專利名稱：水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pi15的克隆及其應用。
背景技術：
植物在生長的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則采取多種防御策略以保護自身，避免受其侵襲。植物中一個最重要的防御機理就是能夠識別專性致病微生物的存在并啟動自身的防御應答系統(tǒng)。植物對病原菌的識別由抗病基因所介導。因此，抗病基因產物結構的分析與研究，是了解植物抗病機制的基礎，對于植物病害的預防和控制也具有重要的指導意義。
迄今，已經從3種單子葉植物和5種雙子葉植物中分離了40多個抗病基因。對這些抗病基因的結構和產物的研究發(fā)現(xiàn)，雖然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、細菌、病毒和線蟲等差異，但抗病基因的結構和產物卻有許多共同的結構特征，如C-端存在富亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸結合位點(nucleotidebinding site，NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋結構域(coiled-coil，CC)，跨膜結構域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蠅Toll蛋白及哺乳動物白介素-1受體(Toll and interleukin-1 receptor，TIR)等。根據它們所編碼蛋白的結構特征，可將抗病基因分為7類(Hammond-Kosack&Jones，1997；Dangl&Jones 2001；Iyer&McCouch 2004)。
第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1個被克隆的植物抗病基因，它負責對真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hm1編碼的解毒酶能鈍化病原真菌所產生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小種1產生的致病因子，它決定該病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類抗病基因。它們編碼的蛋白近N端為NBS，而近C端則由LRR組成。如RPS2(Bent等，1994)、RPM1(Grant等，1995)、I2(Simon等，1998)；RPP5(Parker等，1997)、N(Dodd等，2001)、L6(Lawrence等，1995)、Mla1(Zhou等，2001)、Mla6(Halterman等，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等，1998)、Pib(Wang等，1999)、Pita(Bryan等，2000)等。第三類，PK類抗病基因。如番茄Pto基因，其產物是一個位于細胞內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結構域(Martin等，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基因。番茄抗葉霉病不同生理小種的基因Cf-2(Dixon等，1996)、Cf-4(Thomas等，1997)、Cf-5(Dixon等，1998)、Cf-9(Jones等，1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基因Hs1pro-1(Cai等，1997)等。第五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因Xa21(Song等，1995)為代表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有完整的CC和NBS結構域(Xiao等，2001)。第七類，以水稻的xa5基因為代表，其編碼的蛋白為一個轉錄因子(TFIIAγ)(Iyer&McCouch，2004)。
編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病基因，根據NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結構特點，又可將該類基因分為兩大類TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等，Pan等，2000；Cannon等，2002；Richly等，2002)。TNL類抗病基因主要發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物，至今還沒在單子葉植物基因組中發(fā)現(xiàn)(Bai等，2002；Meyers等，2002)。目前在單子葉植物中鑒定到的抗病基因主要編碼CNL類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量的CNL類抗病基因，相對而言，單子葉植物中的CNL類抗病基因比雙子葉植物中的更豐富多樣(Cannon等，2002)。
研究表明，NBS、CC、TIR結構域可能參與信號傳導(Hammond-Kosack & Jones 1997)，盡管這類R蛋白不具有內在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有結合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut，1994)。TIR結構可能參與植物抗病防衛(wèi)反應下游的信號傳導(Jones，1994)。最近的證據表明，亞麻的L族多樣性選擇也發(fā)生在TIR區(qū)域，這個區(qū)域與相應的LRR區(qū)域共進化形成特異性(Luck等，2000)。LRR結構域的功能主要涉及到蛋白質-蛋白質和與配體的相互作用(Jones & Jones，1996；Kajava，1998)，據推測是抗病基因產物直接和病原菌無毒基因編碼的產物或間接產物相互作用的部位(Bent，1996；Baker等，1997)。Jia等(2000)通過酵母雙雜交證明AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小種特異性的激發(fā)子，傳遞到植物細胞質特異地與Pita受體的LRD區(qū)域結合，從而激活細胞內Pita介導的防衛(wèi)反應。當Pita中的Ala變?yōu)镾er后Av-rPita176不能與LRD結合，因而表現(xiàn)感病。這一結果直接證明了LRR結構域可能就是病原菌識別的區(qū)域；Pita與AvrPita的互作第一次從分子水平驗證了水稻與稻瘟病菌的“基因對基因”關系。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(無性態(tài)Pyriculariagrisea Sacc.)引起的稻瘟病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一，每年都造成嚴重的糧食損失。從環(huán)境保護與農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的觀點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群體的多樣性及易變性，加之人們缺乏對抗性基因的有效利用，以及對抗性機理缺乏充分的了解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品種的短命化而成為育種學家最為棘手的問題。因此，發(fā)掘、鑒定和克隆抗病基因并合理地應用于抗病育種計劃已成為農業(yè)科研中優(yōu)先解決的重要問題。
隨著分子生物學的快速發(fā)展，迄今，至少有80多個水稻稻瘟病主效抗性基因已經被報道，其中60個已經被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被鑒定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11條染色體上均被鑒定到有主效抗性基因位點，并且有的染色體上含有多個稻瘟病抗性位點，而且有些基因位點的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是，在眾多被成功定位的抗性基因中，只有抗性基因Pib和Pita兩個抗性基因被成功地克隆，它們分別位于水稻的第2染色體和第12染色體上。本發(fā)明申請?zhí)岢鲋斑€沒有在水稻第1染色體上克隆稻瘟病抗性基因的報道。
