專利名稱：：唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及唐魚生長激素基因、含有該基因的重組表達(dá)載體、用該載體轉(zhuǎn)化的唐魚以及對該轉(zhuǎn)基因唐魚的外源基因檢測。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因魚是目前國內(nèi)外獲得最成功的轉(zhuǎn)基因動物之一。轉(zhuǎn)基因魚的構(gòu)建主要包括以下幾個方面l.目的基因的獲得；2.基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建；3.受體魚(受精卵)的獲得；4.注射基因。轉(zhuǎn)基因魚的應(yīng)用潛力l.快速育種。傳統(tǒng)的品種選育需經(jīng)過多代反復(fù)選種交配才能育成優(yōu)良品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能在很短時間內(nèi)超越自然界億萬年生物進(jìn)化歷程，創(chuàng)造自然界原來沒有的品種或品系，這是常規(guī)育種難以辦到的，故此引誘力極強(qiáng)。2.改良養(yǎng)殖性能，如加快受體魚的生長、提高餌料利用率及抗逆性等。不少實驗表明，轉(zhuǎn)基因魚生長速度可提高11%-30%，即所謂"超級魚"。但這些結(jié)果多為實驗室環(huán)境所得，尚待養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)境的檢驗。有的轉(zhuǎn)基因魚可提高餌料利用率，有的則表現(xiàn)出耐寒或耐熱、耐低鹽度或高鹽度、耐高濃度重金屬、耐污染物以及乃缺氧等，產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的魚。3.生產(chǎn)醫(yī)藥生物制品。通過轉(zhuǎn)基因魚生產(chǎn)生物活性物質(zhì)以滿足醫(yī)藥需要，生產(chǎn)對外來物質(zhì)成陽性的反應(yīng)器的魚以滿足醫(yī)療的需要，研制攜帶人類胰島素的轉(zhuǎn)基因魚以提供胰島素的研究也開始引起了人們的重視。唐魚(ram'c/^/^a仿om/^s)屬鯉形目、鯉科、唐魚屬。它體形細(xì)小，長而側(cè)扁。體高約等于頭長，腹部圓、吻鈍而短，口上位.口裂向下傾斜，幾乎與體鈾垂直。上頜長于下頜，前端無突起?？跓o須，眼大，側(cè)上位。背鰭短，起點(diǎn)顯著在腹鰭起點(diǎn)之后，胸縮短，末端不達(dá)腹部起點(diǎn)，腹縮末端可達(dá)肛門，肛門緊靠臀鰭起點(diǎn)。臀鰭較長，約與背鰭相對。尾鰭叉形，末端尖，上下葉約等長。體被中等大小圓鱗，體側(cè)鱗片上無側(cè)線。體側(cè)顏色鮮艷，體側(cè)從鰓孔上角至尾柄基部有一條金黃色的條紋.條紋上下各有幾條黑色線條。尾柄基部有一紅色大圓斑，背鰭和尾鰭基部有許多紅色小斑點(diǎn)。背鰭和臀鰭呈黃綠色，邊緣透明。唐魚分布在廣東省廣州附近的小山溪中，具有很高的觀賞價值。唐魚現(xiàn)已列為國家二級保護(hù)動物。唐魚是對生存環(huán)境要求極高的魚種，可成為測定環(huán)境品質(zhì)的"指標(biāo)魚"，是用生物方法監(jiān)測環(huán)境水質(zhì)污染的一個極好的魚類生物標(biāo)記物，所以對它的生長發(fā)育進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，對環(huán)境資源和生物資源的保護(hù)，具有極大的科學(xué)意義。轉(zhuǎn)基因魚具有表達(dá)量高、世代周期短、成本低、不帶哺乳類病毒等優(yōu)點(diǎn)，且作為生物反應(yīng)器更易被接受，因此通過轉(zhuǎn)基因獲得較大體型、生長快的轉(zhuǎn)基因唐魚，及該轉(zhuǎn)基因體系方法的建立對后續(xù)的研究(如培育可生產(chǎn)重要的蛋白的轉(zhuǎn)基因魚等)具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種唐魚生長激素基因。本發(fā)明的另一目的在于提供包含上述唐魚生長激素基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的在于提供包含上述唐魚生長激素基因的基因工程菌。本發(fā)明的進(jìn)一歩目的在于提供上述唐魚生長激素基因在促進(jìn)魚類生長中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明根據(jù)GENBANK上已登陸的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計了一對引物(pl和p2)，然后提取唐魚總RNA，以總RNA為模板，Pl和P2為引物，RT-PCR得到唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)，再根據(jù)該ORF設(shè)計引物，以唐魚總RNA為模板，分別進(jìn)行5'RACE和3'RACE，擴(kuò)增得到5'末端序列和3'末端序列，然后將5'和3'端序列及核心序列ORF用Vector軟件拼接獲得了唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp。本發(fā)明根據(jù)唐魚生長激素基因ORF設(shè)計一對引物P6和P7，再以唐魚生長激素基因ORF為模板，用引物P6和P7進(jìn)行PCR改造，然后將PCR產(chǎn)物雙酶切純化；同時雙酶切轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed，并回收含有啟動子的載體；T4連接酶按照摩爾數(shù)比1:3，連接酶切純化后的唐魚生長激素基因ORF和含有啟動子的載體。本發(fā)明將上述T4連接酶得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后通過菌落PCR，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切初步篩選重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒測序列證實，重組轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建正確，命名為pTLA-GH。本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH酶切使其線性化，純化后測定OD值，調(diào)整濃度，將pTLA-GH顯微注射到唐魚受精卵中。