專利名稱：一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方 法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，是研究肺循環(huán)相關(guān)疾病、尤其是肺動(dòng)脈高壓等疾病發(fā) 病機(jī)制的重要細(xì)胞材料。目前培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法包括酶消化法和組織塊貼片 法。動(dòng)物來(lái)源多為大鼠，大鼠與人的種屬不同細(xì)胞間差異較大，所以用成人的肺動(dòng)脈平 滑肌細(xì)胞進(jìn)行肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制及相關(guān)研究的意義明顯大于用動(dòng)物的細(xì)胞。但由于取 材困難，并且人類是高等進(jìn)化的生物體其細(xì)胞在體外成功培養(yǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)難于低等生物，同時(shí) 因?yàn)槌扇思?xì)胞體外生長(zhǎng)的潛伏期明顯長(zhǎng)于大鼠等動(dòng)物所以體外成功培養(yǎng)更加困難。鑒于 以上原因，目前國(guó)內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)研究培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞多采用大鼠為材料；部分學(xué) 者采用引產(chǎn)胎兒(18周內(nèi))的肺動(dòng)脈主干進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樘杭?xì)胞增殖能力強(qiáng)易于培養(yǎng)， 并且肺動(dòng)脈主干平滑肌層厚細(xì)胞易于分離，但胎兒尚未發(fā)育成熟其細(xì)胞與成人細(xì)胞有所 差異，而且肺動(dòng)脈高壓的主要病理改變部位位于肺遠(yuǎn)端動(dòng)脈。所以采用胎兒肺動(dòng)脈主干 進(jìn)行肺動(dòng)脈高壓機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)并不理想。而國(guó)外學(xué)者除采用動(dòng)物為材料(大部分為大 鼠)夕卜；部分學(xué)者也購(gòu)買(mǎi)成人的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)但細(xì)胞株價(jià)格昂貴并且非 原代培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞生物學(xué)特征有所改變影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而少部分學(xué)者也培養(yǎng)成人遠(yuǎn) 端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，但其采用的培養(yǎng)基為平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMBM)這種培養(yǎng)基 價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)一般的實(shí)驗(yàn)室難以接受。綜上所述，尋找一種高效、簡(jiǎn)便、成本低的成 人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法成為了實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法技術(shù) 穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好，且具有典型的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及 特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，它包括以下步驟組成(1)獲取原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞從取得的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑 肌層中分離遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。以獲得原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；(2)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)步驟(l)中的原代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取出原代細(xì)胞用PBS (磷酸鹽緩沖液)溶液清洗后，加入0. 3 0. 5ml 0. 1 % 0.2%胰蛋白酶溶液35 37°。消化2 3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)， 吸除胰蛋白酶溶液，加入3 5ml完全培養(yǎng)液，使之形成細(xì)胞懸浮液，接種于新的培養(yǎng) 瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌 細(xì)胞。所述的步驟(2)中的完全培養(yǎng)液為；胰蛋白酶溶液中含有0.1%EDTA(乙二胺四乙 酸)，所述的細(xì)胞接種密度為2 3X105個(gè)/ml，以保持細(xì)胞生長(zhǎng)有足夠的空間、營(yíng)養(yǎng)。步驟(2)中所述的完全培養(yǎng)基是含90 105U/ml青霉素、90 105mg/ral鏈霉素的 低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培 養(yǎng)基總體積的10 20%。所述的HBSS(Hank， s平衡鹽溶液)含125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、 1 1.5mol/L氯化鎂、5 15mol/LHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)、15 25 n mol/L氯化鈣、 5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ml鏈霉素的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。所述的步驟(l)獲取原代培養(yǎng)的成人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的具體步驟為 1〉采用分次酶消化法，將分離并剝離了內(nèi)外膜的血管中膜組織剪成小塊，放入HBSS 中4。C靜置20 30min，然后放入無(wú)含鈣的HBSS中室溫靜置10 20min;再將組織塊放入 離心管中加入消化液35 37。C消化35 45min，可見(jiàn)組織塊松軟、邊緣發(fā)毛。