。分別以R4和通用引物AP或AAP與5-GH-FW和R4為引物，直接以各個菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示。從圖可知，插入T載體的目的片段大小不一，而5-GH-FW和R4為引物的PCR擴(kuò)增，其相對應(yīng)的克隆中只有l(wèi)、5、8號克隆可檢測到240bp的目的片段。綜合此兩次的PCR篩選結(jié)果，可以初步預(yù)測5和8號的克隆所插入的片段是淺色黃姑魚GH基因的5'端的序列。不過，為了最大可能的獲得GH基因5'端的序列信息，我們選插入片段最大的克隆PMD18-T-GH5，送上海聯(lián)合基因科技有限公司3730測序。利用網(wǎng)站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/上的blast軟件分析，結(jié)果與其他鱸形目魚類GH基因的序列有很高的同源性。經(jīng)DNA序列分析，確認(rèn)此為淺色黃姑魚的GH基因5'端序列，其大小為1091bp，含轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG，并且發(fā)現(xiàn)TATA盒。起始密碼子ATG上游還有586bp。6.3GH基因3'端序列的擴(kuò)增按前述方法，同5'端序列的獲得方式。首先用引物Rl分別與3-GH-F1和3-GH-F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出201bp和159bp的片段，其電泳結(jié)果如圖6(a、b)所示。說明所設(shè)計的引物沒有問題，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后，用特異引物3-GH-Fl做單引物PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物用PCR試劑盒直接純化回收，根據(jù)Poly(C)加尾反應(yīng)說明書進(jìn)行加尾反應(yīng)。再用嵌套PCR引物3-GH-F2和AAP，以加尾產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在UV/EB下觀察，呈現(xiàn)一片彌散，割取在900bp2000bp之間的彌散帶回收(見圖7,2號泳道)，構(gòu)建克隆載體PMD18-T-3-GH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇平板上獲得許多個分離良好的單個白色菌落，隨機(jī)挑取10個白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)兩次菌落PCR鑒定，電泳結(jié)果如圖8所示。從圖可以看出，兩次PCR擴(kuò)增都可擴(kuò)出目的片段的是克隆1、2、3、6、7、8和9共7個。其中pMD18-T-3-GH2克隆插入片段偏小，而pMD18-T-3-GH3克隆好像是在一個克隆中插入了兩個目的片段。最后，在剩下的5個陽性克隆中，選取插入片段大的陽性克隆pMD18-T-3-GH7，送上海聯(lián)合基因科技有限公司測序。圖8，是菌落PCR鑒定結(jié)果，從圖上可見用菌液作模板，以3-GH-F2和AP為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的片段大小不一，這是由于割膠回收的是一片彌散帶，因其中包含許多大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物所造成的，選取插入片段最大的克隆去測序，有利于獲得含有更多信息的目的序列。取片段長度大的陽性克隆pMD18-T-3-GH7，送上海聯(lián)合基因生物科技有限公司測序。利用http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析測定的序列，結(jié)果與其他魚類GH基因的序列同源性很高，可確定其為淺色黃姑魚的GH基因3'端序列，其大小約為739bp，含有轉(zhuǎn)錄終止密碼子TAA。6.4GH基因全長的拼接和序列分析運(yùn)用clustalX軟件將所得七段DNA序列進(jìn)行比對拼接為一條完整DNA序列，即為淺色黃姑魚GH基因序列。利用軟件BLAST與GenBank-EMBL中已知的GH基因序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果證實(shí)其為淺色黃姑魚GH基因。淺色黃姑魚GH基因脫氧核糖核苷酸序列及序列分析如SEQIDNO.1所述。淺色黃姑魚GH基因序列，全長共3022bp，包括5'端非編碼和啟動子區(qū)域586bp和3'端非編碼區(qū)537bp。淺色黃姑魚GH基因含6個外顯子和5個內(nèi)含子。其中第一外顯子10bp，編碼3個氨基酸殘基；第二外顯子134bp，編碼45個氨基酸殘基；第三外顯子117bp，編碼39個氨基酸殘基；第四外顯子144bp，編碼48個氨基酸殘基；第五外顯子147bp，編碼49個氨基酸殘基；第六外顯子63bp，編碼20個氨基酸殘基，其開放閱讀框(ORF)共計615bp，編碼204個氨基酸。