本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH設(shè)計一對引物PP-SF和GP-SR;將實驗魚與對照魚培育至0.4g左右后，剪取鰭條提取基因組DNA，用引物PP-SF和GP-SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)植基因，結(jié)果在兩尾個體最大的轉(zhuǎn)基因魚(1#和2#魚)中檢測到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH;以Southernblot方法檢測轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH己整合到唐魚基因組上；以RT-PCR和Westernblotting方法檢測到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH在唐魚組織器官中的表達(dá)；同時觀察實驗組唐魚和對照組唐魚的表型變化，結(jié)果證實重組表達(dá)載體pTLA-GH已成功地轉(zhuǎn)化到唐魚體內(nèi)，并且在唐魚體內(nèi)發(fā)揮了生長激素的促生長生理功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、本發(fā)明從唐魚總RNA中獲得了唐魚生長激素基因及編碼的氨基酸序列，這極大地擴(kuò)充了轉(zhuǎn)基因魚類的基因庫；2、本發(fā)明將唐魚生長激素基因連接到轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed上，構(gòu)建了新的重組表達(dá)載體pTLA-GH,并且成功在轉(zhuǎn)基因唐魚內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，該重組表達(dá)載體對改善其他魚類的生長發(fā)育性狀具有極大的生物學(xué)和生物工程學(xué)意義。3、本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因唐魚，生長快、體型大，可以用于生物反應(yīng)器等其他生物學(xué)領(lǐng)域。圖1為轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH的構(gòu)建圖；圖2為轉(zhuǎn)基因唐魚PCR擴(kuò)增初步篩選結(jié)果；其中，1為MarkerIII;2為空白(ddH20);3為用于注射的DNApTLA-GH;415為實驗唐魚，其中6是1#魚的鰭條，9和15是2#魚的肌肉和眼睛，其佘是其它實驗魚的鰭條；1618，分別為對照唐魚的鰭條、肌肉、眼睛。圖3為轉(zhuǎn)基因唐魚基因組DNApTLA-GH基因的Southernblot雜交；其中，1為陽性對照pTLA-GH;2為鰭條組織基因組DNA酶切產(chǎn)物。圖4為Westernblotting檢測生長激素的表達(dá)情況的結(jié)果；其中，l為陽性對照組(重組鯉魚GH);2為野生型唐魚；3為試驗唐魚。具體實施方式實施例1唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)的克隆1.引物設(shè)計參照GenBank中已登錄的鯉(Cyprz'ra'iwc^77k)、青魚woWfo)、團(tuán)頭魴(A/eg(3/oZ7ramaa附6fy，/ia/a)、泥鰍(Af/紹wrn^a/zgw/〃z'cat^/ato)等生長激素基因cDNA序列在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計一對引物(pl和p2)擴(kuò)增該基因的開放閱讀框(ORF)序列。Pl:5'-ATGGCTAGAGCATTRGTGC-3';P2:5'-CTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取出膜后5d幼體唐魚20尾，提取唐魚全魚的總RNA，具體步驟嚴(yán)格參照試劑盒SVTotalRNAIsolationSystem。提取的RNA用0.8%瓊脂糖電泳檢測，--20。C保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄參照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒的方法，以唐魚全魚總RNA為模板進(jìn)行第一鏈合成。反應(yīng)體系如表1所示表1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系唐魚全魚總RNA1MgCl22jxLOligodT-AdaptorPrimer0，10XRTBuffer1&dNTPMixture1RNaseInhibitorAMVReverseTranscriptase0.5^RNaseFreedH203.754Total10反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為48°C30min;95°C5min;5°C5min。3.PCR擴(kuò)增以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用pl、P2擴(kuò)增唐魚生長激素基因開放閱讀框(ORF)。PCR反應(yīng)體系如表2:表2.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94卩變性30s，54'C復(fù)性30s，72'C延伸lmin，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72"C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。4.PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說明書進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，體系如表3:表3.連接體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16'C下連接2小時。5.重組菌的菌液PCR檢測將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37'C培養(yǎng)10小時后進(jìn)行菌液PCR來挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如下表4:表4.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94。C變性3min,每個循環(huán)包括9fC變性30s，57'C復(fù)性30s，72t:延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5PCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個重組菌落中有11個可以擴(kuò)增出633bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。6.酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和A7n^HI進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和700bp)，確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。