克隆抗病基因是對水稻抗性機理研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機理可以更好地控制和降低稻瘟病菌對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因的修飾和改造，可以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術所不能達到的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻品種GA25中攜帶的一個稻瘟病抗性基因和包含調控這個基因的啟動子的DNA片段。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體轉化的轉基因植物。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白質在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述抗性基因產生的分子標記及其在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的應用。
本發(fā)明涉及分離和應用一種包含Pi15基因的DNA片段，該片段賦予植物對稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害產生特異性的抗病反應。這一發(fā)明適用于對所有對該病原菌敏感的植物。這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。其中，所述片段如序列表SEQ IDNO1所示，或者基本上相當于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。該DNA序列編碼一種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列，結構如圖6所示。本發(fā)明所示的DNA片段在水稻的葉片組織呈組成型表達。
所分離、克隆的Pi15抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。這種蛋白包含兩個主要的結構域NBS和LRR區(qū)域，其中NBS結構域含有保守的kinase 1aIVGPVGFGKT，位于該多肽的第198-207個氨基酸殘基；kinase 2aLIIIDS位于該多肽的第275-280個氨基酸殘基；kinase3aSKIIVTTH位于該多肽的第303-310個氨基酸殘基；GLPLGDPLFR位于該多肽第347-352個氨基酸殘基；MHDMHN位于該多態(tài)第503-505個氨基酸殘基；而該蛋白的C-末端的600-858個氨基酸殘基為11個LRR重復，其亮氨酸含量為17.0％，緊跟LRR重復的是一段富含Ser的序列，長度為168個氨基酸殘基。
Pi15基因中編碼NBS或LRR的核苷酸片段可能具有獨立的功能。將Pi15基因中編碼不同結構域的片段與其他核酸片段重組，可構成嵌合基因或蛋白質，使之具有新的功能。對Pi15基因進行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。例如，將該基因的LRR區(qū)域替換為其他抗性基因的結構域，或將該基因的NBS結構域進行定點突變，可能會導致基因抗性的喪失或基因的抗譜的改變。
本發(fā)明同樣包括將Pi15抗性基因的主要結構部分有效連接上合適的調節(jié)序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下和細胞發(fā)育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達的啟動子或發(fā)育時期特異性表達的啟動子或精確環(huán)境誘導的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導型啟動子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時期的不同都可以改變該基因的表達，同樣，也可以將該基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗病反應得到人為的控制。其中環(huán)境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發(fā)育時期包括葉、果實、種子和花等。
根據本發(fā)明提供的Pi15基因序列信息(SEQ ID NO1)，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得與Pi15等同的基因(1)通過數據庫檢索獲得；(2)以Pi15基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據Pi15基因序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲取；(4)在Pi15基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方法獲得該基因。
本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因P15具有重要的應用價值。應用之一是將所述的Pi15基因序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將Pi15抗病基因導入水稻或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因抗病品種，從而應用于生產。本發(fā)明所述的基因構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列適當修飾，也可以在其轉錄起始密碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強植物對病原菌的抗性。
本發(fā)明提供的抗性基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的分子標記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡單序列重復多態(tài))、RFLP(限制性內切酶長度多態(tài))、CAP(切割擴增片段多態(tài))。用此標記可鑒定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
本發(fā)明具有如下有益效果將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助于產生新的抗病植物。特別是可以用轉化技術在植物中累加多個抗病基因，而不會產生傳統(tǒng)育種技術中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時間?？共』虻目寺】梢钥朔鹘y(tǒng)育種中不能在植物種間轉移抗病基因的問題。
另外，本發(fā)明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相應的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉入其他的植株。


圖1為水稻稻瘟病抗性基因Pi15的圖位克隆示意圖；圖2為水稻稻瘟病抗性基因Pi15的高解析度遺傳及電子物理圖譜；圖3為Pi15候選區(qū)域的基因預測圖；圖4為水稻稻瘟病抗性基因Pi15的RNAi轉化體的基于潮霉素基因片段的PCR檢測結果圖；圖5a為水稻稻瘟病抗性基因Pi15 RNAi T0轉化植株的抗性鑒定圖；圖5b為水稻稻瘟病抗性基因Pi15 RNAi T1轉化植株的表達分析圖；圖6為水稻稻瘟病抗性基因Pi15抗感等位基因的基因結構圖；圖7為水稻稻瘟病抗性基因Pi15編碼的氨基酸多肽序列結構圖；圖8為水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其等位基因pi15表達特性的RT-PCR檢測圖；圖9為分子標記CRG4鑒定親本和感病植株的Pi15位點基因型結果圖；其中，圖2中a表示抗性基因Pi15基因的物理圖譜，標記間的數字表示兩個標記之間發(fā)生的重組事件；b表示構建Pi15基因物理圖的重疊群，短水平線表示IRGSP公布的粳稻品種日本晴的BAC/PAC克隆，垂直線代表標記所在克隆的相對位置。c表示抗性基因Pi5和Pi3基因的物理圖譜，標記間的數字表示兩個標記之間發(fā)生的重組事件；圖3中帶斜線的箭頭表示預測的候選基因；圖4中泳道1為分子量標記DL2000；泳道2-8分別為抗性基因Pi15的RNAi轉化苗S1，S2，S4，S5，S6，S7，R1的潮霉素抗性基因的PCR擴增產物；泳道9為受體Q3(GA25)的非轉化體；泳道10為清水對照。
