專利名稱：一種溶癌病毒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及溶癌病毒及其制備方法，尤其涉及一種重組腫瘤特異的腫瘤壞 死因子相關凋亡誘導配體溶癌病毒及其制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是目前嚴重威脅人類生命健康的重要疾病之一。盡管手術、放療 和化療等傳統(tǒng)治療手段已經(jīng)有較大的發(fā)展，但大多數(shù)的晚期胂瘤患者仍死于癌 癥本身。常規(guī)化療雖然對惡性腫瘤有一定的療效，但多數(shù)肺瘤在多療程化療后 會出現(xiàn)因對化療耐藥而繼續(xù)發(fā)展而致命。所以，尋找新的治療手段和策略對提 高惡性腫'瘤的治療水平將非常必要和迫切。
月中瘤壞死因子相關凋亡i秀導配-體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL )是近年才發(fā)現(xiàn)的一個新的腫瘤壞死因子家力矣酉己 體。其因在體內(nèi)外試驗中有強大的抗腫瘤作用且無多藥耐藥性的特點而成為目 前腫瘤治療中的熱點之一。臨床前的研究已經(jīng)證實，TRAIL能誘導多種肺瘤細 胞的凋亡，瘤內(nèi)注射能抑制肺瘤的生長并延長動物肺瘤模型的生存期，并與多 種化療藥物如阿霉素、順鉑、CPT-11和放療均有很好的協(xié)同作用，甚至對耐化 放療的腫瘤仍然有4支好的療效，提示其為一種非常有前途的抗癌藥物。我們和 其他的研究結果表明，通過用腺病毒為載體，能很好地將TRAIL基因轉染入多 種腫瘤細胞表達膜連接的TRAIL而導致其凋亡。并因其產(chǎn)生膜連接的TRAIL 有旁觀者效應(bystander effect)從而明顯增強TRAIL的抗肺瘤活性，其抗癌活 性甚至強于可溶性的TRAIL。
研究證實，TRAIL對體外原代培養(yǎng)的人肝細胞和人的腦組織培養(yǎng)有嚴重的 毒性，從而引起了對TRAIL運用于臨床腫瘤治療的潛在毒性的擔憂。如何減少 TRAIL對這些器官的毒性將為TRAIL進入人體臨床研究掃清重要的障礙。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的是提供一種溶癌病毒及其制備方法， 解決腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體基因治療的相關毒性問題。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的溶癌病毒的技術方案為 一種溶癌病毒，其 組成成分包括腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)、人端粒酶逆轉錄酶啟 動子(hTERT)、腺病毒載體(Ad)和巨細胞病毒(CMV-E )。
所述溶癌病毒的構建形式為
0 13 l,S 鵬Map鵬k
本發(fā)明制備所述溶癌病毒的方法包括如下步驟 (1) TRAIL基因的擴增、克隆和測序根據(jù)GenBank報道的TRAIL基因的
序列及文獻報道設計合成引物，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收 純化，純化后的產(chǎn)物常規(guī)進行酶切養(yǎng)定和DNA序列分析；
(2 ) Ad/gTRAIL表達載體的構建hTERT靶向到TRAIL基因上。將純化的 TRAIL基因PCR產(chǎn)物片段，通過連接酶定向插入hTERT載體中，構建成 Ad/gTRAIL的腺病毒載體，再通過GAL4的調控子增強hTERT介導的 GFP/TRAIL融合基因的表達；