而第一內(nèi)含子有378bp，第二內(nèi)含子416bp，第三內(nèi)含子324bp，第四內(nèi)含子85bp,第五內(nèi)含子81bp。同鮭科魚類和鱸形亞目魚類一樣都含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，比哺乳類GH基因多出一個外顯子和一個內(nèi)含子。淺色黃姑魚GH基因的5個內(nèi)含子都起始于GT，終止于AG，符合內(nèi)含子共同剪接位點(diǎn)序列(Breathnachandchambon,1981)。轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG上游87bp以內(nèi)含有TATA盒；3'端非編碼區(qū)有典型的加尾信號AATAAA。利用軟件SSRHunter分析發(fā)現(xiàn)，淺色黃姑魚GH基因的第三內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)一個重復(fù)12次出現(xiàn)的微衛(wèi)星序列(ATTG)!2;而在第四內(nèi)含子則有一個重復(fù)5次出現(xiàn)的微衛(wèi)星序列(AC)5o7、淺色黃姑魚GHcDNA序列的克隆7.1cDNA序列PCR擴(kuò)增根據(jù)已克隆的淺色黃姑魚GH基因序列設(shè)計一對特異引物qcGH-F和qcGH-R。引物qcGH-F和qcGH-R以淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫為模板，篩選得到約600bp的片段(見圖9)，與預(yù)計的產(chǎn)物片段長度相近，可預(yù)測己擴(kuò)增出目的片段，進(jìn)行下一步的克隆測序。按前述方法將PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，構(gòu)建克隆載體PMD18-T-qcGH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇平板上獲得若干個分離良好的單個白色菌落，隨機(jī)挑取5個白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定得到5個都是陽性克隆，如圖10所示。從圖上可見經(jīng)PCR擴(kuò)增都可得到約600bp的片段，分別命名為PMD18-T-GH1、PMD18-T-GH2、PMD18-T-GH3、PMD18-T-GH4和PMD18-T-GH5。選菌液PMD18-T-GH1和PMD18-T-GH3送上海聯(lián)合基因科技有限公司測序。7.2序列測定及分析取重組質(zhì)粒PMD18-T-GH1和PMD18-T-GH3進(jìn)行測序，其測序結(jié)果一致，說明在擴(kuò)增過程中未發(fā)生突變。由測序可知，該cDNA片段由629bp組成，與預(yù)計的目的片段大小一致。經(jīng)網(wǎng)上Blastn分析發(fā)現(xiàn)與其他物種的GH基因cDNA序列具有較高的同源性，確認(rèn)此為淺色黃姑魚GHcDNA序列。其脫氧核糖核苷酸序列及按三聯(lián)體密碼子推導(dǎo)出的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。淺色黃姑魚GHcDNA開放閱讀框(ORF)全長為615bp,編碼204個氨基酸殘基組成的前體多肽。該序列上有4個半胱氨酸殘基，分別位于第69、177、194、202位，可以形成2個二硫鍵。另外，淺色黃姑魚GH的前體氨基酸序列只發(fā)現(xiàn)一個潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Thr)，而鯉魚和鮭魚GH氨基酸序列有兩個潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser和Asn-Xaa-Thr)。序列表〈110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所〈120〉淺色黃姑魚生長激素基因序列〈160〉3<210>1<211麓2<212〉DNA〈213〉淺色黃姑魚(Nibeacoibor)<220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(3022)<220〉<221〉promoter〈222>(1)...(586)〈220〉<221〉TATA_signal<222>(500)...(506)<220>〈221〉exonl〈222〉(587)…(596)〈220〉〈221〉intronl〈222>(597)...(974)<220〉<221>exon2<222>(975)..(1108)〈220〉〈221〉intron2<222>(1109)...(1524)〈220>〈221〉exon3〈222>(1525)...(1640)<220>〈221〉intron3〈222〉(1641)...(1965)〈220〉〈221〉satellite〈222〉(1911)...(1958)〈220>〈221〉exon4<222〉(1966)...(2109)〈220〉〈221〉intron4〈222〉(2110)..