專利名稱：三葉因子2真核表達載體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因真核表達技術，特別是一種三葉因子2的人工合成 技術。
背景技術：
三葉因子2 (Trefoil factor 2，TFF2)在生理條件時能保持胃黏膜完整 與穩(wěn)定，在急性拫傷時分泌增多，在消化性潰瘍中有特異表達，提示其在維 持胃腸道黏膜的完整性和促進快速修復過程中起重要作用，在消化性潰瘍的 洽療中有一定的應用前景。
當前三葉因子2真核表達載體的合成方法中， 一般都是首先在產物中設 計好酶切位點，大量擴增產鉤后將產物純化，然后進行酶切，在純化后進行 克隆。而在此過程中釆用了 pfu和Taq酶的復合物作為拼裝體系。該方法一 方面搡作步驟多，生產效率低；另一方面由于Ta.q酶缺乏糾錯能力，有使產 物出現(xiàn)突變的可能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種可減化操作步驟 并提高效率，更好地保證產物拼裝的可靠性的三葉因子2真核表達載體的制 備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供三葉因子2真核表達載體的制備方法包 括步驟(1) TFF2基因原料的制備；(2)載體原料的制備；(3)三葉因子2 真核表達載體的拼裝。其中，在TFF2基因原料的制備過程中，在擴增引物并 進行核苷酸鈍化后進行TA克?。辉谌~因子2真核表達載體的拼裝過程申， 用pfu Master mix對TFF2基因原料和載.體原料的混合物進行拼裝.
如上所逸本發(fā)明三葉因子2真核表達載體的制備方法以TA克隆方式代 替現(xiàn)有技術中克隆方式，減化了操作步驟并提高了效率。以Pfu酶對(按TFF2
基因設計的40bp的寡核苷酸)的混合物進行拼裝代替以pfu和Taq酶的復合 物進行拼裝的方式，更好地保證了產物拼裝的可靠性。
具體實施例方式
為詳細說明本發(fā)明的技術內容、構造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結 合實施方式并配合附圖
詳予說明。
一種三葉因子2真核表達載體的制備方法,.其步驟如下 (1) TFF2基因原抖的制備根據(jù)已知人的TFF2基因的蛋白序列 (GeneBank登錄號NP-005414 )來設計合成TFF2表達的cDNA序列。在TFF2 的信號肽和成熟TFF2之前，插入一段cinyc的標記(tag )，形成ctnyc-TFF2 (c-myc-TFF2最終設計序列45他p).為便于進一步的亞克隆，在c-myc-TFF2 的氨基端添加BamHI酶切位點，在羧基端(即終止密碼子之后)添加EcoRI 和Xbal酶切點。c-inyc-TFF2最終設計序列450bp.然后，按每40b—p.的核苷酸 的長度設22條引物。加引物的產物經(jīng)電泳后，切取所需條帶用PCR凝膠回收 試驗盒進一步純《匕再用上下游兩末端引物擴潛35個循環(huán)后，加入25咖ol/L 濃度的daTP 1 m 1，在72攝氏度保溫15迅in。取上述PCR純化終產物約3 n 1， 用pGM-Teasy試劑盒進行TA克隆，得到克隆重組質粒。方法按Promega公司 提供的說明書進行。克隆產物經(jīng)Ecolll酶切鑒定后送博亞生物公司進行測 序，應用質粒小量提取試劑盒，提取測序正確的陽性克隆重組質粒，進行 BcoRI和BamHI雙酶切和瓊臘糖凝膠電泳后，以柱式小量切放回收試劑盒回 收400bp左右大小的電泳條帶，
(2) 載體原料的制備對質粒pc卵A3.1用EcoRI和BamHI酶切，用乙 醇沉淀法回收大片段，按l: 8的分子比用T4連接酶連接，用低溫氯化鈣法 轉化宿主L ^7/朋5oc感受態(tài)細胞，(將轉化后感受態(tài)細胞)涂布于含氯 ^青霉素(100mg/L )的LB培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)產物進行EcoRI和BamHI 酶切鑒定，進行陽性克隆.得到載體原料。
(3) 三葉因子2真核表達載體的拼裝將步驟(1)所得TFF2基因原料 與步驟(2 )所制得載體原料，按TFF2基因設計的40bp的寡核苷酸混合，用 pfu Master mix進行拼裝，結果發(fā)現(xiàn)，在第1次擴增時，電泳帶呈拖尾狀