(3 ) Ad/gTRAIL表達載體與溶癌病毒載體的重組在Ad/gTRAIL的腺病毒 載體基礎上與溶癌病毒載體進行重組，組成一個新的病毒，稱之為重組腫瘤特 異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-E1 ); Ad/TRAIL-TEl進行進一步擴增純化后， 用紫外分光光度計測定純度并定量。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明成功構建了通過hTERT啟動子特異性表達TRAIL 蛋白的腺病毒載體(簡稱Ad/gTRAIL )。在初步的臨床前的研究中證實， Ad/gTRAIL有廣泛強大的抗腫瘤作用包括對耐化療的人類腫瘤有效，特別的是 對體外原代培養(yǎng)的人肝細胞、正常細胞和動物無毒性。而用非腫瘤特異性的CMV 或PGK-GV-16為啟動子的TRAIL,則產(chǎn)生了嚴重的肝毒性。說明hTERT能使 TRAIL靶向表達在腫瘤細胞，從而避免了其肝細胞毒性。在Ad/gTRAIL基礎上 與溶癌病毒載體進行重組，組成一個新的病毒，我們稱之為重組腫瘤特異的 TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-El )。新型Ad/TRAIL-El克服了 TRAIL基因進行 抗腫瘤治療效力較弱的特點，能夠在腫瘤細胞中進行自我復制，增加基因在腫 瘤細胞的拷貝數(shù)或是在腫瘤細胞中的表達水平，從而增強Ad/TRAIL-El的抗腫 瘤作用。


圖1是Ad/gTRAIL對人多種腫瘤細胞抹的強凋亡誘導作用示意圖；在圖1 中，H460:人非小細胞肺癌細胞抹；A549, H1299:人肺腺癌細胞林;DLD-1 :人結腸 癌細胞抹;Lovo:人大腸癌細胞林;PBS:磷酸鹽緩沖液;GFP:綠色熒光蛋 白；G-TRAIL:GFP-TRAIL融合基因；GT-TRAIL:GFP-hTERT-TRAIL融合基因。
圖2是Ad/gTRAIL對阿霉素耐藥的MDA-MB-231的良好抗腫瘤活性示意 圖；在圖2中，MDA-231:人乳腺癌細胞株；MDA-231/ADR:乳腺癌阿霉素耐藥 細胞株。
圖3是Ad/TRAIL--El病毒劑量與活性細胞的量效關系示意圖；在圖3中， A549,H1299:人肺腺癌細胞抹;H460:人非小細胞肺癌細胞抹；DLD-1:人結腸 癌細胞林；DLD-1/TRAIL-R:結腸癌TRAIL耐藥細胞抹；NHFB:人正常的內(nèi)皮 纖維細胞；Ad/CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病毒栽體；Ad/GFP-El:腺病毒載體； Ad/TRAIL-RGD: RGD修飾的腺病毒介導的TRAIL基因；Ad/TRAIL-El:重組腫 瘤特異性TRAIL溶癌病毒；MOI:感染復數(shù)。
圖4是Ad/TRAIL-El的對多種肺瘤細胞的殺傷作用以及對人正常纖維細胞 無明顯誘導凋亡作用示意圖；在圖4中，H460:人非小細胞肺癌細胞株；H1299: 人肺腺癌細胞抹；DLD1:人結腸癌細胞株；DLD1/TRAIL-R:結腸癌TRAIL耐 藥細胞抹；NHFB:人正常的內(nèi)皮纖維細胞；PBS:磷酸鹽緩沖液；Ad/CMV-GFP: 腺病毒/巨細胞病毒載體；Ad/GFP-El:腺病毒載體；Ad/TRAIL-RGD: RGD修飾 的腺病毒介導的TRAIL基因；Ad/TRAIL-El:重組腫瘤特異性TRAIL溶癌病毒。
圖5是Ad/TRAIL-El能夠在多種細胞內(nèi)進行自我復制以及在NHFB內(nèi)并無 復制作用示意圖；在圖5中，DLD1:人結腸癌細胞林；DLD1/TRAIL-R:結腸癌 TRAIL耐藥細胞林；Ad/GFP-El:腺病毒載體；Ad/TRAIL-El:重組腫瘤特異性 TRAIL溶癌病毒；H1299: AJ^腺癌細胞抹；NHFB:人正常的內(nèi)皮纖維細胞； Ad/GFP-El:腺病毒載體；Ad/TRAIL-El:重組肺瘤特異性TRAIL溶癌病毒。