圖5a中GA25為抗性基因Pi15的供體品種，表現(xiàn)為抗?。黄溆嗟臑榭剐曰騊i15的RNAi轉化苗。其中GA25-S1，GA25-S2，GA25-S3和GA25-S4表現(xiàn)為感?。籊A25-S5表現(xiàn)為中度抗病。
圖5b中第1泳道為DL2000標準分子量；第2泳道為來基因組DNA的Actin基因擴增產物；第3-9泳道為來自cDNA的Actin基因擴增產物；第10-16泳道為來自cDNA的Pi15基因擴增產物。
圖6中綠色方盒表示抗性基因Pi15的外顯子，帶斜線的方盒分別為5’和3’非翻譯區(qū)，細線表示內含子。圖6a為抗性基因Pi15的基因結構圖；圖6b為來自品種LTH的感病等位基因pi15的基因結構圖；圖6c為來自品種Q61的感病等位基因pi15的基因結構圖。
圖7中帶下劃線的字母為組成推定NBS的3個區(qū)域，以及GLPL區(qū)域和MHD區(qū)域；下部分獨立列出的氨基酸殘基為LRR區(qū)域和富含Ser序列。
圖8第1泳道為DL2000標準分子量；第2，6，10泳道為抗性基因Pi15的RT-PCR擴增產物；第2，7，11泳道為來自品種LTH的感病等位基因pi15的RT-PCR產物；第4，8，12泳道為來自品種Q61的感病等位基因pi15的RT-PCR產物；第5，8，13泳道為來自Q1063的感病等位基因pi15的RT-PCR產物；第14泳道為來自基因組DNA的對照。
圖9中Q13為感病親本；GA25為抗病親本；R1-R7為抗病個體；S1-S15為抗病個體；箭頭所指為標記CRG4。
具體實施例方式
實施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi15的遺傳分析及初步定位本發(fā)明對由粳稻抗病品種GA25和3個秈稻感病品種AS20-1、IR36和Q61的雜交組合由來的3個F2群體，分別接種對雙親品種表現(xiàn)分明的非親和性/親和性反應的菌株CHL0416和CHL0670，結果表明這3個F2群體中抗病植株與感病植株的分離比都符合3R1S，由此推斷GA25所表現(xiàn)的對上述3個接種菌株的抗性都是由一對顯性基因控制的。對這3個F2群體對應的抗性基因進行連鎖分析，結果表明它們受同一顯性基因控制，因此構建了從這3個F2群體由來的，共76個抗病個體和504個感病個體組成的一個大作圖群體。
利用RAPD(random amplified polymorpgic DNA，RAPD)和STS(sequence tagged site)分子標記技術，結合基于分離群體分析法(bulked-sgregant analysis，BSA)的隱性群體分析法(recessive-classanalysis，RCA)，對該目的基因進行了連鎖分析。結果表明，目的基因Pi15，定位于第9染色體上約0.7cM的區(qū)間，其中RAPD標記BAPi15782和BAPi15486與Pi15緊密連鎖，遺傳距離分別為0.35cM和1.1cM。為了快速地確定Pi15基因在參考品種日本晴上的染色體區(qū)域，我們對RAPD標記BAPi15782和BAPi15486進行了克隆和測序，并利用生物信息學分析工具BLASTN進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，RAPD標記BAPi15782位于第9染色體RGP PAC克隆AP005811上，其物理位置為52485-53000，RAPD標記BAPi15486著陸于第9染色體的BAC克隆AP005879上，其物理位置為79624-79106。
實施例2覆蓋Pi15位點的電子重疊群的構建由于RAPD標記BAPi15782和BAPi15486與Pi15位點緊密連鎖，因此，在RAPD標記實現(xiàn)了染色體著陸之后，以參考品種日本晴的基因組序列作為參考，構建了覆蓋Pi15位點的重疊群，它是由BAC克隆AP005879、PAC克隆AP005593、AP005811和AP005700等4個克隆所構成的(圖2)。
實施例3水稻稻瘟病抗性基因Pi15的精細定位為了進一步精細定位Pi15位點，我們根據已經構建的重疊群，在目的基因區(qū)域開發(fā)了基于PCR技術的標記。利用在線軟件工具ORF Finder和BLASTP對該區(qū)域序列進行搜索，得到了9個具有LRR或NBS結構的ORF。然后，將這9個ORF作為CRG，在其各自的側翼序列設計了9對特異性引物分別進行了PCR擴增。最初采用了rTaq DNA聚合酶均無法擴增出條帶。經過摸索，我們采用雞尾酒法，將Ex Taq和Probest Taq DNA聚合酶結合起來使用，較好地解決引物與模板DNA之間不匹配的問題，使各個CRG都得到了擴增。結果表明CRG1，CRG2，CRG3，CRG4，CRG5和CRG6等6個CRG標記表現(xiàn)較好的特異性(僅出現(xiàn)目標條帶)，而另外的3個CRG標記則因其特異性不好而被棄用。在6個特異性好的CRG標記中，標記CRG1在抗感親本間表現(xiàn)多態(tài)性；而標記CRG2，CRG3，CRG4、CRG5和CRG6則經酶切之后也表現(xiàn)良好的多態(tài)性(表1)。
另一方面，在BAPi15486和CRG6之間，存在著一個SSR標記RM7364，它位于RGP PAC克隆AP005593上。因此，SSR標記RM7364，連同以上6個多態(tài)性標記CRG1，CRG2，CRG3，CRG4，CRG5和CRG6一起，用于下一步的連鎖分析(圖2a)。
首先，我們用SSR標記RM7364和CRG標記CRG1對504個極端感病的F2個體進行了連鎖分析。結果表明，Pi15位點與標記RM7364之間出現(xiàn)了6個重組體，遺傳距離為0.6cM；而Pi15與標記CRG1之間發(fā)生了7個重組，遺傳距離為0.7cM。由于在標記RM7364位點所檢測到的重組體與在標記CRG1位點所檢測到的重組體是完全不同的，據此可以判斷，標記RM7364和CRG1分別位于Pi15位點的兩側，其中RM7364位于Pi15位點靠近著絲粒的一側，而CRG1則位于Pi15位點靠近端粒的一側。所以，在RM7364和CRG1之間的13個重組體被用于下一步的連鎖分析(表2)。結果表明，在著絲粒一側，CRG6與Pi15位點之間發(fā)生了5個重組，遺傳距離為0.5cM(表2)；CRG5與Pi15位點之間發(fā)生了4個重組，遺傳距離為0.4cM(表2)。而在端粒一側，CRG2與Pi15位點的重組體減少為1個，遺傳距離為0.1cM(表2)。利用CRG3和CRG4繼續(xù)進行染色體步移，發(fā)現(xiàn)它們與Pi15位點完全共分離，亦即沒有重組發(fā)生(表2)。因此說明，染色體步移已經完美地到達了終點(圖2)。這也就意味著，Pi15位點被界定在CRG5和CRG2之間，其間的遺傳距離為0.5cM。根據染色體步移的結果，可以推斷，在6個被分析的CRG中，只有CRG3和CRG4可能是Pi15的候選基因。
根據Pi15和Pi5與錨定標記G103之間的遺傳距離，Pan等(2003)已經整合了含Pi15，Pii，Pi5和Pi3的抗性基因簇的遺傳圖譜。由于美國加州大學戴維斯分校的P.C.Ronald研究組也已經構建了Pi5/Pi3的物理圖譜(Jeon，2003)。因此，有必要將之整合到本研究構建的Pi15位點的電子物理圖譜。通過Paiwise BLAST分析，將與Pi5連鎖的5個標記著陸于重疊群上(圖2c)。該圖顯示，盡管Pi15和Pi5/Pi3相對于G103之間的遺傳距離是不一致的，但是，它們在物理位置上卻是部分重疊的(圖2a)。
實施例4目的基因區(qū)域的基因預測為了最大限度地保證候選目的基因不漏網，以Pi15基因位點最近的側翼標記(產生最少重組體的標記)所界定的區(qū)域作為目的基因區(qū)域(圖3)，利用測序品種日本晴的序列作為參考序列，通過3種基因注釋軟件進行了候選目的基因的預測分析。
根據Gramene軟件工具的注釋，目的基因區(qū)域含有6個基因，為了敘述的方便，將它們分別命名為R15-a，R15-b，R15-c，R15-d，R15-L1和R15-L2等6個基因。其中，R15-L1(位于50-56kb處)，為具有NBS-LRR結構的推定抗性基因，被標記CRG5所錨定；R15-L2(位于57-66kb處)為具有LRR和蛋白激酶(protein Kinase，PK)的推定抗性基因，被標記CRG4所錨定。由于CRG3和CRG4與Pi15位點完全共分離，且具有抗性基因的保守結構，所以R15-L1和R15-L2被確定為Pi15的候選基因(圖3)。