實施例2唐魚生長激素全長cDNA的克隆l.引物設(shè)計根據(jù)上述生長激素基因ORF序列設(shè)計了一對下游引物(p3和p4)，上游引物使用SMARTRACEcDNAAmplificationkit的通用引物UPM和NUP。在已測得的生長激素基因ORF序列上設(shè)計了一條上游引物(p5)，下游引物為TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0的通用引物Ml3PrimerM4。p3:5'-CAATGAGGCGGAAAGAGATG-3';p4:5'-GGTTGTCCTCAAAGTCGTTAATC-3'。p5:5'-GTCAACCAAACATGGACGACAATGAC-3';M13PrimerM4:5'-GTnTCCCAGTCACGAC-3';UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';NUP:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。2.5、-RACE用p3和UPM進(jìn)行5'RACE擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測有預(yù)期帶出現(xiàn)，再以擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以p4和NUP做套式擴(kuò)增后獲得單一的特異條帶，該片段回收測序，具體步驟如下采用BD公司的SMARTRACEcDNAAmplificationkit，按照試劑盒說明書進(jìn)行唐魚生長激素基因cDNA5'RACE擴(kuò)增，方法如下a)5'-RACE-ReadycDNA的制備(1)分別在0.5ml離心管中加入以下溶液，溶液具體見表5:表5.所加入溶液RNA樣品35'-CDSPrimerl[iLSMARTIIAoligoTotal5|iL(2)每管加滅菌水至終體積為5^L，用槍頭混合均勻，低速離心至管底；(3)7(TC溫浴2分鐘，置冰上冷卻2分鐘，輕微離心，收集溶液于管底，并加入組分，具體見表6:表6.所加組分5xFirst-strandBuffer2jxLDTT(20mM)l^LdNTPMix(10mM)lpLPowerscriptreversetranscriptase1jjL(4)用槍頭輕輕混勻，輕微離心，收集溶液于管底；(5)42。C溫浴1.5小時，力卩1OOpLTricine-EDTABuffer稀釋First-strand反應(yīng)產(chǎn)物；(6)72r溫浴7分鐘，樣品保存于一2(TC冰箱備用。b)PCR擴(kuò)增以5'-RACE-ReadycDNA為模板，p3和試劑盒中的UPM為引物，按以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表7:表7.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，54匸復(fù)性30s，72'C延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1免瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。然后以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用引物p4和NUP進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表8:表8.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72t:延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。c)PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說明書進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，體系如表9:表9.連接體系LigationSolution2.5|iL線性化T載體膠回收產(chǎn)物2(jLTotal5(jL反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16'C下連接2小時。d)重組菌的菌液PCR檢測將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37。C培養(yǎng)10小時后進(jìn)行菌液PCR來挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如下表10:表10.PCR反應(yīng)體系ddH2016.55(iL1OxPCRBuffer(plusMgCl2)2dNTPMixture0.4pL7h^0.15)jl,UPMO單P4O單_5^_0.1|xL_Total_20pLPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，57°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72°C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5PCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個重組菌落中有l(wèi)l個可以擴(kuò)增出64bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。e)酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和H/m;ni進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和126bp),確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。3.3、-RACEa)唐魚全魚總RNA經(jīng)上述相同反轉(zhuǎn)錄后，以p5和M13PrimerM4為引物進(jìn)行擴(kuò)增唐魚生長激素基因cDNA的3'端。PCR反應(yīng)體系如表11:表1L3、-RACE反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>50PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94"變性30s，54'C復(fù)性30s，72t:延伸lmin，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。b)PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說明書進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，連接體系如表12:表12.