困6是Ad/gTRAIL在乳腺癌荷瘤鼠體內(nèi)的抗胂瘤作用示意圖；在圖6中， MDA-MB-231:人乳腺癌細胞株；PBS:磷酸鹽緩沖液；Ad/CMV-GFP:腺病毒/ 巨細胞病毒載體；Ad/gTRAIL:腺病毒介導的TRAIL基因。
圖7是乳腺癌荷瘤鼠的生存情況示意圖；在圖7中，MDA-MB-231:人乳腺 癌細胞4朱；PBS:;疇酸鹽緩沖液；Ad7CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病毒載體； Ad/gTRAIL:腺病毒介導的TRAIL基因。
圖8是Ad/gTRAIL在耐ADR乳腺癌荷瘤鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用示意圖；在 圖8中，231/ADR:乳腺癌阿霉素耐藥細胞抹；Ad/CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病 毒載體；Ad/gTRAIL:腺病毒介導的TRAIL基因。
圖9是耐ADR乳腺癌荷瘤鼠的生存情況示意圖；在圖9中，231/ADR:乳 腺癌阿霉素耐藥'細月包抹；Ad/CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病毒載體；Ad/gT反AlL: 腺病毒介導的TRAIL基因。
圖10是Ad/gTRAIL聯(lián)合紫杉醇治療肺轉移瘤的情況示意圖；在圖IO中，
Ad/GFP: Ai病毒栽體；Paclitaxel:紫杉醇；Ad/gTRAIL:腺病毒介導的TRAIL 基因。
圖11是Ad/gTRATL-El抑制棵鼠體內(nèi)腫瘤的生長示意圖；在圖11中，PBS: 磷酸鹽緩沖液；Ad/CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病毒載體；Ad/GFP-El:重組腺病 毒載體;Ad/TRAIL-RGD: RGD修飾的腺病毒介導的TRAIL基因；Ad/TRAIL-El: 重組肺瘤特異性TRAIL溶癌病毒。
圖12是不同組別間荷瘤鼠的生存情況示意圖；在圖12中，PBS:磷酸鹽緩 沖液;Ad/CMV-GFP:腺病毒/巨細胞病毒載體；Ad/GFP:腺病毒載體；Ad/GFP-El: 重組腺病毒載體；Ad/TRAIL-RGD: RGD修飾的腺病毒介導的TRAIL基因； Ad/TRAIL-El:重組腫瘤特異性TRAIL溶癌病毒。
具體實施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過反復研究試驗，證實預防TRAIL對正常細胞的毒性，
需將TRAIL正-i把向腫瘤。目前已證實人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTtRT)'可
被用來靶向腫瘤的促凋亡基因，hTERT在85%以上的人類腫瘤中表達，而在大
多數(shù)體細胞中處于靜止狀態(tài)。因此，將hTERT靶向到TRAIL基因上，能解決
TRAIL基因治療的相關毒性問題。據(jù)此，本發(fā)明的重組胂瘤特異的TRAIL溶癌
病毒(Ad/TRA1L-El )的成分包括腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL )、
人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTERT )、腺病毒栽體(Ad)和巨細胞病毒(CMV-E )。
該重組腫瘤特異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-El )的構建形式為
<image>image see original document page 8</image>
同時，制備上述溶癌病毒的方法包括如下步驟
(1 ) TRAIL基因的擴增、克隆和測序根據(jù)GenBank報道的TRAIL基因的 序列及文獻報道設計合成引物，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收 純化，才純化后的產(chǎn)物常規(guī)進行酶切鑒定和DNA序列分析。
