專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種功能化微流控芯片及其用于pcr產(chǎn)物分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及了一種用于PCR產(chǎn)物分析的功能化微流控芯片及其用于PCR產(chǎn)物分析的方法。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是DNA研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一，通過(guò)該技術(shù)可以將模板DNA拷貝放大106倍以上以滿(mǎn)足分析需要。PCR產(chǎn)物成分是擴(kuò)增后的DNA片段，溶解于的PCR緩沖液中。傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物分析方法是凝膠電泳分離結(jié)合凝膠呈像，該方法的缺點(diǎn)是靈敏度較低，對(duì)于低拷貝的DNA模板需要較長(zhǎng)的擴(kuò)增時(shí)間。此外，基于凝膠電泳的方法還有操作繁瑣和樣品消耗量大的缺點(diǎn)。實(shí)際操作中需要一種高靈敏度、操作簡(jiǎn)便和分析速度快的PCR產(chǎn)物分析方法。微流控芯片是實(shí)現(xiàn)微流控技術(shù)的主要平臺(tái)，是指在芯片上集成系列操作單元，以可控流體經(jīng)微通道網(wǎng)絡(luò)貫穿于整個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)芯片操作。芯片毛細(xì)管電泳是微流控芯片的一種重要單元操作技術(shù)，該技術(shù)可以在微流控芯片平臺(tái)上快速高效地分離DNA片段。傳統(tǒng)的十字架式通道結(jié)構(gòu)微流控電泳芯片的樣品進(jìn)樣量很少，雖然因?yàn)檫M(jìn)樣區(qū)帶狹窄而獲得高分離度，但卻因進(jìn)樣量少不利于微流控芯片電泳檢測(cè)靈敏度的進(jìn)一步提高。在傳統(tǒng)區(qū)帶篩分電泳分離條件下，雖然增加芯片有效進(jìn)樣區(qū)帶長(zhǎng)度可以提高進(jìn)樣量，但因?yàn)榉蛛x度下降而不具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。等速電泳預(yù)濃縮是借助于不連續(xù)緩沖液實(shí)現(xiàn)的，即前導(dǎo)緩沖液和尾隨緩沖液，分別含有前導(dǎo)電介質(zhì)和尾隨電介質(zhì)。在等速電泳過(guò)程，樣品區(qū)帶介于前導(dǎo)離子和尾隨離子之間。前導(dǎo)離子的遷移速率高于PCR產(chǎn)物中所有DNA片段而尾隨離子遷移速率低于PCR產(chǎn)物中所有DNA片段。等速電泳的過(guò)程就是根據(jù)這種混合區(qū)帶中遷移速率的差異而實(shí)現(xiàn)的，而樣品區(qū)帶中不同區(qū)域場(chǎng)強(qiáng)的差異使樣品得以濃縮。等速電泳可以通過(guò)樣品預(yù)濃縮提高檢測(cè)靈敏度，但多數(shù)情況下需要前導(dǎo)和尾隨兩種緩沖液，操作較為繁瑣。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于PCR產(chǎn)物分析的功能化微流控芯片，該芯片在結(jié)構(gòu)上具有顯著加長(zhǎng)的有效進(jìn)樣通道，集成了等速電泳預(yù)濃縮和篩分電泳分離。本發(fā)明的另一目的在于提供上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，通過(guò)結(jié)合專(zhuān)用微流控芯片和分析試劑，僅需一種緩沖液即可以完成PCR產(chǎn)物的等速電泳預(yù)濃縮和濃縮后篩分電泳分離，該方法利用PCR產(chǎn)物中含有的氯離子作為等速電泳的前導(dǎo)離子而不必額外引入前導(dǎo)緩沖液。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種功能化微流控芯片，集成PCR產(chǎn)物等速電泳預(yù)濃縮和篩分電泳分離功能，該芯片由有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，其特征在于，所述的儲(chǔ)液池分別為緩沖液池、緩沖液廢液池、進(jìn)樣廢液池和樣品池，分離通道兩端分別連接緩沖液池和緩沖液廢液池，進(jìn)樣通道兩端分別連接樣品池和進(jìn)樣廢液池;分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道，所述有效進(jìn)樣通道的長(zhǎng)度范圍是0.520厘米。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述樣品池和進(jìn)樣廢液池位于分離通道的同側(cè)或異側(cè)。所述用于PCR產(chǎn)物分析的功能化微流控芯片的材料可以為硅、石英、玻璃、塑料，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、硅膠如聚二甲基硅氧烷(PDMS)等，芯片通道內(nèi)表面可以是修飾或未修飾過(guò)的。