連接體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16。C連接2小時。c)重組菌的菌液PCR檢測將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37r培養(yǎng)10小時后進(jìn)行菌液PCR來挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如表13:表13.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，57t:復(fù)性30s，72r延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72r延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個重組菌落中有l(wèi)l個可以擴(kuò)增出448bp大小片段，初步判斷為陽性克隆。d)酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個陽性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說明書中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和H/m/III進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和510bp)，確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。4.唐魚生長激素基因cDNA全序列的獲得將5'和3'端序列及核心序列用Vector軟件拼接得到唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp，序列見SEQIDN0:1。經(jīng)ExPASy軟件在線分析，該基因的5'非編碼區(qū)為64bp，開放閱讀框(ORF)長633bp，3'非編碼區(qū)為448bp，共編碼210個氨基酸，序列見SEQIDN0:2，其中包括22個氨基酸的信號肽和188個氨基酸的成熟肽。所編碼的氨基酸與近緣魚種(草魚、青魚、鳙魚、鯉魚、金魚、斑馬魚、團(tuán)頭魴、泥鰍)生長激素氨基酸有很高的同源性，其中與草魚和鳙魚的同源性高達(dá)97.6%。實施例3轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、弓1物設(shè)計:根據(jù)上述唐魚生長激素基因ORF序列，設(shè)計一對引物p6和p7。P6:5'-ATGGATCCACCGGTCGCCACCATGGCTAGAGCATTGG-3';P7:5'-ATGCGGCCGCCTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2、PCR基因改造將PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系如表14:表14.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72匸延伸50s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5nLPCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶fiamHI和I將其酶切純化。3、用5amHI和WWI酶切轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed，并回收含有啟動子的載體。用T4連接酶將酶切純化后的唐魚唐魚生長激素基因ORF和含有啟動子的載體進(jìn)行連接。按載體和目的片斷的DNA摩爾數(shù)比為l:3進(jìn)行連接，其余條件參照T4連接酶說明書。轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的詳細(xì)構(gòu)建過程見圖1。實施例4轉(zhuǎn)基因唐魚的外源基因檢測將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入魚受精卵，孵化培育90d，以PCR方法和Southernblot檢測轉(zhuǎn)植基因的整合情況，以KT-PCR和Westernblotting檢測轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH在唐魚組織器官中的表達(dá)。同時觀察實驗組唐魚和對照組唐魚的表型變化，結(jié)果證實重組表達(dá)載體pTLA-GH已成功地轉(zhuǎn)化到唐魚體內(nèi)，并且在唐魚體內(nèi)發(fā)揮了生長激素的促生長生理功能。具體步驟如下1、重組表達(dá)載體pTLA-GH的轉(zhuǎn)入用I酶切重組質(zhì)粒pTLA-GH，使其線性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后測其OD值，調(diào)整濃度至30ng4iL，然后將線性化后的重組表達(dá)載體顯微注射到受精卵'l'。試驗共注射了204顆卵，受精卵于25'C孵化培育。72h后孵化出膜，有85顆卵出膜，成活的有37尾。2、PCR方法檢測根據(jù)重組表達(dá)載體pTLA-GH的序列，設(shè)計一對上下游引物PP-SF禾卩GP-SR。PP-SF:5'-CGGTAGAATGCAGCACGAAAC-3';GP-SR:5'-CGGCCAGCTTCTCAGTGATC-3';提取11尾轉(zhuǎn)植基因唐魚的基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下表15:表15.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72"延伸30s，共30個循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束吋72"C延仲7min。反應(yīng)結(jié)束后取5^LPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測序，結(jié)果證實所擴(kuò)增的片段為轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH，且兩尾個體最大的實驗魚(1#和2#魚)都檢測到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH(圖2)。3、SouthernBlot檢測轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH的整合情況回收上一歩驟PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用分光光度計測定其OD值，并對此片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，Dig探針標(biāo)記和檢測試劑盒DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit購自RocheAppliedScience(Germany)公司。