專利名稱：：一種分離的李斯特單核增生菌噬菌體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到能夠特異性裂解李斯特單核增生菌""ter/amoTOcytogenes)蘭'株的噬菌體分離物和其作為生物殺菌劑在食品及在抗感染中的應(yīng)用。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：李斯特菌是近十幾年來(lái)報(bào)道較多的病原菌之一，該菌分布十分廣泛，且該菌在4'C時(shí)仍能夠緩慢生長(zhǎng)。食品是該菌致病的主要載體,肉類,蛋類,禽類，海產(chǎn)品，乳制品，蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。易感者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人，免疫功能缺陷者。由該菌引起的人畜共患性疾病已成為全球性疾病。在西方國(guó)家，李斯特翁的感染最近呈上升趨勢(shì)，曾經(jīng)在美國(guó)、加拿大、法國(guó)等國(guó)家引起嚴(yán)重的食品中毒事件，已成為--個(gè)典型的環(huán)境衛(wèi)生問題。最新資料表明，北京零售鮮肉和蒸煮肉制品上李斯特單核增生菌的污染率分別為8%和4%。李斯特單核增生菌己在許多類型的西式肉制品如法蘭克福香腸，咸牛肉和蒸煮火腿中檢出。歐洲和加拿大的即食肉制品中其檢出率在13%到50%之間.在速凍食品中李斯特菌污染率較高達(dá)14.3%,隨著我國(guó)現(xiàn)代化食品加工業(yè)的發(fā)展,一旦存在此菌的污染源,就可導(dǎo)致大量產(chǎn)品的污染.由于李斯特菌其低溫增值的特性，容易達(dá)到感染的菌量。目前防治細(xì)菌感染的傳統(tǒng)方法主要為大量使用抗生素和添加化學(xué)殺菌物質(zhì)。廣泛應(yīng)用抗生素非但成本高而且已經(jīng)催生很多超級(jí)耐藥細(xì)菌，而應(yīng)用化學(xué)制劑殺菌不但對(duì)環(huán)境造成污染，且對(duì)人類健康造成危害。噬菌體(bacteriophage,phage)是一種細(xì)菌病毒，可以特異性感染并裂解一種或少數(shù)幾種細(xì)菌。一類噬菌體感染細(xì)菌后將其遺傳物質(zhì)整合到細(xì)菌的DNA里，隨著細(xì)齒的繁殖而繁殖，一旦外界條件合適就裂解細(xì)菌細(xì)胞，而引起細(xì)菌死亡，這種噬菌體叫做溫和噬菌體。另一類噬菌體一旦感染細(xì)菌，就利用細(xì)菌合成子代噬菌體，然后裂解細(xì)菌細(xì)胞而釋放，這種
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)對(duì)李斯特單核增生菌具有強(qiáng)烈裂解作用的噬菌體分離物，該分離物可以單獨(dú)或混合使用可以特異性的部分或完全滅活李斯特單核增生菌，為工業(yè)化生產(chǎn)噬菌體殺菌劑提供噬菌體株來(lái)源。本發(fā)明的另一目的是開發(fā)一種新型的安全的生物殺菌劑作為食品添加劑防止由李斯特單核增生菌引起的食品污染，避免由于食用該菌污染的食品引起的細(xì)菌感染。本發(fā)明的又一目的是提供一種用于食品特別是方便即食產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)境的安全的生物凈化殺菌劑用以防止食品加工過(guò)程中造成的李斯特單核增生菌污染。本發(fā)明的再一目的是為治療由李斯特單核增生菌引起的感染提供潛在治療藥物。本發(fā)明從自然界中分離得到噬菌體分離物，該噬菌體分離物包括一種或多種對(duì)李斯特單核增生菌具有裂解作用的噬菌體，經(jīng)純化可得噬菌體單體。證明該噬菌體分離物中的噬菌體單獨(dú)或混合使用對(duì)李斯特單核增生菌具有實(shí)質(zhì)裂解作用。上述分離出的噬菌體單體(單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage)命名為BPH-LM-1對(duì)李斯特單核增生菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-LM-1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號(hào)2254。本發(fā)明中噬菌體BPH-LM-1經(jīng)小鼠毒理實(shí)驗(yàn)，給予1011pfu/kg的噬菌體樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠未見異樣，連續(xù)給予15天后，將小鼠斷頸處死，尸檢，違發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟有異樣變化。與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。該噬菌體是安全的。本發(fā)明中噬菌體BPH-LM-1可以單獨(dú)或混合使用，在液體中的殺菌極限為終濃度7X105pfU/ml，g卩，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的李斯特單核增生菌中加入該噬菌體單體或混合物，可以在4-6h內(nèi)完全滅活該菌。