另一方面，根據RiceGAAS和Softberry軟件工具的預測，目的基因區(qū)域有6個基因，其中，R15-L3(位于50-64kb處)，為編碼具有NBS-LRR區(qū)域的抗性蛋白基因。由于R15-L3包括了Gramene所注釋的R15-L1和R15-L2所在的區(qū)域，且被CRG3和CRG4所共同錨定。因此，R15-L3也被確定為Pi15的候選基因(圖3)。
綜上所述，以日本晴的序列為參考，在候選區(qū)域有3個基因被確定為Pi15的候選基因，它們是R15-L1、R15-L2和R15-L3。其中，候選基因R15-L3包括了2個候選基因R15-L1和R15-2。
實施例5候選目的基因的確認為了確認基因預測的結果，在候選基因的外顯子區(qū)域設計了特異性引物來進行RT-PCR擴增分析。具體而言，將基因組DNA作為對照，以區(qū)分來自基因組DNA還是cDNA的PCR產物；選擇actin為陽性內參照，以檢測RNA反轉錄成cDNA的質量。由于候選基因R15-L3所在區(qū)域已經包括了R15-L1和R15-L2兩個基因，所以我們設計了一對引物，正向引物位于R15-L1的外顯子上，反向引物位于R15-L2的外顯子上，對候選基因R15-L3進行了RT-PCR，并將擴增產物進行了克隆和測序。結果表明，該擴增產物為預期大小1100bp，為目的基因的序列，說明RiceGAAS和Softberry軟件工具的預測結果是正確的，R15-L3為抗性基因Pi15的候選基因。
實施例6Pi15基因全長cDNA的獲得以及基因結構的推導采用移步法對Pi15抗、感等位基因的DNA序列進行了測定。利用5’和3’RACE反應，獲得了Pi15抗、感等位基因的全長cDNA并對其進行了測序。序列比對結果表明，抗性基因Pi15全長cDNA為3505bp，編碼區(qū)為3078bp，含有5個外顯子，大小分別為314bp，1151bp，1317bp，160bp和137bp，并且含有4個內含子，大小分別為976bp，198bp，454bp和862bp，5’和3’非翻譯區(qū)分別為144bp和296bp(圖6)。
來自LTH的感病等位基因pi15全長cDNA為3655bp，含有4個外顯子，大小分別為314bp，2662bp，160bp和137bp，并且含有3個內含子，大小分別為971bp，442bp和862bp(圖6)，其中，第2個外顯子上存在的“TAA”導致翻譯提前終止。
來自Q61的感病等位基因pi15全長cDNA為2511bp，含有5個外顯子，大小分別為314bp，1147bp，510bp，243bp，320bp和137bp，并且含有5個內含子，大小分別為971bp，198bp，563bp，443bp和862bp(圖6)，其中，第3個外顯子上存在的“TGA”導致翻譯提前終止。
由此說明，mRNA的不同剪切方式導致了感病品種中蛋白翻譯的提前終止，從而導致了抗感表型的差異。
實施例7Pi15基因的過表達分析根據Pi15基因的全長cDNA序列設計1對引物(分別包括含有Kpn I和Sal I酶切位點)，對GA25的cDNA進行了擴增，獲得Pi15完整的編碼區(qū)，并將其克隆至雙元載體pCAMBIA1300S中，然后，導入了農桿菌菌株EHA105。將高度感病品種Q1063成熟種子在誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。把含有目的基因轉化載體的EHA105在YM瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液體培養(yǎng)基。將水稻愈傷組織浸入菌液20分鐘，吸干菌液后轉移到MB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉移愈傷組織至含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每14天繼代1次，繼代2次?？剐院Y選后，轉入再生培養(yǎng)基分化出轉化苗，分別獲得了轉化苗140株?？剐澡b定結果顯示候選基因R15-L3在感病品種Q1063遺傳背景下表現(xiàn)了與抗性基因供體GA25相同的抗性，表明抗性基因Pi15已經被成功地克隆了。
實施例8Pi15基因的RNAi分析將上述R15-L3的RT-PCR產物克隆至雙元載體pCAMBIA1300RS中，導入了農桿菌菌株EHA105。將抗病品種GA25成熟種子在誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。把含有目的基因轉化載體的EHA105在YM瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液體培養(yǎng)基。將水稻愈傷組織浸入菌液20分鐘，吸干菌液后轉移到MB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉移愈傷組織至含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每14天繼代1次，繼代2次?？剐院Y選后，轉入再生培養(yǎng)基分化出轉化苗，分別獲得了轉化苗60株?？剐澡b定結果顯示轉化植株喪失了抗性基因供體GA25的抗性(圖5a)，也表明抗性基因Pi15已經被成功地克隆了。
對轉化植株進行了潮霉素基因的PCR鑒定(圖4)。檢測結果證明目的基因片段已經導入這些轉化體。對這些T1轉化植株的表達分析發(fā)現(xiàn)，感病植株中Pi15基因的表達量低于抗病植株(圖5b)。
實施例9Pi37抗性蛋白的結構Pi15基因編碼的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。所分離、克隆的Pi15抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。這種蛋白包含兩個主要的結構域NBS和LRR區(qū)域，其中NBS結構域含有保守的kinase 1aIVGPVGFGKT，位于該多肽的第198-207個氨基酸殘基；kinase 2aLIIIDS位于該多肽的第275-280個氨基酸殘基kinase 3aSKIIVTTH位于該多肽的第303-310個氨基酸殘基GLPLGDPLFR位于該多肽第347-352個氨基酸殘基MHDMHN位于該多態(tài)第503-505個氨基酸殘基；而該蛋白的C-末端的600-858個氨基酸殘基為11個LRR重復，其亮氨酸含量為17.0％，緊跟LRR重復的是一段富含Ser的序列，長度為168個氨基酸殘基(圖7)。
實施例10Pi15基因的表達特性分析用RT-PCR對Pi15基因的表達模式進行了分析。從抗病品種GA25和感病品種LHT，Q61和Q1063的葉片中提取總RNA，利用反轉錄試劑盒SuperScriptTMReverse Transcriptase II進行反轉錄cDNA第一條鏈的合成。RT-PCR引物為L2RTF5’-CCAGCAGTTTAAGATCAG-3’和L2RTR5’-GGTGAAGCTGTGCTGCAATTTC-3’。PCR反應為94℃預變性4min；接下來是35個循環(huán)，循環(huán)程序如下94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸7min，溫度降到4℃即完成擴增。實驗結果表明，抗性品種和感病品種的接種前后的葉片組織的RNA反轉錄模板均能擴增出特異的片段，說明Pi15及其等位基因pi15均能在葉片組織中表達，即屬于組成型表達的基因(圖8)。
實施例11Pi15基因序列在分子標記輔助選擇育種中的應用利用本發(fā)明提供的Pi15基因序列信息可以產生分子標記，用于鑒定Pi15位點上具有的各種基因型即Pi15Pi15、Pi15pi15和pi15pi15的植株，可在分子標記輔助選擇育種過程中加以應用(表1；圖9)。
實施例12抗性基因Pi15的抗性特征抗性基因Pi15對分離自泰國、日本和中國的稻瘟病菌株的反應型，明顯地與Piz，Pizt，Piz5和Pikm等主要抗病基因的不一樣，因此，Pi15可以作為這些高度抗病基因的補充，廣泛地應用于抗病育種計劃中(表3)。
表1在靶區(qū)域開發(fā)的Pi15候選抗性基因(candidate resistatance gene，CRG)標記

aF正向引物；R反向引物；bA＝2％瓊脂糖凝膠；B＝6％聚丙烯酰胺凝膠。
表2 13個目的基因側翼的重組體在靶區(qū)域7個標記位點的基因型分析

aS基因型為感病親本純合型；H基因型為雙親的雜合型；bA重組體I275，I285，I356和I379；B重組體I55；C重組體I93；D重組體I182，I230，I260，I261，I410和I528；E重組體I393。
表3抗性基因Pi15對來自日本、泰國和中國的10個稻瘟病菌菌株的抗譜分析

a，Isolates selected from Japan，Thailand，and China were tested in respectivecountry in 1996，1998，and 2001.
