專利名稱：強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因irs-1突變基因及其檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地是涉及一種檢測強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的致病基因所在的 單倍型區(qū)域以及區(qū)內(nèi)的致病相關(guān)的IRS-1突變基因的方法、試劑盒以及IRS-1突變基因。
背景技術(shù)：
強(qiáng)直性脊柱炎屬于風(fēng)濕病范疇，是血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病中的一種。目前，強(qiáng)直性脊柱炎 是一種原因尚不很明確，家族史中有同樣疾病或HL AB27陽性，以脊柱為主要病變的慢性 疾病，病變主要累及骶髂關(guān)節(jié)，引起脊柱強(qiáng)直和纖維化，造成彎腰、行走活動受限，并可有 不同程度的眼、肺、肌肉、骨骼的病變，也有自身免疫功能的紊亂，所以又屬自身免疫性疾 病。
Sun等人于1991年分離了一段cDNA，編碼160-185kD的磷酸酪氨酸蛋白，這個(gè)蛋白作 為胰島素受體酪氨酸激酶的一個(gè)底物，被認(rèn)為參與了胰島素信號傳導(dǎo)。這個(gè)蛋白，目前命名 為胰島素受體底物-1 (IRS-1)，目前認(rèn)為，I RS—1是胰島素信號胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要分子， 為胰島素多種生物調(diào)節(jié)作用的中間體，在對胰島素反應(yīng)的許多細(xì)胞和組織中均可找到。它不 顯示內(nèi)在酶的活性，但是相信是作為一個(gè)停靠蛋白，在被胰島素受體激酶磷酸化其酪氨酸后 結(jié)合和激活其他的信號傳導(dǎo)分子。
Stoffel等人從 個(gè)人類男性胎盤的基因庫里克隆了 IRS-1基因。應(yīng)用來自人鼠體細(xì)胞嵌 合雜種的DNA做PCR，他們定位該基因于2號染色體，利用原位雜交熒光技術(shù)，他們將區(qū) 域定在2q35-36.1。利用基因克隆及原位雜交熒光技術(shù)，Nishivama等人在1994年把IRS-1基 因定位在2q36。 Araki等人在1993年同樣把該基因定位在這個(gè)區(qū)域，同時(shí)定位鼠的同源基因 位于l號染色體。Stoffd等人還亍1993年鑒定了一個(gè)有助于基因研究的簡單串連重復(fù)序列 (STR)的DNA多態(tài)性。由于信號傳導(dǎo)途徑的中心法則，IRS-1可作為在非胰島素依賴性糖 尿病(NIDDM)中胰島素功能缺陷位點(diǎn)的一個(gè)候選點(diǎn)。
胰島素與其受體結(jié)合后引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亞基IRS-1及IRS2的磷酸化，此過程與幾個(gè)包含 Src同源區(qū)2 (SH2)區(qū)域的蛋白有關(guān)。為了鑒別IRS-1唯一的結(jié)合蛋白，Ogihara等人于1997 年用重組IRS-1掃描了人心臟cDNA文庫，他們獲得了 14-3-3 (YWHA)蛋白家族的亞型， 分別命名為14-3-3-epsilon和14-3-3-zeta。 14-3-3蛋白已經(jīng)證實(shí)在L6肌管細(xì)胞、HepG2肝細(xì) 胞瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞和牛的腦組織中與IRS-1有關(guān)。IRS-2是一個(gè)與IRS-1結(jié)構(gòu)相似 的蛋白，在桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)里亦顯示能與14-3-3蛋白形成復(fù)合物。與IRS-1有關(guān)的14-3-3 的數(shù)量不受胰島素激活的影響，但是在岡田酸， 一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸脂酶抑制劑，處理后 顯著增多。用IRS-1的含有磷酸絲氨酸的多肽進(jìn)行的多態(tài)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，IRS-1包含了3個(gè)