方法如下a)探針標(biāo)記l)取3~10嗎探針DNA，加入雙蒸水至總體積為16^L;2)沸水浴10min，徹底使DNA變性；3)迅速置于冰上冷卻，加入4pLVia11(試劑盒所帶)，短暫離心；4)37。C放置溫育20h;5)加入2pL0.2mol/LEDTA，65。C預(yù)熱10min，終止反應(yīng)。b)標(biāo)記后探針靈敏度檢測標(biāo)記后的探針按1:1、1:10、1:50、1:100、1:500稀釋，點(diǎn)膜檢測效率，步驟如下1)取各稀釋液lpL分別點(diǎn)于已做好記號帶正電的尼龍膜上；2)254nm紫外交聯(lián)3min將探針固定在膜上；3)用一個培養(yǎng)皿裝入20mLMaleicacidbuffer,然后將交聯(lián)后的膜轉(zhuǎn)入馬來酸中，于1525'C孵育2min;4)將膜轉(zhuǎn)入lOmLBlockingsolution中孵育30min;5)將膜轉(zhuǎn)入10邁LAntibobysolution中孵育30min;6)將膜轉(zhuǎn)入10mLWashingbuffer中孵育15min;7)重復(fù)上一步操作；8)將膜于10mLDetectionbuffer,平衡2-5min;9)在膜滴力卩2mL新配colorsubstratesolution,避光顯色2~16h;10)當(dāng)顯色的點(diǎn)密度達(dá)到要求后，用無菌雙蒸水或TEbuffer洗脫5min，終止顯色反應(yīng)。c)轉(zhuǎn)基因唐魚基因組DNA的SouthernBlot檢測取3月齡轉(zhuǎn)pTLA-GH基因唐魚，提取鰭條組織基因組DNA，經(jīng)￡c0RI酶切，反應(yīng)體系如下表16:表16.酶切體系<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>酶切產(chǎn)物經(jīng)純化(V-geneCleanUpKit)后，同時以質(zhì)粒pTLA-GH作為陽性對照。不加EB的瓊脂糖凝膠于10V電泳24h后，采用半干轉(zhuǎn)移法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜，后用標(biāo)記探針進(jìn)行Southernblot雜交，具體操作方法如下1)瓊脂糖凝膠電泳將酶切產(chǎn)物經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳(不加EB)后，經(jīng)含EB的TBE緩沖液染色5min，照相，在UV下切下含目的條帶的膠條并將膠的一角切下作為標(biāo)記，將凝膠浸泡在0.5XTBEbuffer中待用(15min);2)膜準(zhǔn)備剪下大小合適的尼龍膜并在膜的適當(dāng)位置做好正面標(biāo)記(與膠相對應(yīng))，將膜以及2張ExtraThickBlotPaper(加厚濾紙)，4張3M濾紙在0.5xTBEbuffer中浸泡15min;3)電轉(zhuǎn)化按照從正極到負(fù)極的順序?qū)xtraThickBlotPaper、2張3M濾紙、膜、膠、2張3M濾紙、ExtraThickBlotPaper依次在相應(yīng)位置疊好，并保證每層樣品間無氣泡。疊好后從頂部添加適量的0.5xTBEbuffer,用紙巾吸走殘留在正極板上多余的buffer;4)插好電源，保證正負(fù)極方向正確。電轉(zhuǎn)電流不超過3.55niA/cm2，電壓設(shè)為10V，30minlh，可通過EB染色后在UV下觀察凝膠來檢測轉(zhuǎn)膜情況；5)電轉(zhuǎn)完畢后，取出樣品，關(guān)閉電源，將尼龍膜在0.4NNaOH中浸泡5min后，2xSSC洗膜〈5min;6)紫外交聯(lián)將膜在干凈的3M濾紙上放平進(jìn)行UV-crossing，254nm，3min，2次；7)預(yù)雜交將交聯(lián)后的膜放入大小合適的三面封口的袋中，加入4mL(10ml7100cm2)的DIGEasyHyb，保證其間無氣泡，然后將另一邊用封口機(jī)封上；8)在5(TC進(jìn)行預(yù)雜交，30min;9)在雜交的同時，取2pLDNAprobe(25ng/mL)煮沸5min，使探針變性，并立即在冰上冷卻5min;10)雜交取出預(yù)雜交好的膜放入一個新的封口袋中，加入2邁LDIGEasyHyb+2pLDenatureDNAprobe，混和均勻，保證袋中無氣泡并封口；11)將雜交袋放入雜交瓶中，于雜交爐中雜交過夜(12~18h)。12)洗膜雜交完成后，取出膜用2xSSC，0.1%SDS溶液漂洗，室溫2X5min(15-25°C);13)用預(yù)熱到68。C的0.5xSSC，0.1%SDS溶液漂洗膜，68°C，2x15min;14)適量Washingbuffer室溫清洗5min;15)適量Blockingsolution(vial6，1:10inMaleicacidbuffer)封閉30min~lh;16)適量Antibobysolution(vial4，1:5000inBlockingsolution)溫育30min;17)適量Washingbuffer,室溫清洗2x15min;18)適量Detectionbuffer,平衡2~5min;19)顯色將膜放在干凈的3M濾紙上稍經(jīng)空氣干燥后，放入干凈的培養(yǎng)皿中，力卩入4mL新配的colorsubstratesolution(vial5，1:50inDetectionbuffer)，避光顯色。(顯色反應(yīng)立即開始到16h后基本結(jié)束)顯色過程中勿動，但可打開蓋子觀察顯色情況；20)顯色結(jié)束后，用50mL的滅菌dH20洗脫5min，終止顯色反應(yīng)。Southern雜交的結(jié)果，如圖3所示孔道1為陽性對照(pTLA-GH質(zhì)粒:)；孔道2為實驗魚基因組DNA經(jīng)酶切、電泳轉(zhuǎn)膜后，與探針結(jié)合呈陽性條帶；陰性孔道則沒有條帶(圖中未顯示)。實驗結(jié)果說明轉(zhuǎn)植的GH基因已整合到唐魚基因組上。4、RT-PCR方法檢測pTLA-GH在轉(zhuǎn)基因唐魚組織器官中的表達(dá)a)總RNA的提取分別提取轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型的肌肉和內(nèi)臟組織的總RNA，提取方法如下1)將組織加入到預(yù)冷的研缽中迅速敲打數(shù)次并加入Trizol(Invitroen)溶液，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中；2)15'C-25'C放置5min，使細(xì)胞充分裂解；3)加入20(^iLCH4C13，用手劇烈振蕩15s，使溶液呈淡粉白色，室溫放置2~3min使其分層；4)4。