b，R，resistant，S，susceptible.
c，NT，not tested.
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用序列表SEQUENCE LISTING<110>華南農業(yè)大學<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3505<212>Full length cDNA<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(143)<220>
<221>exon<222>(144)..(3221)<220>
<221>3’UTR<222>(3222)..(3505)<400>1TCGACGATTC GACTGGAGCA CGGGACACTG ACATGGACTG AAGGAGTAGA AAACCTTCTC 60TCTTCTCGTT CTCCTATTTC ACAAATCACA ACCGGATTGC TTTCTTCCTT CCTCCGGTCT 120GGTCCCCAAC CTCCGCGGCA GCC ATG GTT GGC GCC GAG ATG CTT GTG GCC GCG 173Met Val Gly Ala Glu Met Leu Val Ala Ala5 10GCG GTG AGC CAG GTC GCC CGG AAG ATC MAC GAC ATC GTG GGG GTC GCG 221Ala Val Ser Gln Val Ala Arg Lys Ile Asn Asp Ile Val Gly Vsl Ala15 20 25CAG GGC GAG GTG AAG CTG TGC TGC AAT TTC AGC GAC GAT TTG GAG GGC 269Gln Gly Glu Val Lys Leu Cys Cys Asn Phe Ser Asp Asp Leu Glu Gly30 35 40ATC AAG GAT ACC CTT GTG TAC CTG GAA ACC TTG CTG AAA AAT GCG GAG 317Ile Lys Asp Thr Leu Val Tyr Leu Glu Thr Leu Leu Lys Asn Ala Glu45 50 55AAT AAC TCC TTC GGA AGC GAC AGG GCC AAC CTG CGC CAC TGG CTT GGC 365Asn Asn Ser Phe Gly Ser Asp Arg Ala Asn Leu Arg His Trp Leu Gly60 65 70CAG ATC AAG TCC CTG GCT TAC GAT ATC GAA GAT ATC GTT GAT GGG TAC 413Gln Ile Lys Ser Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Val Asp Gly Tyr75 80 85 90TAC TCT TCC AAG GAG CAG TTC GAT GGG GGC AGC TAT GCA CAG AAG GGG 461Tyr Ser Ser Lys Glu Gln Phe Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Gly95 100 105TCA TTA TTC TGC TCG CTA TCC AAT CCA ATG CTT CTG AAA GGT AGC ATG 509Ser Leu Phe Cys Ser Leu Ser Asn Pro Met Leu Leu Lys Gly Ser Met110 115 120GTT TAT AAG ATG AAA TCC AAG AGA GAG ATG CTA CAG CAA AGC CAA CAG 557Val Tyr Lys Met Lys Ser Lys Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Gln125 130 135TTG CCC AAT CAG TAT CAT TTC CTT TCA TAT ATC AAT TCA GCT GTG CAT 605Leu Pro Asn Gln Tyr His Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Ala Val His140 145 150TAT TTT GAG GAG AAG CAA ACA ACA TCA TAC AGA AAT ACT GAC ATT GCA 653
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用序列表Tyr Phe Glu Glu Lys Gln Thr Thr Ser Tyr Arg Asn Thr Asp Ile Ala155 160 165 170ATT GTC GGG AGG GAT GCT GAT TTG GAT CAT CTC ATG GAT CTT TTA ATG 701Ile Val Gly Arg Asp Ala Asp Leu Asp His Leu Met Asp Leu Leu Met175 180 185CAA AAC AGC GCT GAA GAG CTT TGT ATT ATA CCC ATA GTT GGG CCT GTA 749Gln Asn Ser Ala Glu Glu Leu Cys Ile Ile Pro Ile Val Gly Pro Val190 195 200GGT TTT GGA AAG ACA AGC CTT GCA CAG TTA GTT TTC AAT GAT ACA AGA 797Gly Phe Gly Lys Thr Ser Leu Ala Gln Leu Val Phe Asn Asp Thr Arg205 210 215ACA GAG GTA TTC AGC TTT AGG ATA TGG GTT CAT GTT TCC ATG GGT AAT 845Thr Glu Val Phe Ser Phe Arg Ile Trp Val His Val Ser Met Gly Asn220 225 230ATC AAC CTT GAA AAA ATT GGG AGA GAT ATA GTT TCA CAA ACT ACA GAA 893Ile Asn Leu Glu Lys Ile Gly Arg Asp Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu235 240 245 250AAA ATT GAG GGA AAT ATG CAG CTG CAG TCA ATC AAG AAT GCT GTT CAG 941Lys Ile Glu Gly Asn Met Gln Leu Gln Ser Ile Lys Asn Ala Val Gln255 260 265CGT GTG CTA AAT AAA TAT AGT TGC TTG ATC ATA ATA GAC AGC CTT TGG 989Arg Val Leu Asn Lys Tyr Ser Cys Leu Ile Ile Ile Asp Ser Leu Trp270 275 280GGA AAG GAT GAA GAA GTG AAT GAA TTG AAG CAG ATG TTG CTT ACA GGT 1037Gly Lys Asp Glu Glu Val Asn Glu Leu Lys Gln Met Leu Leu Thr Gly285 290 295AGA CAC ACA GAA AGC AAG ATC ATA GTG ACC ACT CAT AGC AAT AAA GTA 1085Arg His Thr Glu Ser Lys Ile Ile Val Thr Thr His Ser Asn Lys Val300 305 310GCT AAG CTG ATT TCC ACC GTT CCA CTG TAC AAG TTG GCA GCT TTA TCT 1133Ala Lys Leu Ile Ser Thr Val Pro Leu Tyr Lys Leu Ala Ala Leu Ser315 320 325 330GAG GAT GAT TGT TTA AAA ATA TTC TCT CAA AGG GCA ATG ACA GGT CCG 1181Glu Asp Asp Cys Leu Lys Ile Phe Ser Gln Arg Ala Met Thr Gly Pro335 340 345GGT GAC CCG TTG TTC AGG GAA TAT GGA GAA GAA ATC GTT AGA AGG TGT 1229Gly Asp Pro Leu Phe Arg Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Val Arg Arg Cys350 355 360GAA GGC ACA CCC TTG GTA GCC AAT TTT CTC GGT TCT GTG GTG AAT GCT 1277Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Asn Phe Leu Gly Ser Val Val Asn Ala365 370 375CAA CGA CAA AGG CGT GAG ATT TGG CAA GCT GCA AAG GAT AAA GAA ATG 1325Gln Arg Gln Arg Arg Glu Ile