14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)(Ser-270, Ser-374, Ser-641)。在這三個(gè)位點(diǎn)中，圍繞270位絲氨酸的序列 位于IRS-l的磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域與胰島素受體(INSR)的相互作用有 關(guān)。實(shí)際上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明IRS-l的缺失突變但是仍然帶有PTB區(qū)域的仍然保留結(jié)合14-3-3的 能力。Ogiham等人還研究了 14-3-3蛋白與胰島素介導(dǎo)磷酸化的IRS-l結(jié)合后的作用。磷酸 化氨基酸研究顯示，在酪氨酸和絲氮酸殘基上，對比與抗IRS-l抗體免疫沉淀后的IRS-1，與 抗14-3-3抗體共免疫沉淀后的IRS-l很難被胰島素激活磷酸化。由此作者提示，與14-3-3蛋 白的關(guān)聯(lián)可能在通過阻斷胰島素受體與IRS-l關(guān)系從而調(diào)節(jié)胰島素敏感性的過程中扮演一部 分角色。
目前為止，除了從臨床癥狀以及影像學(xué)資料來判斷強(qiáng)直性脊柱炎，還未有實(shí)驗(yàn)室診斷試 劑用來對強(qiáng)直性脊柱炎進(jìn)行確定的診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的一個(gè)技術(shù)問題提供強(qiáng)直性脊柱炎致病基因所在的單倍型區(qū)域以及區(qū)內(nèi) 的致病相關(guān)的IRS-l突變基因。
解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下
一種強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-l突變基因，該IRS-l突變基因含有IRS-l基因序 列，并且還含有2759C—G雜合突變。
進(jìn)一步地，該IRS-l突變基因還含有2727 C—T， 3419T—A， rs6725556 T—C， -3637A—T, -3295 G—T， rs6436635 G—A， rs3731597 G—A， 3' UTR707G—T， -2990C—T 或rsl801278 A—G雜合或純合突變中的一種或一種以上。
上述強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-l突變基因的編碼的蛋白質(zhì)具有580R—G (Arg->Gly)突變位點(diǎn)。
本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問題是提供一種檢測上述強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-l 突變基因的方法。
一種檢測上強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-l突變基因的方法，從待測樣品中得到的核 苷酸酸序列與IRS-l正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，核對突變位于IRS-l基因的2759位點(diǎn)，由C 突變?yōu)閴A基G。
所述檢測方法主要包括以下步驟，
1) 提取待檢測樣本中的DNA;
2) 以該DNA為模板，以針對IRS-l基因或者IRS-l基因第2759個(gè)堿基附近的 編碼區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn) 物；
3) 測出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的堿基序列組成；
4) 將所得到的序列與IRS-1正常基因的序列進(jìn)行比較，確定2759位突變?yōu)閴A基 G。
優(yōu)選地，PCR反應(yīng)中的引物的堿基組成為 IRS-1墨F: CGGATGAGTATGGCTCCAGT IRS-1-R: ACCTCCAATGTCAGGAGAGC。
所述測出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的堿基序列組成可以是將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在測序儀測序或與特異 性探針雜交測序。
進(jìn)一步地，通過BLAST比對，按正常讀碼框架進(jìn)行翻譯以確定是否存在R580G氨基 酸突變位點(diǎn)。
待檢測樣本可為血液、體液或者組織等。另外，還可用其他方法實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)的檢出， 包括熒光定量PCR，變性高效液相色譜(dHPLC)技術(shù)，限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP)，連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)等。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎的試劑盒。