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入功能化微流控芯片的分離通道、進(jìn)樣通道、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池；(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物；(3)進(jìn)樣通過(guò)電進(jìn)樣或壓力進(jìn)樣將PCR產(chǎn)物充滿(mǎn)進(jìn)樣通道，對(duì)于電進(jìn)樣在樣品池和進(jìn)樣廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)范圍介于10V/cm10000V/cm之間，施加電壓時(shí)間為1600秒；對(duì)于壓力進(jìn)樣以正壓作用于樣品池或以負(fù)壓作用于進(jìn)樣廢液池，壓力作用時(shí)間為1180秒；(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)范圍介于50V/cm2000V/cm之間，施加電壓持續(xù)時(shí)間為30600秒；有效分離長(zhǎng)度即有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間的距離為16cm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。本發(fā)明的功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析時(shí)置于芯片分析儀中使用。芯片分析儀包括高壓電源、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。高壓電源通過(guò)電極與芯片儲(chǔ)液池連接，輸出電壓由程序控制作用于芯片兩個(gè)儲(chǔ)液池之間通道。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，采用激光誘導(dǎo)熒光、紫外等方法檢測(cè)。對(duì)于激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，所用熒光染料可以是共價(jià)標(biāo)記染料、非共價(jià)標(biāo)記染料。DNA共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、羅丹明系列、AlexaFluor系列、DABCYL、HEX、JOX、NAP、OregonGreen488、Pyrene、ROX、TAMARA、TET或Texasred等；DNA非共價(jià)標(biāo)記的熒光染料選自SYBR系列、Cyanine系列、SYTOX系列、Thiazole系列或溴乙錠等。對(duì)于紫外檢測(cè)，DNA片段可以標(biāo)記或不標(biāo)記。所述PCR產(chǎn)物中的氯離子為前導(dǎo)離子，所述緩沖液含有尾隨電介質(zhì)和DNA篩分介質(zhì)，所述尾隨電介質(zhì)的陰離子遷移速率低于DNA片段。尾隨電介質(zhì)可以是但不限于以下成份3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(MOPS)、N-(乙-羥乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)或N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS);所述DNA篩分介質(zhì)可以是但不限于羥丙纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺，既可以是單一成份，也可以是兩種或者兩種以上組分的組合。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析時(shí)，以PCR產(chǎn)物中自身含有的氯離子為前導(dǎo)離子，緩沖液中含有的尾隨電介質(zhì)陰離子作為尾隨離子，通過(guò)等速電泳方法預(yù)濃縮PCR中的DNA片段。PCR產(chǎn)物中的DNA片段等速電泳預(yù)濃縮和濃縮后篩分電泳分離同步完成，整個(gè)分析過(guò)程只需使用一種緩沖液。本發(fā)明微流控芯片上增加有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)度可以有效提高DNA片段檢測(cè)靈敏度又不損失分離度，利用等速電泳對(duì)該區(qū)間內(nèi)樣品區(qū)帶進(jìn)行壓縮實(shí)現(xiàn)預(yù)濃縮，繼而篩分電泳分離DNA片段。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析方法，利用PCR產(chǎn)物中含有的氯離子作為等速電泳的前導(dǎo)離子而不必額外引入前導(dǎo)緩沖液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明功能化微流控芯片只需要引入一種緩沖液,與現(xiàn)有技術(shù)相比減少了一種緩沖液，也減少了所需電極數(shù)目，從而簡(jiǎn)化了操作。本發(fā)明具有靈敏和快速分析的優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)提高檢測(cè)靈敏度有效減少PCR反應(yīng)時(shí)間。該方法可以實(shí)現(xiàn)靈敏、快速和簡(jiǎn)便的PCR產(chǎn)物分析。與傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片結(jié)構(gòu)相比較，本發(fā)明功能化微流控芯片通過(guò)加長(zhǎng)有效進(jìn)樣區(qū)帶提高了進(jìn)樣量，等速電泳預(yù)濃縮將PCR產(chǎn)物壓縮為狹窄區(qū)帶繼而篩分電泳分離，在顯著提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)不損失分離度。通過(guò)圖4和表1中譜圖和數(shù)據(jù)，圖1芯片結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)5(Him，而圖3芯片結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)1.9cm。圖3結(jié)構(gòu)芯片并未因進(jìn)樣量增加而損失分離度，與圖1結(jié)構(gòu)芯片相比其檢測(cè)限降低了300倍左右(表1)。