2〉吸出消化液，向離心管中加入完全培養(yǎng)基2 3ml，室溫放置3 5min;廣口巴氏 吸管吹打10 15次，靜置片刻使組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一離心管中，再 將原消化液加入原離心管中進(jìn)行再次消化并按以上步驟收集細(xì)胞；將收集的細(xì)胞懸浮液 離心，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度并以該密度種植于培養(yǎng)板中，置37T、 5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，3d后半量更換培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，便獲得了 原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。所述步驟2〉中依據(jù)組織消化的情況，重復(fù)收集細(xì)胞操作2 4次。 所述步驟2〉中的細(xì)胞密度是2 3 X 105細(xì)胞/ml 。所述的無(wú)鈣的HBSS溶液是含125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、l 1. 5mol/L氯化鎂、5 15raol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES) 、 5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、 90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ml鏈霉素的水溶液，該溶液的PH值為7 7. 5。所述的消化液含125 135raol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化 鎂、5 15mol/LHEPES、 5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、2. 0 3. 0mg/ml1型膠原酶、9 10 U/ml 木瓜蛋白酶、1 3mg/ml牛血清白蛋白、0. 5 1. 51mmol/L DTT(l， 4-二硫代蘇糖醇)、90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ml鏈霉素的水溶液，該溶液的ffl值為7 7. 5。步驟2〉中所述的完全培養(yǎng)基是含90 105U/ml青霉素、90 105mg/ml鏈霉素的 低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培 養(yǎng)基總體積的10 20%。本發(fā)明所使用的試劑均用0. 2 0. 22 " m濾膜過(guò)濾除菌。 本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果1、 借助顯微鏡、顯微鑷、顯微剪等精細(xì)工具突破了運(yùn)用酶消化法培養(yǎng)出高純度的 成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的技術(shù)難關(guān)，填補(bǔ)了該領(lǐng)域空白。2、 培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好。3、 獲得的細(xì)胞經(jīng)過(guò)顯微鏡觀察及細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定具有典型的遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌 細(xì)胞形態(tài)及特點(diǎn)，而且肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的取材部位位于遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈，該部分細(xì)胞對(duì)研 究肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制更有意義。為進(jìn)一步深入研究肺循環(huán)相關(guān)疾病、小血管相關(guān)疾病， 尤其是肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了條件，提供了豐富的材料來(lái)源。


圖1是倒置相差顯微鏡(100X)下原代培養(yǎng)20天成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞照片； 圖2是倒置相差顯微鏡(100X)下原代培養(yǎng)35天成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞照片； 圖3是倒置相差顯微鏡(100X)下傳代培養(yǎng)3天成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞照片； 圖4是倒置相差顯微鏡(100X)下傳代培養(yǎng)7天成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞照片；圖5是激光掃描共聚焦顯微鏡(200 X )下原代培養(yǎng)成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色照片；FITC標(biāo)記的細(xì)胞漿a -Act in抗原發(fā)綠色熒光、DAPI標(biāo)記的細(xì)胞 核發(fā)紅色熒光；圖6是激光掃描共聚焦顯微鏡(600 X )下原代培養(yǎng)成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色照片；圖7是激光掃描共聚焦顯微鏡(200 X )下原代培養(yǎng)成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色照片；陰性對(duì)照無(wú)加a -Actin單克隆抗體，僅用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，可見(jiàn)細(xì)胞核發(fā)紅色熒光；圖8是激光掃描共聚焦顯微鏡(IOOX)下原代培養(yǎng)成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色照片；圖9是透射電鏡(28000 X )下原代培養(yǎng)成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，可見(jiàn)胞漿中肌絲(個(gè))、密體(A )、密斑( ^ )。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。實(shí)施例一 具體步驟1、主要實(shí)驗(yàn)材料 (1)試劑配制1、 HBSS:含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1. 2mol/L氯化鎂、10mol/L羥乙基 哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 20ixmol/L氯化鈣、10mol/L無(wú)水葡萄糖、100 U/ml青霉素和 100mg/ml鏈霉素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。2、 無(wú)鈣的HBSS:含130mol/L氯化鈉、5raol/L氯化鉀、1.2mol/L氯化鎂、10mol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無(wú)水葡萄糖、100 U/ml青霉素和100mg/ml鏈 霉素水溶液，該溶液的PH值為7.4。3、 預(yù)消化液含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1. 