一種用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因的試劑盒，主要包括有
以針對IRS-1基因或者IRS-1基因第2759個(gè)堿基附近的編碼區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物，Taq DNA聚合酶和相應(yīng)緩沖液。
本發(fā)明的另一目的是提供強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因在制備治療疾病 中的藥物中的應(yīng)用。
所述的強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因在制備治療強(qiáng)直性脊柱炎的藥物中
的應(yīng)用
通過構(gòu)建含有野生型IRS1基因的病毒載體，制備成治療藥物，將其導(dǎo)入強(qiáng)直性脊柱炎 患者體內(nèi)，改善AS患者的骨代謝異常及由此誘發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明選取IRS-1基因作為研究對象，通過在一個(gè)三代系譜的強(qiáng)直性脊柱炎家族(8個(gè) AS患者，18個(gè)非患者)，97個(gè)散發(fā)AS患者及122個(gè)健康對照者中進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)在家系患 者中，所有的患者均具有IRS-1基因的新的突變位點(diǎn)(2759C—G, R580G)，這一突變位點(diǎn)在 家系其它非患者中均沒有發(fā)現(xiàn)，說明這一突變位點(diǎn)與強(qiáng)直性脊柱炎共分離。且這一位點(diǎn)另外 3個(gè)散發(fā)AS患者中得到驗(yàn)證，而其它122個(gè)健康對照者沒有發(fā)現(xiàn)此突變位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了 此突變位點(diǎn)與AS的相關(guān)性。
本發(fā)明通過全基因組掃描及連鎖分析表明該區(qū)域?yàn)閺?qiáng)直性脊柱炎易感區(qū)域，且此區(qū)域內(nèi) 的基因IRS-1是強(qiáng)直性脊柱炎的疾病相關(guān)基因。本發(fā)明所述的IRS-1突變基因與強(qiáng)直性脊柱 炎相關(guān)，另外在散發(fā)患者中還發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)與AS相關(guān)。該突變基因以及其相關(guān)檢測方 法和試劑盒將有利于臨床上開展強(qiáng)直性脊柱炎患者的IRS-1突變篩查工作，可為于臨床上AS 家系及散發(fā)患者的初篩或協(xié)助診斷提供相關(guān)的信息以供參考，而且，同時(shí)也為相關(guān)藥物的開 發(fā)提供必要手段。IRS-1亦可望作為藥物治療的耙點(diǎn)，例如基因治疔。另外，治療策略還包括 人工合成誘變劑，誘導(dǎo)突變修復(fù)，使突變型等位基因修復(fù)為野生型，以突變點(diǎn)為靶向的基因 治療；人工合成IRS1多肽，代償性治療等。
總體而言，本發(fā)明所述的IRS-1突變基因和檢測方法將有利于進(jìn)一步研究強(qiáng)直性脊柱炎 的致病機(jī)理，在臨床上開展強(qiáng)直性脊柱炎患者的IRS-1突變篩査工作，為強(qiáng)直性脊柱炎患者 診斷和治療提供相關(guān)可參考的信息。 說明書附圖


圖1是Cyrillic軟件構(gòu)建的AS家系的單體型圖譜；
圖2是構(gòu)建家系圖譜實(shí)驗(yàn)流程示意圖3是實(shí)施例2的PCR反應(yīng)條件示意圖
圖4是實(shí)施例2的PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)條件示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
在全國范圍內(nèi)收集AS家系，(8個(gè)AS患者，18個(gè)非患者)，97個(gè)散發(fā)AS患者及122 個(gè)健康對照者中進(jìn)行篩查。所有患者均經(jīng)過風(fēng)濕科專家的確診，符合19994年修訂的紐約標(biāo) 準(zhǔn)。利用Cyrillic 2.0軟件構(gòu)建家系圖譜。通過對家系系譜分析后，可以發(fā)現(xiàn)以下特點(diǎn)l)連 續(xù)三代均有患者，連續(xù)傳遞。2)患者既有女性又有男性，且男女患病機(jī)會均等。故發(fā)現(xiàn)在兩 個(gè)家系符合常染色體顯性遺傳模式。 實(shí)驗(yàn)流程參見圖2.