與圖2中傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片結(jié)構(gòu)相比較，本發(fā)明的功能化微流控芯片減少一個(gè)緩沖液池，控制上相應(yīng)地減少一個(gè)電極。傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片的等速電泳預(yù)濃縮與篩分電泳分離是分離操作的，操作中需要切換電極；而本發(fā)明的功能化微流控芯片的等速電泳預(yù)濃縮與篩分電泳分離是同步進(jìn)行的，操作中不需要切換電極。圖1為傳統(tǒng)十字架通道式微流控電泳芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明的功能化微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明功能化微流控芯片和傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片分析標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品的電泳譜圖比較圖。圖5為本發(fā)明的功能化微流控芯片另一結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為本發(fā)明的功能化微流控芯片分析PCR產(chǎn)物的電泳圖譜。圖7為本發(fā)明分別使用有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)度為0.5cm、10cm和20cm的功能化微流控芯片的分析標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品電泳譜圖。圖8為本發(fā)明功能化微流控芯片分析得到的另一DNA樣品電泳譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。圖l、圖2、圖3分別是傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片、傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片和本發(fā)明的功能化微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，樣品池3和樣品廢液池4之間為進(jìn)樣通道，緩沖液池1和緩沖液廢液池4之間為分離通道，進(jìn)樣通道與分離通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。圖l、圖2、圖3對(duì)應(yīng)的有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)度分別為50nm、1.9cm、1.9cm。圖1是傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片，通道為十字架結(jié)構(gòu)，有4個(gè)儲(chǔ)液池，緩沖液池l、緩沖液廢液池2、進(jìn)樣廢液池3和樣品池4，其分析步驟為(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入芯片的分離通道、進(jìn)樣通道、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池；(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物；(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，樣品池4連接電極接地；(4)分離和檢測(cè)緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，緩沖液池1連接電極接地。圖2是傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片，有5個(gè)儲(chǔ)液池，分別是緩沖液池l、緩沖液廢液池2、進(jìn)樣廢液池3、樣品池4和前導(dǎo)緩沖液池5，其分析步驟為(l)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將前導(dǎo)緩沖液引入芯片的分離通道、進(jìn)樣通道、前導(dǎo)緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池；(2)緩沖液池中加入尾隨緩沖液；(3)在樣品池加入PCR產(chǎn)物；(4)進(jìn)樣3號(hào)池連接電極輸出電壓，4號(hào)池連接電極接地；(5)灌注尾隨緩沖液進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地；(6)等速電泳預(yù)濃縮緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地；(7)分離緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，前導(dǎo)緩沖液池5連接電極接地。圖3是本發(fā)明的功能化微流控芯片，有4個(gè)儲(chǔ)液池，分別是緩沖液池l、緩沖液廢液池2、進(jìn)樣廢液池3和樣品池4，其分析步驟為(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入功能化微流控芯片的分離通道、進(jìn)樣通道、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池；(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物；(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，樣品池4連接電極接地；(4)等速電泳預(yù)濃縮、分離和檢測(cè)緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地。