(2194)<220>〈221>satellite<222〉(2116)...(2125)<220〉〈221〉exon5<222>(2195)...(2341)<220>〈221〉intron5<222〉(2342)...(2422)〈220〉<221>exon6〈222>(2423)...(2485)〈220〉<221>polyA—signal<222>(2547)...(2552)<400>1cgctgaataaattcagttttcggtgcgatgttcctgttaaatgtctaatc60gacagctgtgaataaat"tcaccaaacatctgttttctaacagttgatctg120acgtgagcagcatgtttcctctgattataaaaaacaaaacaatattcaaa180tatgtttatatttatatttaC3tatgttt3aaaatatatattcctgacagtgatgecaca240tctttttttagtttgtttgtcctcagtctaatcaggttcattttatstta300tacatacggtttatatgtttctatgtttctatgttttgaatatgtttgca360tUgtgttttttactgagctttcagtgtgttgttgttcagg卿cgtgtttgtaatattt420ctgcgctgtaatgtgaacac3CgC3C3C3Catgctcgtttcatgtttctcttcatcaatt480taatcatcaacttttcttcttgagttg犯aacatcacaaa540CCC3g3CCC3gaccctgaaccagaaccagaccagccatgaacagaig596MetAsnArggtaagacattcagactggttcatgtgttattattgatatg丄atgaagttatctatggtaaa656gggggacact已ccagaggaccgatcaggtctgageccaggtcagaaatct716gctggtggcagaagc犯ttagctgatgtagagegacteggatcaggactt776tattcaccagagcacta犯gaac￡i3cccttaatcagaatcctg鄉(xiāng)ctgttggcctcgtt836tcagacattaaaggatggtgctacag￡igaagtcagtgctgctagtactgaggacacatca896gEtaatg犯ccacccatgttccccatctgcttgtttgtctctcacctgtctatctgtctct956cacttgtctgtctctcagtgetcetcctgctgteggtgctgtctUgggtgtg畫ValLeuLeuLeuLeuSer，ValLeuSerLeuGlyVal51015tectctcagccaateacagacagecagcgtctgttctecategetgtg1057SerSerGinProlieThrAspSerGinArgLeuPheSerlieAlaVal202530ageagagttcaacacetccacctgetcgetcagagaetcttctecgac1105SerArgValGinHisLeuHisLeuLeuAlaGinArgLeuPheSerAsp354045tttgtaagtctacggcagctgtgatgattgatgataaaaaaaacgttgaaact1158Phetgagatttaactgaaagtagcacaaagacatctatacctgctgat犯caggctaagtggt1218tccat已ggacagttttccacttcacctcagtggtgaagtttgagctgtcattagtggagt1278gtgtgttggatgcttgctagaagtgttctcagcccatgcagtgattccca1338cg卿ggatcctgtctgtgtttgatgcactgctgtccgcagggtctgaacatcactgata1398ctgagctgttaaatctggagtttcagtgtttcatgtcagtttgtttctgtttcatacagt1458g鵬cgacctcctttgtgtataagaatgtgatttattgtgtgtatttctgtgtatgtgtt1518tgttaggagggctctctgcagacggaggaacagcgtcaaetcaacaaaate1569GluGlySerLeuGinThrGluGluGinArgGinLeuAsnLyslie505560ttcctgcaggatttctgcaactctgattacateateagtccgattgac1617PheLeuGinAspPheCysAsnSerAspTyrlielieSerProlieAsp657075aagcatgagacgcagcgcageteagtgagtacacacagtactacatgatactgc1671LysHisGluThrGinArgSerSer8085acacagtactacatgatgetgcacacagtactacatgatactgcacacagtactacatga1731tactacacacagtactacatgata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