微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)
l.全基因組掃描微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)
選用ABI公司PRISMRLinkageMapping Sets-MDIO Version 2.0試劑盒中的微衛(wèi)星標(biāo)記引 物，共有400個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物，覆蓋22條常染色體(382個(gè))盒X染色體(18個(gè))。400 個(gè)標(biāo)記均來自于法國Genethon人類遺傳多樣性中心(CEPH)所發(fā)表的5264個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記 [4](Dibetal，1996)。該套標(biāo)記均為二核甘酸重復(fù)。在CEPH群體中的平均雜合度為70%以上， 且均在CEPH家系中得到了遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。
400個(gè)遺傳標(biāo)記為ABI公司專門從上述發(fā)表的5264個(gè)標(biāo)記中選出，均通過PCR進(jìn)行標(biāo)
準(zhǔn)化檢測，部分用于PCR的引物經(jīng)過了調(diào)整和重新設(shè)計(jì)。PCR的退火溫度在55—63t:之間。 由于二核甘酸序列在擴(kuò)增時(shí)易因?yàn)門叫DNA聚合酶的低修復(fù)活性而產(chǎn)生產(chǎn)物末端加A的情 況，該公司還專門設(shè)計(jì)了特殊的修飾使該效應(yīng)降至最低。
382個(gè)遺傳標(biāo)記均采用PCR擴(kuò)增檢測，檢測的PCR產(chǎn)物的片段長度-般在90—400bp 范圍內(nèi)。用于擴(kuò)增的一對引物中的一條的5'末端經(jīng)過了熒光標(biāo)記。由于ABI377型DNA測 序儀可以同時(shí)檢測4種熒光(R0X或TAMARA、 FAM、 HEX、 NED)，因此每條被標(biāo)記的引 物都經(jīng)過了 FAM(藍(lán)色)、HEX(綠色)或NED(黃色)標(biāo)記(紅色的ROX或TAMARA用于泳道內(nèi) 分子量標(biāo)記)。
多重PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記
將欲擴(kuò)增的位點(diǎn)根據(jù)產(chǎn)物范圍大小、熒光標(biāo)記顏色進(jìn)行分組，每組10-16個(gè)位點(diǎn)，多數(shù) 為12-14個(gè)，對于在多重體系中擴(kuò)增效果不好，可以另組為新組或單擴(kuò)增，若單位點(diǎn)擴(kuò)增仍 沒有PCR產(chǎn)物或產(chǎn)物峰型不好，則放棄進(jìn) 步試驗(yàn)。
PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳，數(shù)據(jù)收集應(yīng)用ABIPRISMR 3700 Data Collection Software v2.0。
連鎖分析
1.連鎖分析所用的軟件
(1)采用LINKAGE5.1軟件包對家系進(jìn)行連鎖分析。
LINKAGE軟件包的核心是一系列估計(jì)重組率的最大或似然率，計(jì)算LOD值，以及分 析遺傳風(fēng)險(xiǎn)率的程序。整個(gè)軟件包分為兩組。 一組用于普通家系和通常的致病位點(diǎn)。另一組 用于三代家系和共顯性遺傳位點(diǎn)，主要用于構(gòu)建核心家庭的遺傳圖譜。實(shí)際應(yīng)用中多采用第 一部分o
2..在進(jìn)行非參數(shù)連鎖分析的時(shí)候，不需要設(shè)定遺傳模式和遺傳參數(shù)，主要分析家系中搜有患 者的血緣一致性(IBD)，計(jì)算非參數(shù)連鎖的分值(NPL)和相應(yīng)的p值，p值〈0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義，p<0.01時(shí)就可以證實(shí)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的位點(diǎn)與該病連鎖。而要在染色體上確定一個(gè)新的致病 相關(guān)基因位點(diǎn)，pO.0002才能說明是有意義連鎖，pO.0074說明是支持連鎖。(LanderE, Kruglyak L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. Nat Genet 1995,11:241-247.) GENEHUNTER的運(yùn)算過程中需要兩個(gè)文件，家系文件 (Linkped.pre)和參數(shù)文件(Linkloci.dat)，這兩個(gè)文件通過Checkped軟件實(shí)現(xiàn)。 精細(xì)定位微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)