(2 ) Ad/gTRAIL表達載體的構建通過腺病毒介導的基因治療方法將TRAIL 直接導入腫瘤細胞，可以誘導腫瘤凋亡和抑制腫瘤生長，而沒有被導入目的基 因的腫瘤細胞也會通過旁路效應被殺死。由于TRAIL的主要缺點是它的治療相 關毒性，限制了 TRAIL在腫瘤治療中'的應用，'目前我們可通過腫瘤特異性啟動 于華巴向基因表達來克服這一缺點，將hTERT耙向到TRAIL-基因上，'解決了 TRAIL基因治療的相關毒性問題。將純化的TRAIL基因PCR產(chǎn)物片段，通過 連接酶定向插入hTERT載體中，構建成Ad/gTRAIL的腺病毒載體，再通過GAL4 的調控子增強hTERT介導的GFP/TRAIL融合基因的表達；GAL4基因調控系統(tǒng) 可以增強hTERT啟動子介導的轉基因表達，而又不會降低把向的特異性。GAL4 基因調節(jié)系統(tǒng)可以使CEA啟動子介導的轉基因表達增強20-100倍，而絲毫不降 低其表達的特異性。
(3 ) Ad/gTRAIL表達載體與溶癌病毒栽體的重組在Ad/gTRAIL的腺病 毒載體基礎上與溶癌病毒載體進行重組，組成一個新的病毒，稱之為重組腫瘤 特異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-El ); Ad/TRAIL-El進行進一步擴增純化 后，用紫外分光光度計測定純度并定量。TRAIL溶癌病毒克服了 TRAIL進行抗 肺瘤治療效力較弱的特點，Ad/TRAIL-El能夠在肺瘤細胞沖進行自-我復制，增 加基因在腫瘤細胞的拷貝數(shù)或是在腫瘤細胞中的表達水平，從而增強 Ad/TRAIL-El的抗腫瘤作用。下面結合各具體試驗數(shù)據(jù)來進一步證實本發(fā)明的效果。
實例l: Ad/TRABL的體外抗腫瘤作用
請參閱圖1, Ad/gTRAIL體外試驗證實對人肺癌細胞H460和A549、人結 腸癌細胞DLD1和Lovo等腫瘤細,均有很好的抗胂瘤作用；而對正常的人肝 細胞和人支氣管內(nèi)皮細胞無毒性作用。請參閱圖2, Ad/gTRAIL對耐阿霉素的 人乳腺癌細胞M231也有很強的胂瘤抑制作用，Ad/gTRAIL與paclitaxel和 vinorebine具有良好的協(xié)同作用在阿霉素耐藥的MDA-MB-231細胞抹。
實例2: AdTTRAn^El的體外抗腫瘤作用
請參閱圖3和圖4， Ad/TRAIL-El體外試驗證實Ad/TRAIL-El對人肺癌 細胞抹H1299、 A549、 H460和對TRAIL敏感的人結腸癌細胞抹DLD1和對 TRAIL耐藥的人結腸癌細胞林DLD1/TRAIL-R很好的抗肺瘤作用，但對人正常 的內(nèi)皮纖維細胞(NHFB)無明顯的毒性作用。
實例3: Ad7TRAII^El的在腫瘤細胞內(nèi)的病毒復制
請參閱圖5，Ad/TRAIL-El能夠在腫瘤細胞H1299、DLD1和DLD1/TRAIL-R 細胞內(nèi)進行自我復制，并具有一定的時間依賴性，實驗凄t據(jù)同時證實人正常的 纖維細胞(NHFB )內(nèi)并無Ad/TRAIL-El病毒的復制。
實例4: Ad/gTRAIL體內(nèi)抗腫瘤作用
請參閱圖6，人乳腺癌細胞林MDA-MB-231接種于6-8周齡的棵鼠皮下。 當腫瘤直徑達到0.4-0.5cm時，瘤內(nèi)注射Ad/gTRAIL或對照載體。瘤內(nèi)注射9 xl(T微粒數(shù)，5天注射1次，共3次。抽血檢查有無肝毒性。與對照組相比， Ad/gTRAIL顯著抑制腫瘤生長(P0.01 )。而且60%的動物，肺瘤出現(xiàn)完全消退， 5月后，這些動物仍然無瘤生存。請參閱圖7，用Ad/CMV-GFP處理的動物，肺 瘤大小和PBS組一樣，而且這2組動物都在3月內(nèi)死亡。