C12000rpm離心15min;5)取上清小心轉(zhuǎn)入到無菌1.5mLRNase-FreeEP管中，加入150|iL無水乙醇混勻；6)將混合液全部轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000rpm離心lmin;7)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450pLRPESolution,lOOOOrpm離心30s;8)重復(fù)第7步；9)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中10000rpm離心15s;10)小心取出柱子，放入新的無菌L5mLRNase-FreeEP管中，在膜中央小心加入50nLDEPC—H20，55。080。C放置2min。10000rpm離心lmin。一70°C保存?zhèn)溆?。b)RNA的反轉(zhuǎn)錄取少于lpg的轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)ReverTraAce-a-TM(TOYOBO，Japan)所提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如表17:表17.RT反應(yīng)體系成分體積RNase-FrecddH2011-取5xRTbufferdNTPMixtureRNaseInhibitorl^LOligo(dT)20l|iLRNAXpiL(海g)RevcrTraAcsl^L總體積20|aL反應(yīng)條件42°C30min，99°C5min，4°C5min;反應(yīng)完成后，冰浴5min后瞬時離心，一20'C保存?zhèn)溆?。c)PCR擴(kuò)增①pTLA-GH片段的擴(kuò)增以轉(zhuǎn)基因唐魚和尾野生型唐魚的組織器官的RT產(chǎn)物為模板，以pi和p2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系見表18:表18.PCR反應(yīng)體系成分體積ddH2016.25|iL10xPCRBuffer2萃TaqPIP2反轉(zhuǎn)錄液總體積25(iL反應(yīng)條件如下表PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94"預(yù)變性3min;然后進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)條件為94。C變性30s，54。C退火30s，72。C延伸30s;循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸7min。取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。②P-actin基因片段的擴(kuò)增以RT產(chǎn)物為模板，以p-acitnF(5'-GTGCCCATCTACGAGGGTTACGC-3')和P-acitoR(5'-TGGTCTCGTGGATACCGCAAG-3')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表19:表19.PCR反應(yīng)體系成分體積ddH2016.25jiL醇PCRBuffer2.5pLTaq0.25jiLbeta-acitoFbeta-acitnR反轉(zhuǎn)錄液總體積25PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94t:預(yù)變性3min;然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，94°。變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min;循環(huán)結(jié)束后72。C再延伸7min。取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的肌和內(nèi)臟均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異帶，轉(zhuǎn)基因唐魚的肌肉和內(nèi)臟組織的mRNA分別比野生型唐魚的高34.3%和40.7%。實驗結(jié)果說明轉(zhuǎn)植的GH基因在唐魚體內(nèi)獲得表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因唐魚的GHmRNA高于野生唐魚。5、Westernblotting檢測生長激素的表達(dá)情況a)唐魚肌肉蛋白的提?、俜謩e取轉(zhuǎn)基因唐魚(PCR、Southern雜交和KT-PCR結(jié)果為陽性)和野生型唐魚lOOmg肌肉，加入lmlRlPA和10ulPMSF(不能預(yù)先加入到RIPA中，否則PMSF會失去效能)，在冰里用勻漿器將組織勻漿；②將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，4。C20000g離心30min;③將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無菌離心管中，一20。C保存。b)WesternblottingWesternblotting使用的溶液，見表2025:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注上述成分預(yù)溶于600mLddH20，用鹽酸調(diào)pH至7.4后，再用ddH20定容至1L。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注轉(zhuǎn)移緩沖液預(yù)冷至4'C。表24.封閉液<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注1)10ml底物溶液加入10nl30免的H202，混勻后立即使用；2)或直接使用武漢博士德生物工程公司的DAB顯色試劑盒顯色。Westernblotting操作1)SDS-PAGE①聚丙烯酰胺凝膠的制備電泳前，將電泳槽等用具擦洗干凈，晾干，按要求裝配電泳槽；配制12%的分離膠注入玻璃板夾層中，馬上加ddH20于表面，使膠面保持平整；待分離膠凝聚后，倒去并吸干分離膠表面的水分，配制5%的濃縮膠灌入玻璃板夾層中，插入點(diǎn)樣梳。12%分離膠和5%濃縮膠配置如表26:表26.12%和5%凝膠的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>②上樣將提取的轉(zhuǎn)基因唐魚和非轉(zhuǎn)基因唐魚的肌肉蛋白分別加入等體積的2xSDS-PAGE上樣緩沖液，IO(TC水浴煮沸5min,每個泳道上樣20^L;③電泳起始電壓為100V，待樣品進(jìn)入分離膠后，加大i乜壓至150V，當(dāng)溴酚藍(lán)剛好跑出凝膠時，停止電泳。2)電轉(zhuǎn)移a.切取大小與凝膠一致的硝酸纖維素濾膜(NC膜)l張、普通濾紙8張，并在NC膜的右上角做切口記號；b.把硝酸纖維素濾膜漂浮于去離子水的水面.匕借毛細(xì)管作用使之從下往上濕潤后，將之浸沒于水中，浸泡5min以上，直到濾膜上沒有氣泡；c.把濾紙、墊膜(filterpad)浸泡于少量轉(zhuǎn)移緩沖液中使之充分浸濕；d.SDS-PAGE結(jié)束后從玻璃上取下凝膠，去離子水中略作漂洗；e.