全基因組掃描結(jié)果用LINKAGE軟件包計(jì)算各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的LOD值，得到致病基因連 鎖區(qū)域的初步定位結(jié)果，然后借助數(shù)據(jù)庫從連鎖區(qū)域選擇更多微衛(wèi)星標(biāo)記。對于精細(xì)定位所 需的微衛(wèi)星標(biāo)記，在http:〃research.marshfieldcliiiic. org/網(wǎng)站中查詢微衛(wèi)星標(biāo)記的信息，包 括其遺傳距離、片斷大小和雜合度，根據(jù)這些信息進(jìn)行選擇在定位區(qū)域內(nèi)遺傳距離為lcM左 右，雜合度在7.5以上的微衛(wèi)星標(biāo)記，然后在httP:〃ww.ncbi.nlm.nih.bOT/網(wǎng)站上找到這些 微衛(wèi)星標(biāo)記的引物序列，并進(jìn)一步找出這些微衛(wèi)星標(biāo)記的物理距離，引物合成時(shí)根據(jù)片斷大 小在引物的一段標(biāo)記FAM或HEX熒光標(biāo)記。 單倍型構(gòu)建
利用Cyrillic軟件，將分析所得的基因型結(jié)果輸入，產(chǎn)生一個(gè)家系圖譜，圖譜中可以顯 示家系中各代的每個(gè)成員的多個(gè)遺傳標(biāo)記的分型信息。對這些信息根據(jù)上下代遺傳關(guān)系進(jìn)行 手動調(diào)節(jié)即可排列出每個(gè)個(gè)體的單倍型。根據(jù)單倍型在患者個(gè)體中共享的情況，可以發(fā)現(xiàn)交
換的發(fā)生進(jìn)而可得到最終由所有患者共享的一段最小的區(qū)域。結(jié)果
1. 全基因組掃描結(jié)果
將所有區(qū)域的包含各個(gè)Marker信息的數(shù)據(jù)文件在LINKAGE5.2軟件上運(yùn)算計(jì)算各個(gè) Marker的LOD SCORE (重組率分別為0=0.0， 0=0.1， 0=0.2， 0=0.3， 0=0.4， 0=0.5)。
2. 精細(xì)定位結(jié)果
在所挑選的D2S1371 — D2S377和D2S1349 — D2S2158兩個(gè)遺傳區(qū)域按照http: 〃research.marshfieldclinic.org/遺傳圖譜信息在選擇多態(tài)性微衛(wèi)星Marker進(jìn)行g(shù)enescan及基因 分型。
3. 單體型分析結(jié)果
根據(jù)Genome Database圖譜上的遺傳標(biāo)記順序用Cyrillic軟件構(gòu)建了這個(gè)家系的單體型 (圖l)。通過分析受累個(gè)體中是否有交換重組事件，將該疾病的致病基因定位于D2S377 — D2S1349之間。
在這個(gè)AS家系中，所有的AS患者均發(fā)現(xiàn)C/C->C/G的變異點(diǎn)，導(dǎo)致第580氨基酸從精氨 酸變?yōu)楦拾彼?2759位SNP, C/C->C/G;580R—G(Arg-〉Gly)BLOSUM80值-4, 74-100PAM 值-1.0， residue replace ability matrix: -0.11，疏水性R 0.60， G 0.07。這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的變異點(diǎn) 在另外3個(gè)散發(fā)A S患者中得到重復(fù)證實(shí)。
另外，在擴(kuò)展的散發(fā)AS患者和其他家系A(chǔ)S患者中有4位患者另外發(fā)現(xiàn)此基因中的2個(gè) 變異點(diǎn)，它們分別為1)2727位未知SNP, C/C->C/T，導(dǎo)致氨基酸變化脯氨酸->亮氨酸， PAM100:-2.2， BLOSUM80:-5。 2)rsl801278， G/G>G/A，甘氨酸>精氨酸。
實(shí)施例2
強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因的檢測