實(shí)施例1采用PMMA材質(zhì)的功能化微流控芯片，構(gòu)型如圖3所示，芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，4個(gè)儲(chǔ)液池分別是緩沖液池1、緩沖液廢液池2、樣品池3和進(jìn)樣廢液池4。樣品池3和進(jìn)樣廢液池4位于分離通道的異側(cè)。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。所有通道尺寸為寬度50pm,深度20nm，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)1.9cm,芯片通道內(nèi)表面未修飾。尾隨電介質(zhì)為N-(乙-羥乙基)哌嗪-N-2乙垸磺酸(HEPES)，DNA篩分介質(zhì)為3%(質(zhì)量體積百分比，單位是g/100ml)羥乙基纖維素。樣品為①xl74ifoel11Digest,總DNA含量為2.5pg/pL，有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于lxPCR反應(yīng)緩沖液，含有60mmol/L氯離子。作為對(duì)照采用圖1結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片進(jìn)行常規(guī)的無(wú)膠篩分分離，通道尺寸同為50nm寬，20lam深，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)50|nm，樣品為<E>x174/foelllDigest,總DNA含量為500pg/nL，樣品溶解于lxPCR反應(yīng)緩沖液，含有60mmol/L氯離子。采用兩種芯片分析方法的DNA標(biāo)記染料都是SYBRGreen,其在緩沖液中濃度為lnmol/L。激光激發(fā)波長(zhǎng)為473nm，得到的電泳比較圖譜如圖4所示，譜圖A為采用圖1結(jié)構(gòu)芯片獲得，而譜圖B為采用圖3結(jié)構(gòu)芯片獲得。與圖1傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片相比,本發(fā)明的集成式微流控芯片并未因進(jìn)樣量增加而損失分離度，除271/281堿基對(duì)片段外，其它片段都達(dá)到基線(xiàn)分離，其分離度與十字架式芯片相當(dāng)。通過(guò)表1的計(jì)算(表1是圖4中有無(wú)等速電泳預(yù)濃縮微流控芯片Oxl74HaeIIIDigestDNA片段檢測(cè)限的比較)，與傳統(tǒng)十字架式微流控電泳芯片相比，該結(jié)構(gòu)微流控芯片檢測(cè)限降低了300倍左右。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液(尾隨電介質(zhì)為N-(乙-羥乙基)哌嗪-N-2乙垸磺酸(HEPES)，DNA篩分介質(zhì)為3。/。羥乙基纖維素)引入芯片通道所有部分(分離通道和進(jìn)樣通道)、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池。(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物。(3)進(jìn)樣樣品池接地，進(jìn)樣廢液池施加電壓，二者之間場(chǎng)強(qiáng)10000V/cm，施加電壓時(shí)間l秒。(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)500V/cm，施加電壓時(shí)間500秒。檢測(cè)器位于分離通道中檢測(cè)PCR產(chǎn)物信號(hào)，有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間距離為lcm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。實(shí)施例2所用玻璃材質(zhì)的功能化微流控芯片構(gòu)型如圖5所示，芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，4個(gè)儲(chǔ)液池分別是緩沖液池1、緩沖液廢液池2、樣品池3和進(jìn)樣廢液池4。樣品池3和進(jìn)樣廢液池4位于分離通道的同側(cè)。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。芯片通道尺寸為寬度50^im，深度20拜，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)1.9cm，有效進(jìn)樣通道的寬度5(Hmi。芯片通道內(nèi)表面用線(xiàn)性聚丙烯酰胺迸行修飾。利用此芯片分析一個(gè)120堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，并以DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品作為內(nèi)參照。緩沖液含有20mmol/LMOPS為尾隨電介質(zhì)，以及40mmol/L咪唑，lumol/LSYBRGreen作為插入式標(biāo)記染料和2X羥丙甲級(jí)纖維素作為DNA篩分介質(zhì)。DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品包含100、250、500、750、1000、2000bp片段。采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，得到的電泳圖譜如圖6所示，包括PCR產(chǎn)物與DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品在內(nèi)的所有片段均得到基線(xiàn)分離，圖中所標(biāo)注數(shù)字為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的堿基對(duì)數(shù)目。