按下列順序逐張疊放、精確對齊灰色板在最下方，其上依次放置墊膜、4張濾紙、凝膠、NC膜、4張濾紙、墊膜。小心趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；f.小心地合上轉(zhuǎn)移槽的膠板，并立即放入轉(zhuǎn)移槽'I'。注意不要移動凝膠和濾紙；g.加入轉(zhuǎn)移緩沖液，至轉(zhuǎn)移膠板浸沒。同時加入冰盒避免電泳過程緩沖液溫度過高；h.接通電源，注意正負(fù)極方向。凝膠位于負(fù)極，NC膜位于正極。50V，2h;i.轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開膠板取出NC膜，室溫干燥30min。根據(jù)預(yù)染蛋白Marker的條帶清晰狀況判斷轉(zhuǎn)膜效果。3)封閉a.按濾膜面積O.lml/cm2的量加入封閉液，盡可能排除里面的氣泡，然后密閉袋口，平放，室溫?fù)u床孵育l2h或4t:過夜；1)1>85溶液洗膜3次，10111111/次。加入含一抗的封閉液(稀釋比例為1:1000)，4。C平緩搖23h;c.TBST溶液(含0.40.5%T\veen20的TBS)漂洗3次,10min/次。再用TBS漂洗3次，10min/次。4)與二抗反應(yīng)a.二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG羊抗兔)用封閉液按1:400的比例稀釋，室溫緩慢搖動lh;b.PBS洗NC膜3次，10min/次。再用TBS漂洗3次,10min/次。5)顯色按DAB顯色試劑盒的使用說叨，分別加入A、B、C液各1滴至lmlddH20中，1030min顯色，待蛋白帶顏色深度達(dá)到耍求后用水終止反應(yīng)，掃描NC膜。Westernblotting的結(jié)果如圖4所示轉(zhuǎn)基因唐魚和野生型唐魚的肌肉巾均可檢測到大小與生長激素蛋白相當(dāng)(21KD)的特異性條帶，陽性對照(重組鯉魚GH)條帶最清晰(第1泳道)，實驗魚(第三泳道)的條帶比野生型的明顯性(第二泳道)。6、培育70d和100d，分別測定對轉(zhuǎn)植基因和非轉(zhuǎn)基因唐魚進(jìn)行了全長和體重，數(shù)據(jù)見表27。培育70d的實驗魚中有3尾大體型魚，其中最大個體的體重是對照組魚最大個體體重的1.7倍，是對照組魚平均體重的2.5倍；培育100d，實驗組最大個體體重1.120g，是對照組最大個體體重的2.1倍，是對照組平均體重的3.0倍。表27.實驗組與對照組魚全長與體重平均值70d100d實驗魚平均全長(mm)平均體重(g)平均全長(mm)平均體重(g)轉(zhuǎn)基因唐魚28.66±5.270.242±0.09233.71±4.970.401±0.087(共37尾)非轉(zhuǎn)基因唐魚27.41±5.000.203士0.04232.22±4.300.373±0.041(共32尾)綜合PCR、Southern雜交、RT-PCR和Westernblotting雜交結(jié)果，以及體長體重的數(shù)值比較，說明轉(zhuǎn)植的GH基因整合到了實驗唐魚體中并進(jìn)行了有效的GHmRNA的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)了GH蛋白，發(fā)揮了GH的促生長功能。唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.t.xtSEQUENCELIST頂G<110〉中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所〈120〉唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用〈130〉<160〉2<170〉Paterrtlnversion3.2<210〉1<211〉1145<212〉DMA<213〉唐魚(Tanichthysalbonubes)〈220〉<221>CDS<222〉(65)..(694)<400〉1acgcggggaaaccttcacagcaagccttcaactaagaacacaagagttggcaacccagag60caaaatggetagagcattggtgctgtttteggtggttctggttagtttg109MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeu151015ttggtgaaccaggggagagccteagagaaccageggetcateaacaat157LeuAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsn202530getgtcatecgt.gttcaacacctgcaccagctggetgcaaaaatgatt205AlaVallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlie354045aacgactttgaggacaacctgttgcctgaggaacgcagacagctgag"t253AsnA_spPhe6luAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSer505560aaaatttttcct.ctgtctttctgcaactctgactecattgaggcgccc301LysliePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaPro657075actggaaaagatgaaacgcagaagaget.ct.atgt.tgaagetccttcgc349ThrGlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArg80859095atetctttccgcetcattgagtectgggagtttcccagecagaccctg397lieSerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeu100105110agtggaaccgtctctaacagectgaccgtcgggaaccccaaccagate445SerGlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlvAsnProAsnGinlie115120125actgagaagctggccgacttgaaagtgggcateagegtgetcateaag493ThrGluLysLeuAlaAspLeuLysValGlvlieSerValLeulieLys130135140ggatgtctggatggtcaaccaaacatggacgacaatgactecctgccg541GlvCysLeuAspGlyGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuPro145150155ctgcctttcgaggatttctacttgaccatgggggagaacageetcaga589LeuProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArg160165170175gagagetttcgtcttctggettgcttcaagaaggacatgcacaaggtg637GluSerPheArgLeuLeuAlaCysPheLvsLysAspMetHisLysVal180lbOgaaacttacctgagggttgcaetattgcaggagatecctggatteaaac685GluThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsn唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.txt195200205tgcaccctgt鄰a.gggcgccaaagtattgctagtcatagcctgtaacac734CysThrLeu210gtgtgct.tcgct.t.aattaal:tatctggtcttacatacccagaaaaggtcaagcaggct.gg794gtt3gtmgt.tctatatttccctcaccct.ttt.gtntttttcttctattttg,attg854cccattatttatggtgggatctgattaaacatttaaaagtattttatggc914ataat.attttaaaat.ttgcccttttcactt.t.ggcttattatg3CCCC333aagggttaag974犯tgctt.ttggccaa犯c^agtgtttgaatggtgggtttcccccccsatggttgggatg1034cttaataccaatggt.gttttaattgttagatcgggttttt1094ct.ggtgt.gattttccccaaaaaattttaaaacggc3ca^1145<210〉2〈211〉210〈212>PRT<213>唐魚()<400>2MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeuLeu151015ValAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsnAla202530VallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlieAsn354045AspPheGluAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSerLys505560liePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaProThr65707580GlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArglie859095SerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeuSer100105110GlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlyAsnProAsnGinlieThr115120125GluLysLeuAlaAspLeuLysValGlylieSerValLeulieLysGly130135140CysLeuAspGlvGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuProLeu145150155160ProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArgGlu165170175SerPheArgLeuLeuAlaCvsPheLysLysAspMetHisLysValGlu180185190唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.txtThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsnCys195200205ThrLeu210權(quán)利要求1.唐魚生長激素基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬氧化物為Na20、LO或Cs20;所述的堿土金屬氧化物為CaO、MgO或BaO;所述的過渡金屬氧化物為FeO、MnO、NiO、CuO、CoO、SbO、HgO、VO、WO、MoO或Ti。2。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬鹵化物為NaX、KX或CsX;所述的堿土金屬卣化物為CaXz、MgX2或BaX2;所述的過渡金屬卣化物為FeX2、MnX2、CuX2或HgX;其中X為氟、氯、溴或者碘。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬氫氧化合物為NaOH、KOH或CsOH;所述的堿土金屬氫氧化合物為Ca(OH)2、Mg(OH)2或Ba(OH)2;所述的過渡金屬氫氧化合物為Fe(0H)2或A1(0H)3。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的過渡金屬有機(jī)化合物為醋酸鋅、醋酸銅、醋酸鐵或醋酸鎳。6、根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項所述燃煤催化劑，其特征在于該催化劑在溫度為IOO(TC時，失重30-50%。7、權(quán)利要求1-5任一項所述多功能燃煤催化劑的制備方法，其特征在于，以摩爾份數(shù)計，將氧化物1~25份、鹵化物2~10份、氫氧化合物1~25份、有機(jī)金屬化合物1~IO份和堿金屬的鹽1~25份混合，過篩，得燃煤催化劑；所述氧化物為堿金屬氧化物、堿全文摘要本發(fā)明公開了唐魚生長激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)GenBank上已登陸的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計了一對引物(p1和p2)，然后提取唐魚總RNA，以總RNA為模板，P1和P2為引物，獲得了唐魚生長激素基因的cDNA序列，全長1145bp。本發(fā)明將唐魚生長激素基因連接到轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，構(gòu)建了新的重組表達(dá)載體，并且成功在轉(zhuǎn)基因唐魚內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明的唐魚生長激素基因能應(yīng)用于唐魚等魚類的生長促進(jìn)，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號C12N15/16GK101220362SQ200710031440公開日2008年7月16日申請日期2007年11月16日優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日發(fā)明者勞海華,星葉,夏仕玲,王海英,白俊杰,清簡,郁二蒙申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所