用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因的試劑盒，主要包括有 擴(kuò)增含IRS-1的2759位點(diǎn)基因片段的PCR引物，Taq DNA聚合酶和相應(yīng)緩沖液。 PCR引物如下
上游引物IRS-l-F: CGGATGAGTATGGCTCCAGT 下游弓i物IRS-1-R: ACCTCCAATGTCAGGAGAGC。 -% 待測對象血樣DNA的制備
1. 研究對象臨床上所有具有炎癥下腰痛的風(fēng)濕病患者，或者疑似強(qiáng)直性脊柱炎的患者。
2. 基因組DNA提取應(yīng)用改良Miller法a.取檸檬酸鈉或EDTANa2抗凝全血3—5ml (盡量不用肝素抗凝)，置于50.0ml有蓋 離心管中；
b. 加入5—8倍體積(約40ml，將離心管加滿即可)冷蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，在低 溫下3600rpm，離心20分鐘；
c. 緩慢傾倒上清，在沉淀中加入預(yù)冷的O。 1 % Triton—X 100 (體積同上)，輕柔混勻 沉淀，如上離心，棄上清；
d.沉淀中加入2.0ml裂解液，徹底打碎沉淀，然后加入10%SDS100.0ul，混勻； e.加入10mg/ml蛋白酶K40.0ul，混勻，53—44。C， 3小時(shí)，或37 — 38'C，過夜消化 (以過夜為佳)；
f. 加入6.0MNaCL0.7左右ml，劇烈振蕩；
g, 3550—3650rpm離心40分鐘，將上清移至另一有蓋離心管中；
h. 加入約2倍體積的無水乙醇或95%乙醇，反復(fù)顛倒混勻至出現(xiàn)絮狀DNA沉淀，挑 出DNA至一 Eppendorf管中；
i. 80%乙醇洗滌DNA兩遍，DNA提取后加TE溶解(200ul TE/5ml全血，400ul TE/10ml 全血)，4'C靜置7天以充分溶解。
j.應(yīng)用1W瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)撿測定量DNA，分裝保存。 二、 IRS-1基因的突變位點(diǎn)區(qū)域PCR擴(kuò)增
1. 引物序列
上游引物IRS-1-F: CGGATGAGTATGGCTCCAGT 下游引物IRS-1-R: ACCTCCAATGTCAGGAGAGC
2. PCR反應(yīng)體系
表IRS-1基因的PCR反應(yīng)體系
組成 用量
10xBuffer ( Mg2+ 2.5ul
Plus)
■P(各2.5mM) 2ul
Primer F上游引物 0.5ul
(20raM )
Primer R上游引物 0.5ul
(20mM)
Taq DNA聚合酶 0.5ul
(5u/ul)
模板DNA( 50ng/ lul
ul)
滅菌去離子水 補(bǔ)至25ul
(ddH20)
反應(yīng)條件(見圖3): 94。C5min預(yù)變性；94。C30s變性，60。C30s退火，72。Clrain延 伸，30個(gè)循環(huán)；72"C7min充分延伸；4'C保存。
三、 PCR產(chǎn)物的檢測
用1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以檢測其是否為目的片斷并估計(jì)其濃度。
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示單一條帶，無雜帶，則提示PCR產(chǎn)物成分單一，無雜質(zhì)。若條帶
位置位于marker所示的適當(dāng)大小的位置，則為目標(biāo)片斷。根據(jù)上述引物擴(kuò)增的目的片段PCR 產(chǎn)物為749bp,即電泳條帶位于約相當(dāng)于Marker所示的750bp的位置。
PCR產(chǎn)物的純化和測序
利用ABB730測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。此測 序反應(yīng)所用引物與進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物相同，為保證較長序列順利銜接，采用正反雙向 測序。
樣品準(zhǔn)備DNA(2ul)+上樣緩沖液(6ul)共8ul x 96
取一96孔點(diǎn)樣板，每孔先加上樣緩沖液6ul，在從裝有PCR產(chǎn)物的腔板中，每孔用排槍 移出PCR產(chǎn)物(2ul)，轉(zhuǎn)移到點(diǎn)樣板上、混勻、用離心機(jī)離心(腔板孔號要與96孔點(diǎn)樣板一一 對應(yīng))。1. PCR產(chǎn)物純化