Trp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Glu Met380 385 390TGG AAG ATA GAG GAA GAT TAT CCC CAA GAC AAA ACT TCA CCA CTA TTT 1373Trp Lys Ile Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Asp Lys Thr Ser Pro Leu Phe395 400 405 410CCA TCA TTC AAG ATA ATA TAT TAT AAT ATG CCC CAT GAG CTA AGA TTA 1421Pro Ser Phe Lys Ile Ile Tyr Tyr Asn Met Pro His Glu Leu Arg Leu415 420 425TGC TTT GTA TAT TGT TCA ATC TTC CCT AAA GGA ACT GTT ATA GAA AAG 1469Cys Phe Val Tyr Cys Ser Ile Phe Pro Lys Gly Thr Val Ile Glu Lys430 435 440AAG AAA CTT ATT CAG CAA TGG ATT GCA CTT GAC ATG ATT GAG TCC AAA 1517Leu Ile Gln Gln Trp Ile Lys Lys Ala Leu Asp Met Ile Glu Ser Lys445 450 455
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用序列表CAT GGA ACC TTG CCA CTT GAT GTA ACT GCG GAG AAA TAT ATT GAT GAA 1565His Gly Thr Leu Pro Leu Asp Val Thr Ala Glu Lys Tyr Ile Asp Glu460 465 470CTT AAA GCA ATC TAT TTC CTT CAA GTT TTA GAG CGG TCT CAG AAT GAT 1613Leu Lys Ala Ile Tyr Phe Leu Gln Val Leu Glu Arg Ser Gln Asn Asp475 480 485 490GCA GAA AGA TCC AGT GCT TCT GAG GAA ATG CTT CGC ATG CAT AAC TTG 1661Ala Glu Arg Ser Ser Ala Ser Glu Glu Met Leu Arg Met His Asn Leu495 500 505GCT CAT GAT CTT GCT AGA TCG GTT GCT GGT GAA GAT ATC CTT GTT ATT 1709Ala His Asp Leu Ala Arg Ser Val Ala Gly Glu Asp Ile Leu Val Ile510 515 520TTA GAT GCC GAG AAC GAG CGC AAC GCC AGA TAT TGC GAT TAC CGT TAT 1757Leu Asp Ala Glu Asn Glu Arg Asn Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Arg Tyr525 530 535GCA CAG GTG TCT GCT TCT AGT TTA GAG CCA ATC GAT CGC AAG GCA TGG 1805Ala Gln Val Ser Ala Ser Ser Leu Glu Pro Ile Asp Arg Lys Ala Trp540 545 550CCT TCC AAG GCA AGG TCA CTA ATT TTC AAG AAT AGT GGT GCG GAC TTT 1853Pro Ser Lys Ala Arg Ser Leu Ile Phe Lys Asn Ser Gly Ala Asp Phe555 560 565 570GAG CGT GTC AGT GAA GTT CTT TCA GTG AAC AAA TAC CTG CGT GTT TTG 1901Glu Arg Val Ser Glu Val Leu Ser Val Asn Lys Tyr Leu Arg Val Leu575 580 585GAT CTC AGT GGA TGT TGT GTT CAA GAT ATT CCA TCT CCT ATC TTT CAG 1949Asp Leu Ser Gly Cys Cys Val Gln Asp Ile Pro Ser Pro Ile Phe Gln590 595 600CTG AAA CAA TTG AGA TAC CTC GAC GTT TCA TCT TTA TCT ATT ACA GCA 1997Leu Lys Gln Leu Arg Tyr Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser Ile Thr Ala605 610 615CTC CCT CTG CAA ATT AGT AGC TTT CAT AAG TTA CAA ATG TTG GAT CTT 2045Leu Pro Leu Gln Ile Ser Ser Phe His Lys Leu Gln Met Leu Asp Leu620 625 630TCA GAA ACT GAA CTA ACA GAG TTG CCA CCC TTT ATA AGC AAC TTA AAA 2093Ser Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Pro Pro Phe Ile Ser Asn Leu Lys635 640 645 650GGA CTG AAT TAT TTG AAT CTC CAA GGT TGC CAG AAA CTT CAA CGA TTG 2141Gly Leu Asn Tyr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Gln Lys Leu Gln Arg Leu655 660 665AAT AGC CTT CAT TTG TTG CAT GAT CTA CAT TAC CTA AAC TTG TCA TGC 2189Asn Ser Leu His Leu Leu His Asp Leu His Tyr Leu Asn Leu Ser Cys670 675 680TGC CCT GAA GTT ACT AGT TTT CCT GAA TCT ATT GAA AAT CTG ACC AAA 2237Cys Pro Glu Val Thr Ser Phe Pro Glu Ser Ile Glu Asn Leu Thr Lys685 690 695CTC CGT TTC TTG AAT CTT TCT GGA TGC TCT AAG CTT TCA ACA TTA CCT 2285Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Gly Cys Ser Lys Leu Ser Thr Leu Pro700 705 710ATC AGA TTT TTG GAA TCA TTT GCT AGC CTC TGT TCT TTG GTA GAT CTT 2333Ile Arg Phe Leu Glu Ser Phe Ala Ser Leu Cys Ser Leu Val Asp Leu715 720 725 730AAC TTA AGT GGC TTT GAA TTC CAA ATG TTG CCC GAC TTT TTT GGC AAC 2381Asn Leu Ser Gly Phe Glu Phe Gln Met Leu Pro Asp Phe Phe Gly Asn735 740 745ATA TAT TCA CTT CAG TAT TTA AAT CTG TCA AAA TGT TTG AAA CTT GAG 2429Ile Tyr Ser Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser Lys Cys Leu Lys Leu Glu