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入芯片通道所有部分及緩沖液池和緩沖液廢液池。(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物。(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池連接負(fù)氣壓，持續(xù)時(shí)間180秒。(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)1000V/cm，施加電壓時(shí)間350秒。檢測(cè)器位于分離通道中檢測(cè)PCR產(chǎn)物信號(hào)，有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間距離為3cm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。實(shí)施例3采用PDMS材質(zhì)的功能化微流控芯片，構(gòu)型如圖3所示，芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，4個(gè)儲(chǔ)液池分別是緩沖液池1、緩沖液廢液池2、樣品池3和進(jìn)樣廢液池4。樣品池3和進(jìn)樣廢液池4位于分離通道的異側(cè)。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。所有通道尺寸為寬度150拜，深度50|nm，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)分別為0.5^11、10cm和20cm，寬度均為150^im，芯片通道內(nèi)表面進(jìn)行了修飾。樣品為0)xl74/fee111Digest,總DNA含量為2.5pg/pL，有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于PCR反應(yīng)緩沖液中，含有60mmol/L氯離子。分離緩沖液成份為20mmol/LTAPS為尾隨電介質(zhì)，以及40mmol/L咪唑，2X聚乙烯醇作為DNA篩分介質(zhì)。采用紫外檢測(cè)器。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入芯片通道所有部分及緩沖液池和緩沖液廢液池。(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物。(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池連接負(fù)h壓，持續(xù)時(shí)間10秒。(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)50V/cm，施加電壓時(shí)間600秒。檢測(cè)器位于分離通道中檢測(cè)PCR產(chǎn)物信號(hào)，有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間距離為6cm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。電泳譜圖如圖7所示，自上而下依次為有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)分別為0.5cm、10cm和20cm芯片得到的電泳譜圖。實(shí)施例4采用PC材質(zhì)的功能化微流控芯片，構(gòu)型如圖3所示，芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，4個(gè)儲(chǔ)液池分別是緩沖液池1、緩沖液廢液池2、樣品池3和進(jìn)樣廢液池4。樣品池3和進(jìn)樣廢液池4位于分離通道的異側(cè)。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。所有通道尺寸為80nmx30nm，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)2cm，芯片通道內(nèi)表面進(jìn)行了修飾。樣品為Oxl74i/"el11Digest,總DNA含量為2.5pg/pL，有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于PCR反應(yīng)緩沖液中，含有60mmol/L氯離子。分離緩沖液成份為20mMTAPS/40mmol/L咪唑，pH值7.2，緩沖液中含有l(wèi)Mmol/LSYTOX作為標(biāo)記染料和1.8。/。羥丙基纖維素、0.48。/。羥乙基纖維素作為DNA篩分介質(zhì)。采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入芯片通道所有部分及緩沖液池和緩沖液廢液池。(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物。(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池連接負(fù)氣壓，持續(xù)時(shí)間10秒。(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)1000V/cm，施加電壓時(shí)間350秒。檢測(cè)器位于分離通道中檢測(cè)PCR產(chǎn)物信號(hào)，有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間距離為4cm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。電泳譜圖如圖8所示。