(1) .向裝有PCR產(chǎn)物的96孔板中加入50微升無菌水，混勻。
(2) .將其轉(zhuǎn)移到Millipore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒有水 即可。
(3) .向純化板中再次加入50微升的去離子水，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒有水為止。
(4) .將純化板從真空泵上取下，向板中加入20微升的去離子水，靜置15分鐘，再震蕩
15分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。
(5) .純化后產(chǎn)物取2微升電泳定量，保存在-20度冰箱中。
取以上純化產(chǎn)物2pl為模板，用ABI PRMERTM, Big-Dye末端標(biāo)記試劑盒，以PCR反 應(yīng)一側(cè)引物(稀釋為2MM)為測序引物進(jìn)行測序反應(yīng)。反應(yīng)體系1(M，各組分如下(表2-7):
表lOpl測序反應(yīng)體系
名稱原液濃度加樣量(W)體系終濃度
Buffer2
Primer2一24 pmol
Big-Dye mix1.2
Template23-10 ng
ddH20補(bǔ)齊至
測序反應(yīng)條件見圖4
2.測序反應(yīng)產(chǎn)物的純化
(1).每孔加入6(^175%乙醇，混勻30秒;
(2) .4000RPM離心30分鐘，甩掉上清；
(3) .每孔加入10(^175%乙醇，4000RPM離心IO分鐘，甩掉上清；
(4) .重復(fù)上述步驟；
(5) .倒置于吸水紙上，離心至300RPM停止；
(6) .置于真空干燥器低溫抽吸千燥4分鐘；
(7) .上樣前每孔加20^1 ddH20(3700測序儀)； 3.啟動測序儀進(jìn)行測序；
尋找致病的堿基突變
將得到的序列與IRS-1正常基因的標(biāo)準(zhǔn)序列(參照GenebankNM一005544.)進(jìn)行比較確 定IRS-1突變位點(diǎn)(2759C—G)。
進(jìn)一步地，將得到的序列通過BLAST比對，按正常讀碼框架進(jìn)行翻譯，與IRS-1正常基 因按正常讀碼框架進(jìn)行翻譯后的氨基酸組成對比，以確定是否存在R580G氨基酸突變位點(diǎn)。
基因治療是指運(yùn)用DNA轉(zhuǎn)移來治療甚至預(yù)防人類疾患。確切地說，它指的是遺傳信息相 關(guān)的特異性DNA序列的轉(zhuǎn)移，是一項(xiàng)高度集成、綜合性高難度的生物技術(shù)，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于 腫瘤等疾病的治療研究。有效的基因治療依賴于外源基因高效而穩(wěn)定的表達(dá)。利用病毒載體 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性而成為基因治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包 括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等 載體。
分離和克隆出野生型的IRS-1基因，選取慢病毒為載體，將野生型IRS-1基因通過基因 重組技術(shù)組裝與病毒上，然后用這種重組的含有IRS-1基因的病毒去感染強(qiáng)直性脊柱炎患者 的體細(xì)胞，使得患者體內(nèi)能夠持續(xù)表達(dá)野生型的IRS-1轉(zhuǎn)錄翻譯的具有正常功能的蛋白，從 而達(dá)到治療的目的。
權(quán)利要求
1.一種強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因，其特征是，其含有IRS-1基因序列，并且還含有2759C→G雜合突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IRS-1突變基因，其特征是，該IRS-1突變基因還含有2727C—T， 3419T—A， rs6725556T—C， -3637A—T，-3295 G—T， rs6436635 G—A， rs3731597 G—A， 3' UTR707G—T， -2990C—T或rsl801278 A—G雜合或純合突變中的一種或一種以上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的IRS-1突變基因，其特征是，所述IRS-1突變基因的編碼的蛋白質(zhì) 具有580R—G突變位點(diǎn)。