本發(fā)明中噬菌體可應(yīng)用于液體食品，包括但不限于乳制品、飲料等防止李斯特單核增生菌的污染。本發(fā)明中噬菌體BPH-LM-1可以單獨(dú)或混合使用，對(duì)被李斯特單核增生菌污染的固體食品表面噴灑106pfu/ml-107Pfu/ml數(shù)量級(jí)的噬菌體，108pfu/ml-1011pfu/ml的效果尤佳，可以在24小時(shí)內(nèi)完全滅活李斯特單核增生菌。且在一個(gè)月內(nèi)李斯特單核增生菌檢驗(yàn)呈陰性。提示本發(fā)明中噬菌體可應(yīng)用于防止固體食品，包括但不限于方便即食產(chǎn)品的李斯特單核增生菌污染。本發(fā)明中的噬菌體BPH-LM-1可以單獨(dú)或混合使用，可以作為殺菌劑噴灑于食品生產(chǎn)車間，可特異性、持續(xù)防止該環(huán)境中李斯特單核增生菌的生存和繁殖，防止食品加工過(guò)程中的污染。本發(fā)明中的噬菌體BPH-LM-1可以單獨(dú)或混合使用，可作為一種潛在藥物治療由李斯特單核增生菌引起的細(xì)菌感染。本發(fā)明中噬菌體可以和其他噬菌體聯(lián)合使用，以或得較寬的噬菌范圍。本發(fā)明中噬菌體可以和其他抗菌劑混合使用，在獲得抗菌廣譜性的同時(shí)，對(duì)李斯特單核增生菌特異性殺滅。能與該發(fā)明中噬菌體聯(lián)合使用的抗菌劑包括但不限于抗生素和化學(xué)抗菌劑。本發(fā)明中噬菌體可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，可由宿主菌李斯特單核增生菌特異性擴(kuò)增，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒純化方法高度純化，作為食品抗菌添加劑防止食品中李斯特單核增生菌污染。本發(fā)明采用的噬菌體BPH-LM-1為單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期2007年ll月13日，保藏編號(hào)2254。圖1為溫度對(duì)本發(fā)明所述的噬菌體BPH-LM-1的影響曲線2為本發(fā)明所述的噬菌體生長(zhǎng)曲線圖3為本發(fā)明所述的噬菌體在固體食品火腿腸中的殺菌能力圖4為本發(fā)明所述的噬菌體在液體食品牛奶中的殺菌能力具體實(shí)施方法實(shí)施案l噬菌體的篩選和純化(一)樣品的采集及處理本發(fā)明中樣品采自珠海本地，包括中山大學(xué)第五附屬醫(yī)院未處理污水、珠海市市內(nèi)下水道污水、排污入海口處海水、珠海市家禽養(yǎng)殖場(chǎng)、珠海市養(yǎng)豬場(chǎng)、珠海市屠宰場(chǎng)。采集的樣品用NaOH調(diào)節(jié)，使pH約為7.0，經(jīng)過(guò)4000r/min離心15min，用0.45um濾膜過(guò)濾得上清液。.取過(guò)濾除菌后的樣品75ml，加入25ml4倍LB培養(yǎng)基。(二)樣品中針對(duì)李斯特單核增生菌的噬菌體特異性擴(kuò)增在處理好的樣品中加入預(yù)先擴(kuò)增好的李斯特單核增生菌(0D600約為l.O，加入比例為l:100)，將其置于恒溫?fù)u床30。C，250r/min培養(yǎng)6-8h。(三)斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)測(cè)定特異性噬菌體李斯特單核增生菌雙層檢測(cè)平板的制備高溫滅菌0.75%-2.0%LB固體培養(yǎng)基，室溫放置至約40-60°C，取10-15ml傾倒至培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻鋪于皿底，室溫放置30min，使其凝固。將經(jīng)過(guò)高溫滅菌的0.2%-0.9%1^瓊脂糖培養(yǎng)基融化，40°C-48。C水浴保溫。取李斯特單核增生菌0.2ml-0.8ml,加入步驟2中0.5。/。LB瓊脂糖3.6-5ml，混勻，倒入步驟l制得的培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫放置凝固。將李斯特單核增生菌雙層檢測(cè)平板3(TC保溫培養(yǎng)lh。取上述經(jīng)李斯特單核增生菌擴(kuò)增后的樣品lml，8000r離心15min，上清液經(jīng)0.22um過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。取5ul點(diǎn)于李斯特單核增生菌雙層檢測(cè)平板上，3(TC過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)噬斑，如果有進(jìn)行步驟(四)。(以上操作均為無(wú)菌條件)(四)噬菌體樣品的分離及噬菌體樣品的擴(kuò)增將步驟(三)中在李斯特單核增生菌雙層檢測(cè)平板中呈現(xiàn)噬斑的樣品，經(jīng)過(guò)適當(dāng)比例稀釋，按如下步驟純化。將制備好的LB平板，37。C平衡0.5h，使其表面溫度達(dá)到室溫(如果在室溫條件下放置可省去這一步)取0.4ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6000.4-0.8之間)、0.1ml擴(kuò)增后的樣品和4ml0.5。