(smearing )，并沒有發(fā)現(xiàn)有明確的條帶出現(xiàn)，但拼裝的產物經(jīng)稀釋，再兩端 的引物進行第3次擴增時，可以見到所需的420bp的條帶。在它的前后面有
較弱的梯形帶.為進一步得到更純的產物進行兗隆，將產物純化，再用末端
引物進行PCR擴增，可見到一條非常清晰的目的基因帶。為進一步克隆，將 P€R產物在Taq酶存在的條件下，進行末端加T.然后連接于PGM-T easy載體 將連接產物轉化至大腸桿菌中，經(jīng)藍-白斑篩選，隨機選取6個白色克隆做進 一步酶切鑒定。有3/6的克隆為陽性。進一步測序結果表明，拼裝的TFF2 序列與設計完全一致。又進行雙酶切將TFF2切下來連接至pcDNA3.1上，經(jīng) 轉化克隆，得到所需要的帶有TFF2的表達載體。經(jīng)酶切鑒定及測序與設計 TFF2序列完全一致。
綜上所述，本三葉因子2真核表達載^i的制備方法可減化操作步驟并提 高效率，可更好地保證產物拼裝的可靠性力
權利要求
1. 一種人三葉因子2真核表達載體的制備方法，包括步驟(1)基因拼接方法合成hTFF2(2)hTFF2進行TA克隆(3)人三葉因子2真核表達載體的構建。其特征在于:在hTFF2基因原料的制備過程中，在擴增引物并進行核苷酸純化后，進行TA克隆；在人三葉因子2真核表達載體的拼裝過程中，用pfu Master mix對hTFF2基因原料和載體原料的混合物進行拼裝。
2.如權利要求1所述的人三葉因子2真核表達載體的制備方法，其特 征在于hTFF2基因原料的制備過程包括步驟l)應用基因拼接方法合成 hTFF2表達的cDNA序列；2 )在合成物的氨基端添加BamHI酶切位點，在羧 棊端添加EcoRI和Xbal酶切點；3 )按每40bp的核苷酸的長度設計"條引 物；4)對產物進行電泳，切取條帶用PCR凝膠回收試驗盒純化；5)用上下 游兩末端引物擴增35個循環(huán)，加入25mmol/L濃度的daTP,在72攝氏度保溫 15min; 6 )用pGM"Teasy試劑盒對PCR純化產物進行TA克?。?)應用質粒 小量提取試劑盒，提取陽性克隆重組質粒，進行EcoRI和BamHI雙酶切和瓊 脂糖凝膠電沐以柱式小量切膠回收試劑盒回收400bp左右大小的電泳條帶。
3.如權利要求1所述的三葉因子2真核表達裁體的制備方法，其特征在 于載體原料的制備過程包括步驟1)對質粒pcDM3.1酶切；2)用乙醇沉 淀法回收酶切質粒大片段；3)按1: 8的分子比用T4連接酶連接質粒大片段， 得到宿主感受態(tài)細胞;.4)用低溫氯化鈣法轉化宿主感受態(tài)細胞；5)(將轉化 的感受態(tài)細胞)涂布于含氯窄青霉素100沮g/L的LB培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；6) (將培養(yǎng)產物)進行EcoRI和BamHI酶切；T)對酶切產物進行陽性克隆，
4.如權利要求1所述的人三葉因子2真核表達載體的制備方法，其特征 在于人三葉西子2真核表達載體的拼裝過程包括步驟1 )將hTFF2基因原料 與載體原料混合，用pfu Master mix進行拼裝;2)將拼裝的產物稀釋，再加 入兩端的引物進行3次擴增；3)將擴增產物純化；4)進行末端引物PCR擴 增r 5 )將PCR擴增產物在Taq酶存在的條件下，進行末端加T; 6 )將加T 產物連接于PGM-T easy載體;7)進行雙酶切將hTFF2切下來連接至pcDM3.1 上，經(jīng)轉化克隆，得到所需要的帶有hTFF2的真核表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人三葉因子2真核表達載體的制備方法包括步驟(1)hTFF2基因原料的制備，其中包括在擴增引物并進行核苷酸純化后進行TA克隆。(2)載體原料的制備。(3)人三葉因子2真核表達載體的拼裝，其中包括用pfu_Master mix對hTFF2基因原料和載體原料的混合物進行拼裝。本發(fā)明人三葉因子2真核表達載體的制備方法減化了操作步驟并提高了效率，更好地保證了產物拼裝的可靠性。
文檔編號C12N15/12GK101376889SQ200710029878
公開日2009年3月4日 申請日期2007年8月27日 優(yōu)先權日2007年8月27日
發(fā)明者張紹榮 申請人:張紹榮