在第1次治療后2， 12, 30天ALT和AST都在正常范圍。阿霉素耐藥細胞林棵鼠移植瘤也觀察到 同樣結果。接種231/ADR的棵鼠被分為Ad/gTRAIE組和Ad/C_MV-GFP組，每 組10只。請參閱圖8, Ad/gTRAIL顯著抑制腫瘤生長(P<0.05)。請參閱圖9, Ad/gTRAIL組在5月后有4只仍無瘤生存，而對照組已全部死亡。請參閱圖10, 在阿霉素耐藥的231/ADR肺轉移瘤模型中的研究結果顯示，相比較于陰性對照 和Ad/CMV-GFP空白對照組，Ad/gTRAIL或紫杉醇能顯著抑制小鼠體內(nèi)的肺部 瘤結節(jié)。而且，用Ad/gTRATL聯(lián)和紫杉醇治療能使小鼠體內(nèi)肺部的轉移病灶， 相對于其它動物更顯著的被抑制。特別是，該試驗組肺部的腫瘤結節(jié)明顯少于 其它組(PO.05 )。
實例5: Ad/TRADWEl的體內(nèi)抗胂瘤作用
請參閱圖11和圖12，人肺癌細胞林H1299接種于6周齡的棵鼠皮下，當 腫瘤直徑達到0.3-0.5cm時，瘤內(nèi)注射Ad/gTRAIL-El或對照載體，Ad/TRAIL-El 能夠明顯抑制肺瘤的生長，并導致動物體內(nèi)的腫瘤完全消退，并且長期無瘤生 存。
權利要求
1、一種溶癌病毒，其組成的主要成分包括腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL、人端粒酶逆轉錄酶啟動子hTERT、腺病毒載體Ad和巨細胞病毒CMV-E。
2、 如權利要求1所述的溶癌病毒，其特征在于，它的構建形式為<image>image see original document page 2</image>
3、 一種制備權利要求1所述的溶癌病毒的方法，包括如下步驟 (1 ) TRAIL基因的擴增、克隆和測序根據(jù)GenBank報道的TRAIL基因的序列及文獻報道設計合成引物，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，純化后的產(chǎn)物常規(guī)進行酶切鑒定和DNA序列分析；(2 ) Ad/gTRAIL表達載體的構建hTERT靶向到TRAIL基因上。將純化的TRAIL基因PCR產(chǎn)物片段，通過連接酶定向插入hTERT載體中，構建成Ad/gTRAIL的腺病毒栽體，再通過GAL4的調控子增強hTERT介導的GFP/TRAIL融合基因的表達；(3 ) Ad/gTRAIL表達栽體與溶癌病毒栽體的重組在Ad/gTRAIL的腺病毒載體基礎上與溶癌病毒載體進行重組，組成一個新的病毒，稱之為重組腫瘤特異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-El ); Ad/TRAIL-El進行進一步擴增純化后， 用紫外分光光度計測定純度并定量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組腫瘤特異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-E1)，其組成的主要成分包括腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)、人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTERT)、腺病毒載體(Ad)和巨細胞病毒(CMV-E)。該重組腫瘤特異的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-E1)的構建形式(如圖)。本發(fā)明還同時公開了上述溶癌病毒的制備方法。
文檔編號C12N15/86GK101168742SQ200710027080
公開日2008年4月30日 申請日期2007年3月8日 優(yōu)先權日2007年3月8日
發(fā)明者方炳良, 林桐榆 申請人:中山大學腫瘤防治中心