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用序列表750 755 760GTA TTA CCA CAA TCT TTT GGC CAA CTT GCA TAT CTG AAA AGC CTA AAT 2477Val Leu Pro Gln Ser Phe Gly Gln Leu Ala Tyr Leu Lys Ser Leu Asn765 770 775CCT TCA TAT TGT TCT GAT CTT AAA CTG CTG GAA TCC TTT GAA TGC CTT 2525Pro Ser Tyr Cys Ser Asp Leu Lys Leu Leu Glu Ser Phe Glu Cys Leu780 785 790ACC TCT CTT CGG TTT TTG AAT CTC TCG AAC TGC TCT AGG CTT GAA TAT 2573Thr Ser Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Asn Cys Ser Arg Leu Glu Tyr795 800 805 810TTG CCG TCG TGC TTT GAC AAG CTT AAT AAT TTA GAG TCT CTG AAT TTA 2621Leu Pro Ser Cys Phe Asp Lys Leu Asn Asn Leu Glu Ser Leu Asn Leu815 820 825TCA CAA TGT CTT GGA CTT AAA GCA CTA CCT GAA TCA CTT CAA AAC CTT 2669Ser Gln Cys Leu Gly Leu Lys Ala Leu Pro Glu Ser Leu Gln Asn Leu830 835 840AAA AAT CTT CAG CTT GAT GTT TCT GGG TGT CAG GAT TGT ATA GTA CAA 2717Lys Asn Leu Gln Leu Asp Val Ser Gly Cys Gln Asp Cys Ile Val Gln845 850 855TCC TTT TCT CTA AGT ACC AGA AGT TCC CAG TCC TGC CAA CGG TCG GAG 2765Ser Phe Ser Leu Ser Thr Arg Ser Ser Gln Ser Cys Gln Arg Ser Glu860 865 870AAA GCT GAG CAG GTC AGA TCA AGA AAC AGT GAA ATT TCA GAG ATC ACT 2813Lys Ala Glu Gln Val Arg Ser Arg Asn Ser Glu Ile Ser Glu Ile Thr875 880 885 890TAT GAG GAA CCT GCT GAG ATT GAA CTT TTA AAG AAT AAC CCA AGT AAA 2861Tyr Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Asn Pro Ser Lys895 900 905GAT TTG GCC TCC ATC TCA CAC CTA AAT GAG GAT AGA ATT GAG GAG CCT 2909Asp Leu Ala Ser Ile Ser His Leu Asn Glu Asp Arg Ile Glu Glu Pro910 915 920GAA GTT GTC ACT GAG CCA AGT GCA ACT AGA GGT ATG GTA CAA CAG ATT 2957Gln Ile Pro Gly Asn Gln Leu Ser Ser Pro Ser Ser His Leu Ser Ser925 930 935CCA GGA AAC CAG CTC TCA TCG CCT TCA TCT CAT CTT TCT TCC TTT GCA 3005Phe Ala Glu Val Val Thr Glu Pro Ser Ala Thr Arg Gly Met Val Gln940 945 950TCA AGC TCA GCG CCA TTT GCA TCC TCC TCT TCG GAC ACC TCA ACA AGT 3053Ser Ser Ser Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Ser955 960 965 970GAG CAT CCA GTG CCT AAT GAA GAG GCG GCA GCT TTG ACA GTT CCT CGG 3101Glu His Pro Val Pro Asn Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro Arg975 980 985TCC AAC GAG AAA TGC GAC AAC ACT CCC ATG CCG GTA AAA GAT GGC CTG 3149Ser Asn Glu Lys Cys Asp Asn Thr Pro Met Pro Val Lys Asp Gly Leu990 995 1000ATA TCT GAA GAT GAT GCA CCG GTA CAT CTG CAT CAG AAG CCC CTG CAG 3197Ile Ser Glu Asp Asp Ala Pro Val His Leu His Gln Lys Pro Leu Gln1005 10101015GCG ACA GCC ATG GCA GCC ATA TGA CTGACCTGT AATCCTACAA3240Ala Thr Ala Met Ala Ala Ile ***1020 1026GAAGCCAACT GAAGATTCAT ATGTGGACTG AGTGAAATTA TGAAAGTTAT TGGAATAAAT 3300TGTTGCTCTG TATGTGAGAG CAACCTTCAG TCCGTTAGCC TGGTTCCTTT TAGTAGTGTT 3360CTACTATTGG GAGATCTTCA TCAACATTTT ACATGAAACG TAATGTAATG AACCTCTGTT 3420
水稻稻瘟病抗性基因Pi15及其應用序列表AATTGTTAAT TGTCAGAGCT CTAGTTTTTT GTGGTATAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3480AACACTGTCA TGCCGTTACG TAGCG 3505<210>2<211>1026<212>NBS-LRR<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Val Gly Ala Glu Met Leu Val Ala Ala Ala Val Ser Gln Val Ala Arg Lys6 12 18Ile Asn Asp Ile Val Gly Val Ala Gln Gly Glu Val Lys Leu Cys Cys Asn Phe24 30 36Ser Asp Asp Leu Glu Gly Ile Lys Asp Thr Leu Val Tyr Leu Glu Thr Leu Leu42 48 54Lys Asn Ala Glu Asn Asn Ser Phe Gly Ser Asp Arg Ala Asn Leu Arg His Trp60 66 72Leu Gly Gln Ile Lys Ser Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Val Asp Gly Tyr78 84 90Tyr Ser Ser Lys Glu Gln Phe Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Gly Ser Leu96 102 108Phe Cys Ser Leu Ser Asn Pro Met Leu Leu Lys Gly Ser Met Val Tyr Lys Met114 120 126Lys Ser Lys Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Gln Leu Pro Asn Gln Tyr His132 138 144Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Ala Val His Tyr Phe Glu Glu Lys Gln Thr Thr150 156 162Ser Tyr Arg Asn Thr Asp Ile Ala Ile Val Gly Arg Asp Ala Asp Leu Asp His168 174 180Leu Met Asp Leu Leu Met Gln Asn Ser Ala Glu Glu Leu Cys Ile Ile Pro Ile186 192 198Val Gly Pro Val Gly Phe Gly Lys Thr Ser Leu Ala Gln Leu Val Phe Asn Asp204 210 216Thr Arg Thr Glu Val Phe Ser Phe Arg Ile Trp Val His Val Ser Met Gly Asn222 228 234Ile Asn Leu Glu Lys Ile Gly Arg Asp Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu Lys Ile240 246 252Glu Gly Asn Met Gln Leu Gln Ser Ile Lys Asn Ala Val Gln Arg Val Leu Asn258 264 270Lys Tyr Ser Cys Leu Ile Ile Ile Asp Ser Leu Trp Gly Lys Asp Glu Glu Val276 282 288Asn Glu Leu Lys Gln Met Leu Leu Thr Gly Arg His Thr Glu Ser Lys Ile Ile294 300 306Val Thr Thr His Ser Asn Lys Val Ala Lys Leu Ile Ser Thr Val Pro Leu Tyr312 318 324Lys Leu Ala Ala Leu Ser Glu Asp Asp Cys Leu Lys Ile Phe Ser Gln Arg Ala330 336 342Met Thr Gly Pro Gly Asp Pro Leu Phe Arg Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Val Arg348 354 360Arg