/。agaroseLB混勻，倒于平板上，輕輕振蕩，使其鋪平，室溫放置約0.5小時(shí)，使表面徹底凝固。將雙層平板37。C培養(yǎng)4-6h觀察。挑選單個(gè)噬菌斑。將挑選出來(lái)的噬菌體單克隆，加入2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的相應(yīng)菌種中，3(TC培育2h-6h，觀察待菌液變澄清，代表殺菌完全。重復(fù)3-5次，得到噬菌體單克隆樣品。并將其命名為Bra-LM-l。(五)噬菌體的純化應(yīng)用宿主菌李斯特單核增生菌將噬菌體BPH-LM-1高度擴(kuò)增，待培養(yǎng)基澄清后，8000g，離心10min，取出雜質(zhì)，加入固體聚乙二醇(PEG8000)至終濃度為10%w/v，攪拌溶解，4。C過(guò)夜，4°C，8000g離心2(Mn，棄沉淀，重懸于緩沖液(100mMNaCl，5mMMgS04,lOmMTris-HClpH7.2)中，于37°C，保溫30min，期間振蕩數(shù)次。加入氯仿，漩渦混合30min，3000g離心5min，小心收集水相，將噬菌體懸液置氯化銫(p=1.4，1.6)密度梯度內(nèi)lOOOOg，4'C離心2h，置強(qiáng)光下，收集乳狀條帶。4'C過(guò)夜透析除去鹽份，重復(fù)一次。將得到的噬菌體透析液4'C保存待用。實(shí)施例2噬菌體計(jì)數(shù)方法(效價(jià))將所得噬菌體樣品按IO倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100ul，用實(shí)施例1的步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計(jì)算噬斑個(gè)數(shù)，一個(gè)噬斑代表一個(gè)噬菌體單體。細(xì)菌計(jì)數(shù)方法(效價(jià))采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法計(jì)數(shù)噬菌體穩(wěn)定性檢測(cè)l.溫度對(duì)噬菌體的影響在實(shí)驗(yàn)前一天，檢測(cè)噬菌體的效價(jià)，將噬菌體樣品，分別放于4°C、室溫、37°C、50°C、70°C，保溫lh后測(cè)定效價(jià)。由此得到溫度對(duì)噬菌體的影響。將噬菌體在4。C、室溫和37'C保溫，在ld、5d、10d、15d、30d測(cè)定效價(jià)結(jié)果顯示在4。C、室溫、37'C保溫2h在誤差允許的范圍呢，噬菌體BPH-LM-1的效價(jià)幾乎沒有變化，說(shuō)明在此溫度下噬菌體穩(wěn)定性良好。在5(TC時(shí)，2h后效價(jià)降為原來(lái)的19%，而在7(TC時(shí)，2h能將噬菌體完全滅活(如表l)。表l設(shè)定溫度下保溫2h對(duì)噬菌體效價(jià)的影響表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在4'C放置噬菌體在一月內(nèi)效價(jià)仍能夠保持原來(lái)的57%;室溫和37"C結(jié)果相同，效價(jià)下降較慢，5d時(shí)效價(jià)下降不足10%，分別為原來(lái)的93%和91%，在一月內(nèi)效價(jià)是原來(lái)效價(jià)分別為16%和15%，仍維持在較高水平(如圖1)。2.ph對(duì)噬菌體殺菌能力的影響將噬菌體樣品分別于pHl-14，室溫保存2h，然后檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果，對(duì)于噬菌體BPH-LM-l最適pH為6-9，噬菌體的效價(jià)幾乎沒有變化。當(dāng)pH為10的時(shí)候仍保持28%的活性。但是當(dāng)pH〈5或pHMl效價(jià)下降很快(表2)。表2pH對(duì)噬菌體BPH-LM-1的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.高濃度鹽溶液對(duì)噬菌體的影響加入氯化鈉調(diào)整噬菌體樣品溶液的鹽濃度，使鹽濃度分別達(dá)到0.1M、0.3M、0.5M、1M、3M保存2h，將其稀釋，和對(duì)照組相比，檢測(cè)效價(jià)的變化。結(jié)果，顯示小劑量(0.1-0.3M)的NaCl有助于噬菌體的保存，且高濃度鹽對(duì)噬菌體沒有明顯的影響(表3)。表3鹽濃度對(duì)噬菌體的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例3毒理實(shí)驗(yàn)昆明小鼠，清潔級(jí)，體重22土3g，2月齡(合格證號(hào)SCXK(京)2004-0001)，由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)飼養(yǎng)室，室溫18-22°C，相對(duì)濕度40%-70%，12h日照和昏暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)小鼠20只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為兩組(噬菌體組、對(duì)照組)，每組10只(雌雄各5只)，給予噬菌體組計(jì)量為10fu/kg的噬菌體BPH-LM-1，對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥15d,將實(shí)驗(yàn)鼠斷頸處死，檢査內(nèi)臟情況。