實(shí)施例5比較圖2和圖3結(jié)構(gòu)微流控芯片的檢測(cè)限，檢測(cè)均采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，分離距離4cm。圖2是傳統(tǒng)等速電泳和篩分電泳集成微流控芯片，有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)1.9cm，有5個(gè)儲(chǔ)液池，分別是緩沖液池l、緩沖液廢液池2、進(jìn)樣廢液池3、樣品池4和前導(dǎo)緩沖液池5。樣品為總DNA含量2.5pg/^L的0>xl74HaeIIIDigest,有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于去離子水中。其分析步驟為(1)首先將前導(dǎo)緩沖液灌入芯片通道、緩沖液廢液池、進(jìn)樣廢液池和前導(dǎo)緩沖液池，成份為15mmol/L鹽酸為前導(dǎo)電介質(zhì)，以及36mmol/L咪唑，lpmol/LSYBRGreen作為標(biāo)記染料和2%聚乙烯醇作為DNA篩分介質(zhì)；(2)將尾隨緩沖液加入緩沖液池，成份為20mMHEPES做為尾隨電介質(zhì)，以及40mmol/L咪唑；(3)將PCR產(chǎn)物加入樣品池4;(4)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，樣品池4連接電極接地；(5)灌注尾隨緩沖液進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地；(6)等速電泳預(yù)濃縮緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地；(7)分離和檢測(cè)緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，前導(dǎo)緩沖液池5連接電極接地。圖3是本發(fā)明的功能化微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，其有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)度為1.9cm，該芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池，分別是緩沖液池l、緩沖液廢液池2、進(jìn)樣廢液池3和樣品池4。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。樣品為總DNA含量2.5pg/^iL的0>xl74HaeIIIDigest,有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于PCR反應(yīng)緩沖液中，含有60mmol/L氯離子。分析步驟為(1)首先將緩沖液導(dǎo)入芯片通道及緩沖液池和緩沖液廢液池，成份為20mmol/LHEPES/40mmol/L咪唑，pH值7.2，含有l(wèi)^mol/LSYBRGreen作為標(biāo)記染料和2%聚乙烯醇作為DNA篩分介質(zhì)；(2)將樣品加入樣品池4;(3)進(jìn)樣進(jìn)樣廢液池3連接電極輸出電壓，樣品池4連接電極接地；(4)等速電泳濃縮與分離緩沖液廢液池2連接電極輸出電壓，緩沖液池l連接電極接地。圖2和圖3結(jié)構(gòu)芯片的檢測(cè)限比較見(jiàn)表2。圖3與圖2結(jié)構(gòu)微流控芯片檢測(cè)限相當(dāng)，而減少一種緩沖液，簡(jiǎn)化了分析操作。實(shí)施例6采用玻璃材質(zhì)的功能化微流控芯片，構(gòu)型如圖3所示，芯片有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，4個(gè)儲(chǔ)液池分別是緩沖液池1、緩沖液廢液池2、樣品池3和進(jìn)樣廢液池4。樣品池3和進(jìn)樣廢液池4位于分離通道的異側(cè)。分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道。所有通道尺寸為寬度3(Him，深度15拜,有效進(jìn)樣通道長(zhǎng)0.5cm，芯片通道內(nèi)表面經(jīng)修飾。尾隨電介質(zhì)為N-(乙-羥乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)，DNA篩分介質(zhì)為3%(質(zhì)量體積百分比(g/100m1))羥乙基纖維素。樣品為0>xl74//aelllDigest,總DNA含量為2.5pg^iL，有72至1382堿基對(duì)的11個(gè)DNA片段。樣品溶解于lxPCR反應(yīng)緩沖液，含有60mmol/L氯離子。DNA標(biāo)記染料是SYBRGreen，其在緩沖液中濃度為lpmol/L。激光激發(fā)波長(zhǎng)為473nm，得到的電泳比較圖譜如圖8所示。上述功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液(尾隨電介質(zhì)為N-(乙-羥乙基)哌嗪-N-2乙垸磺酸(HEPES)，DNA篩分介質(zhì)為3y。羥乙基纖維素)引入芯片通道所有部分(分離通道和進(jìn)樣通道)、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池。(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物。(3)進(jìn)樣樣品池3接地，進(jìn)樣廢液池4施加電壓，二者之間場(chǎng)強(qiáng)10000V/cm，施加電壓時(shí)間1秒。(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)2000V/cm，施加電壓時(shí)間30秒。檢測(cè)器位于分離通道中檢測(cè)PCR產(chǎn)物信號(hào)，有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間距離為lcm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。