Cys Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Asn Phe Leu Gly Ser Val Val Asn Ala366 372 378Gln Arg Gln Arg Arg Glu Ile Trp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Glu Met Trp Lys384 390 396Ile Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Asp Lys Thr Ser Pro Leu Phe Pro Ser Phe Lys402 408 414Ile Ile Tyr Tyr Asn Met Pro His Glu Leu Arg Leu Cys Phe Val Tyr Cys Ser420 426 432Ile Phe Pro Lys Gly Thr Val Ile Glu Lys Lys Lys Leu Ile Gln Gln Trp Ile438 444 450Ala Leu Asp Met Ile Glu Ser Lys His Gly Thr Leu Pro Leu Asp Val Thr Ala456 462 468Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Lys Ala Ile Tyr Phe Leu Gln Val Leu Glu Arg474 480 486Ser Gln Asn Asp Ala Glu Arg Ser Ser Ala Ser Glu Glu Met Leu Arg Met His492 498 504Asn Leu Ala His Asp Leu Ala Arg Ser Val Ala Gly Glu Asp Ile Leu Val Ile510 516 522Leu Asp Ala Glu Asn Glu Arg Asn Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Arg Tyr Ala Gln528 534 540
水稻稻瘟病抗性基因Pil5及其應用序列表Val Ser Ala Ser Ser Leu Glu Pro Ile Asp Arg Lys Ala Trp Pro Ser Lys Ala546 552 558Arg Ser Leu Ile Phe Lys Asn Ser Gly Ala Asp Phe Glu Arg Val Ser Glu Val564 570 576Leu Ser Val Asn Lys Tyr Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Gly Cys Cys Val Gln582 588 594Asp Ile Pro Ser Pro Ile Phe Gln Leu Lys Gln Leu Arg Tyr Leu Asp Val Ser600 606 612Ser Leu Ser Ile Thr Ala Leu Pro Leu Gln Ile Ser Ser Phe His Lys Leu Gln618 624 630Met Leu Asp Leu Ser Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Pro Pro Phe Ile Ser Asn636 642 648Leu Lys Gly Leu Asn Tyr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Gln Lys Leu Gln Arg Leu654 660 666Asn Ser Leu His Leu Leu His Asp Leu His Tyr Leu Asn Leu Ser Cys Cys Pro672 678 684Glu Val Thr Ser Phe Pro Glu Ser Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Arg Phe Leu690 696 702Asn Leu Ser Gly Cys Ser Lys Leu Ser Thr Leu Pro Ile Arg Phe Leu Glu Ser708 714 720Phe Ala Ser Leu Cys Ser Leu Val Asp Leu Asn Leu Ser Gly Phe Glu Phe Gln726 732 738Met Leu Pro Asp Phe Phe Gly Asn Ile Tyr Ser Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser744 750 756Lys Cys Leu Lys Leu Glu Val Leu Pro Gln Ser Phe Gly Gln Leu Ala Tyr Leu762 768 774Lys Ser Leu Asn Pro Ser Tyr Cys Ser Asp Leu Lys Leu Leu Glu Ser Phe Glu780 786 792Cys Leu Thr Ser Leu Arg Phe Leu Asn Leu Ser Asn Cys Ser Arg Leu Glu Tyr798 804 810Leu Pro Ser Cys Phe Asp Lys Leu Asn Asn Leu Glu Ser Leu Asn Leu Ser Gln816 822 828Cys Leu Gly Leu Lys Ala Leu Pro Glu Ser Leu Gln Asn Leu Lys Asn Leu Gln834 840 846Leu Asp Val Ser Gly Cys Gln Asp Cys Ile Val Gln Ser Phe Ser Leu Ser Thr852 858 864Arg Ser Ser Gln Ser Cys Gln Arg Ser Glu Lys Ala Glu Gln Val Arg Ser Arg870 876 882Asn Ser Glu Ile Ser Glu Ile Thr Tyr Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Leu Leu888 894 900Lys Asn Asn Pro Ser Lys Asp Leu Ala Ser Ile Ser His Leu Asn Glu Asp Arg906 912 918Ile Glu Glu Pro Glu Val Val Thr Glu Pro Ser Ala Thr Arg Gly Met Val Gln924 930 936Gln Ile Pro Gly Asn Gln Leu Ser Ser Pro Ser Ser His Leu Ser Ser Phe Ala942 948 954Ser Ser Ser Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Ser Glu His960 966 972Pro Val Pro Asn Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro Arg Ser Asn Glu Lys978 984 990Cys Asp Asn Thr Pro Met Pro Val Lys Asp Gly Leu Ile Ser Glu Asp Asp Ala99610021008Pro Val His Leu His Gln Lys Pro Leu Gln Ala Thr Ala Met Ala Ala Ile ***1014 1020102權利要求
1.一種水稻稻瘟病抗性基因Pi15編碼的蛋白質，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或該序列替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其特征是氨基酸序列如SEQ IDNO2所示。
3.編碼權利要求1所述蛋白質的水稻稻瘟病抗性基因Pi15的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi15，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
5.一種含有權利要求3或4所述基因的載體。
6.權利要求5所述載體轉化的轉基因植物。
7.權利要求3或4所述基因產生的分子標記。
8.權利要求1或2所述蛋白質在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
9.權利要求7所述分子標記在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個水稻稻瘟病新抗性基因Pi15的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列與應用。該基因屬于nonTIR－NBS－LRR抗性基因家族的成員，為一個組成型表達的基因。本發(fā)明還涉及了用該基因轉化水稻或其它植物培育抗病品種以及根據該基因序列產生的分子標記在育種中的應用。
文檔編號C12N15/29GK101050232SQ200710027178
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月16日 優(yōu)先權日2007年3月16日
發(fā)明者潘慶華, 林菲, 王玲 申請人:華南農業(yè)大學