4. 一種檢測如權(quán)利要求1所述的IRS-1突變基因的方法，其特征是，從待測樣品中得到的核苷 酸序列與IRS-1正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，核對突變位于IRS-1基因的2759位點(diǎn)，由堿基C 突變?yōu)镚。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測IRS-1突變基因的方法，其特征是，所述檢測方法主要包括以下步 驟1) 提取待檢測樣本中的DNA;2) 以該DNA為模板，以針對IRS-基因或者IRS-1基因第2759個(gè)堿基附近的編碼 區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；3) 測出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的核苷酸序列組成；4) 將核苷酸序列與IRS-1正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較,確定2759位是否突變?yōu)閴A基G。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測IRS-1突變基因的方法，其特征是，還包括步驟:通過數(shù)據(jù)庫BLAST 比對功能，按正常讀碼框架進(jìn)行翻譯以確定是否存在R580G氨基酸突變位點(diǎn)。
7. 根據(jù)權(quán)利耍求4所述檢測IRS-1突變基因的方法，其特征是，PCR反應(yīng)中的引物的堿基組 成為IRS-1-F: CGGATGAGTATGGCTCCAGT IRS-1-R: ACCTCCAATGTCAGGAGAGC。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測IRS-1突變基因的方法，其特征是，所述測出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的核苷酸序列組成可以是將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在測序儀測序或與特異性探針雜交測序。
9. 一種用亍檢測強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因限s"突變基因的試劑盒，主要包括有以針對IRS-1基因或者IRS-1基因第2759個(gè)堿基附近的編碼區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物，Taq DNA聚合酶和相應(yīng)緩沖液。
10.—種檢測D2S377-D2S1349區(qū)域內(nèi)單倍型的方法，其特征是把區(qū)域內(nèi)根據(jù)遺傳距離確定的微衛(wèi)星用毛細(xì)管電泳的方法檢測家系患者或散發(fā)患者標(biāo)本，確定是否有相關(guān)大小的峰型，從而確定是否具有與已檢出的單倍型區(qū)域一致的單倍型。
11.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因在制備治療強(qiáng)直性脊柱炎 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種強(qiáng)直性脊柱炎致病相關(guān)基因IRS-1突變基因，其含有IRS-1基因系列，還含有2759C→G雜合突變；還公開了檢測所述的IRS-1突變基因的方法，包括從待測樣品中得到的核苷酸序列與IRS-1正?；虻男蛄羞M(jìn)行比較，核對突變位于IRS-1基因的2759位點(diǎn)，由堿基C突變?yōu)镚；以及公開了檢測所述IRS-1突變基因的試劑盒，主要包括有以針對IRS-1基因或者IRS-1基因第2759個(gè)堿基附近的編碼區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物等。本發(fā)明所述的突變基因和檢測方法將有利于進(jìn)一步研究強(qiáng)直性脊柱炎的致病機(jī)理，在臨床上開展強(qiáng)直性脊柱炎患者的IRS-1突變篩查工作，可為家族史患者產(chǎn)前診斷的提供相關(guān)的信息以供參考，并用于家系患者及散發(fā)患者的疾病預(yù)測，篩查與確定，為強(qiáng)直性脊柱炎患者診斷和治療提供服務(wù)。
文檔編號C12N15/12GK101173278SQ20071003099
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日
發(fā)明者古潔若, 巖 沈 申請人:古潔若;沈 巖