表1有無(wú)等速電泳預(yù)濃縮微流控芯片Oxl74/foelllDigestDNA片段檢測(cè)限<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2圖2與圖3結(jié)構(gòu)微流控芯片分析①xl74ifoeinDigest系列DNA片段檢測(cè)限的比較DNA片段DNA圖2結(jié)構(gòu)微流控芯片圖3結(jié)構(gòu)微流控芯<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種功能化微流控芯片，所述芯片由有4個(gè)儲(chǔ)液池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，其特征在于所述的儲(chǔ)液池分別為緩沖液池、緩沖液廢液池、進(jìn)樣廢液池和樣品池，分離通道兩端分別連接緩沖液池和緩沖液廢液池，進(jìn)樣通道兩端分別連接樣品池和進(jìn)樣廢液池；分離通道和進(jìn)樣通道重疊區(qū)域?yàn)橛行нM(jìn)樣通道；所述有效進(jìn)樣通道的長(zhǎng)度范圍是0.5～20厘米。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化微流控芯片，其特征在于所述樣品池和進(jìn)樣廢液池位于分離通道的同側(cè)或異側(cè)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化微流控芯片，其特征在于所述集等速電泳預(yù)濃縮和分離功能的微流控芯片的材料是石英、玻璃、塑料或硅膠。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的功能化微流控芯片，其特征在于所述塑料為聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯，所述硅膠為聚二甲基硅氧烷。5、權(quán)利要求1所述的功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，其特征在于包括如下步驟(1)緩沖液引入芯片通過(guò)壓力將緩沖液引入功能化微流控芯片的分離通道、進(jìn)樣通道、緩沖液池、進(jìn)樣廢液池和緩沖液廢液池；(2)在樣品池加入PCR產(chǎn)物；(3)進(jìn)樣通過(guò)電進(jìn)樣或壓力進(jìn)樣將PCR產(chǎn)物充滿(mǎn)進(jìn)樣通道，對(duì)于電進(jìn)樣在樣品池和進(jìn)樣廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)范圍介于10V/cm10000V/cm之間，施加電壓時(shí)間為1600秒；對(duì)于壓力進(jìn)樣以正壓作用于樣品池或以負(fù)壓作用于進(jìn)樣廢液池，壓力作用時(shí)間為1180秒；(4)等速電泳濃縮、分離和檢測(cè)在緩沖液池和緩沖液廢液池之間施加電壓，場(chǎng)強(qiáng)范圍介于50V/cm2000V/cm之間，施加電壓持續(xù)時(shí)間為30600秒；有效分離長(zhǎng)度即有效進(jìn)樣通道末端與檢測(cè)器之間的距離為16cm，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物信號(hào)經(jīng)檢測(cè)處理輸出電泳圖譜即可用于PCR產(chǎn)物分析。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的功能化微流控芯片用于PCR產(chǎn)物分析的方法，其特征在于所述PCR產(chǎn)物中的氯離子為前導(dǎo)離子，所述緩沖液含有尾隨電介質(zhì)和篩分介質(zhì)，所述尾隨電介質(zhì)包括3-(N-嗎啡啉)丙磺酸、N-(乙-羥乙基)哌嗪-]^-2乙烷磺酸或^[-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸；所述DNA篩分介質(zhì)包括羥丙纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚維酮、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚丙烯酰胺中的一種或兩種或者兩種以上。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種功能化微流控芯片及用于PCR產(chǎn)物分析的方法，該芯片由緩沖液池、緩沖液廢液池、進(jìn)樣廢液池、樣品池、分離通道和進(jìn)樣通道組成，分離通道兩端分別連接緩沖液池和緩沖液廢液池，進(jìn)樣通道兩端分別連接樣品池和進(jìn)樣廢液池，有效進(jìn)樣通道的長(zhǎng)度是0.5～20厘米。本發(fā)明方法結(jié)合了等速電泳預(yù)濃縮和篩分電泳分離，緩沖液中含有尾隨電介質(zhì)和DNA篩分介質(zhì)，以PCR產(chǎn)物中自含氯離子為前導(dǎo)離子。該芯片只需要引入一種緩沖液，減少了所需電極數(shù)目，簡(jiǎn)化了操作，具有靈敏和快速分析的優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)提高檢測(cè)靈敏度有效減少PCR反應(yīng)時(shí)間。本發(fā)明可以靈敏、快速和簡(jiǎn)便地進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101157952SQ200710030809公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2007年10月12日優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日發(fā)明者劉大漁申請(qǐng)人:廣州陽(yáng)普醫(yī)療用品有限公司