觀察結(jié)果顯示，此計(jì)量的噬菌體BPH-LM-l對(duì)小鼠日常行為沒有影響。解剖檢查內(nèi)臟未見異常。實(shí)施例4檢測(cè)噬菌體在固體食品中的殺菌效果此部分選取火腿腸作為試驗(yàn)樣品，將火腿腸切為lcm左右方體，用于試驗(yàn)。制備lX103pfu/ml、lX104pfu/ml的李斯特單核增生菌溶液。制備1X108pfu/ml的噬菌體樣品?；鹜饶c樣品分別置于上述菌液中，浸泡lh，取出置于無(wú)菌廣口瓶?jī)?nèi)，無(wú)菌環(huán)境下晾干。上述火腿腸樣品取出一部分置于噬菌體樣品中，置于無(wú)菌廣口瓶中晾干。將上述制備樣品置于室溫(約20-25。C)培養(yǎng)。檢測(cè)樣品總李斯特單核增生菌含量。結(jié)果證明，lX108pfU/ml的噬菌體溶液可以在1天內(nèi)完全殺滅李斯特單核增生菌，且能夠?qū)κ称诽峁╅L(zhǎng)久的保護(hù)(結(jié)果如圖3)。實(shí)施例4檢測(cè)噬菌體樣品在液體中的殺菌效果1.噬菌體計(jì)數(shù)方法(效價(jià))將所得噬菌體樣品按10倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100lil，用步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計(jì)算噬斑個(gè)數(shù)，一個(gè)噬斑代表一個(gè)噬菌體單體。2.細(xì)菌計(jì)數(shù)方法(效價(jià))采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法計(jì)數(shù)3.液體中殺菌效果實(shí)驗(yàn)將噬菌體樣品按10倍比例稀釋，其中一部分按實(shí)施例2中方法測(cè)定效價(jià)，另一部分按如下方法檢測(cè)殺菌效果，取上述經(jīng)稀釋的噬菌體樣品100ul，加入到2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的李斯特單核增生菌(3.4X107pfu/ml)中，30°C，250r/min培養(yǎng)。按照MOI(噬菌體/細(xì)菌)=0.1，接種噬菌體。3(TC保溫，然后分別于20min、40min、60min、90min、120min、240min測(cè)定噬菌體效價(jià)。結(jié)果顯示,BPH-LM-1的殺菌極限為105數(shù)量級(jí)，級(jí)當(dāng)液體中噬菌體的含量達(dá)到105pfu/ml時(shí)，噬菌體可以給液體中完全殺滅李斯特單核增生菌。噬菌體潛伏期在20-40min內(nèi)，在20min時(shí)，液體中李斯特單核增生菌的個(gè)數(shù)小于lpfu/ml.而在4h內(nèi)無(wú)細(xì)菌增殖(如圖4)。權(quán)利要求1.一種噬菌體BPH-LM-1，保藏號(hào)為2254。2.權(quán)利要求1所述的噬菌體在防止李斯特單核增生菌污染方面的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的噬菌體作為一種食物添加劑用于防止食物李斯特菌污染方面的應(yīng)用。4.權(quán)利要求l所述的噬菌體在作為殺菌劑噴灑于食品生產(chǎn)車間，用于防止該環(huán)境中李斯特菌的生存和繁殖，防止食品加工過(guò)程中的污染方面的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1所述的噬菌體作為一種治療李斯特菌感染的藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種分離的李斯特單核增生菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品和抗感染中的應(yīng)用。所述的分離出的噬菌體單體(單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage)命名為BPH-LM-1對(duì)李斯特單核增生菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-LM-1保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號(hào)2254。文檔編號(hào)C12N7/00GK101220350SQ20071003141公開日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年11月16日優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日發(fā)明者磊劉,張智英申請(qǐng)人:珠海市晉平科技有限公司