2mol/L氯化鎂、10mol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無(wú)水葡萄糖、1. 5mg/ml I型膠原酶、100 U/ml 青霉素和100mg/ml鏈霉素水溶液，該溶液的TO值為7. 4。4、 消化液含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1.2mol/L氯化鎂、10mol/L羥乙 基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無(wú)水葡萄糖、2. 5mg/ml I型膠原酶、9. 5 U/ml木瓜 蛋白酶、2mg/ml牛血清白蛋白、l鵬ol/L DTT、 100 U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素水 溶液，該溶液的PH值為7.4。5、 胰蛋白酶溶液.-含0.2^(m/v)胰蛋白酶和0. lX(m/v)的EDTA。6、 完全培養(yǎng)基是含100/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的低糖DMEM和胎牛血清的 混合溶液，所述的胎牛血清占培養(yǎng)基總體積的10%以上試劑經(jīng)0. 22 u m濾膜過(guò)濾除菌。(2)組織來(lái)源無(wú)肺動(dòng)脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除術(shù)，取切除肺葉的遠(yuǎn) 端肺組織。2、操作步驟(1) 獲取成人肺動(dòng)脈平滑肌1) 在無(wú)菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的HBSS中，置入冰盒 中低溫保存并盡快于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2) 將肺組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用冷朋SS清洗去除血污；置于體式顯微鏡下，用 顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡觀察下小心分離遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈；在分離過(guò)程中需要不斷更換冷 HBSS;分離得到的肺動(dòng)脈組織置于冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動(dòng)脈組織放入預(yù)消化液中25。C溫度下進(jìn)行預(yù)消化10min，將血管放入冷 HBSS中以洗去預(yù)消化液，于顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝 離外膜的血管條縱向剪開(kāi)，內(nèi)面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜，留中膜平滑肌層；(2) 獲取原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3mm，放入HBSS中4°C靜置30min，然后放入無(wú)含鈣 的HBSS中室溫靜置20min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液37。C消化45min，可見(jiàn)組織塊松軟、邊緣發(fā)毛；3) 輕輕吸出消化液，加入完全培養(yǎng)基3 ml，室溫放置3min。廣口巴氏吸管吹打 10次，可見(jiàn)液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉淀于離心管底部，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一離心管中。 原消化液加回組織塊中繼續(xù)消化5min,按上述步驟收集細(xì)胞。再重復(fù)5min消化操作2 次；5) 將收集的細(xì)胞懸浮液離心(800rpm， 5min)，棄上清液，加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 密度以3X 105個(gè)加1的密度種植于6孔培養(yǎng)板中(其中2孔放入蓋玻片，鑒定時(shí)用)。置 37°C、 5%(]02培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，10 14天后換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即 完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。(3)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，即可傳代。屆時(shí)，用2mlPBS溶液清洗細(xì)胞2次，加入0. 5ml 0.2X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 37'C消化3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間 隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之形成細(xì) 胞懸浮液，以2X105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳 孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果(1) 、倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、單個(gè)均勻分布。原代 培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢14天左右可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁、 展開(kāi)細(xì)胞形態(tài)多樣，呈棱形、多角形、星形或不規(guī)則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞 核多為卵圓形多數(shù)細(xì)胞為單核，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核，有一個(gè)或多個(gè)核仁。20 25 天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)(圖l)，細(xì)胞間常有突起相連。30 35天細(xì)胞生 長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)形成"峰"，"峰"與"峰"之間細(xì)胞 層數(shù)漸少，形成"谷"。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合后，細(xì)胞間相互平行排列成束，高低起伏， 形成典型的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征"峰""谷"狀生長(zhǎng)(圖2)。(2) 倒置相差顯微鏡下觀察，傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)速 度較原代培養(yǎng)細(xì)胞明顯加快。傳代后1天細(xì)胞貼壁、展開(kāi)可見(jiàn)細(xì)胞呈棱形、多角形、星形或不規(guī)則形，3天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)，細(xì)胞間常有突起相連(圖3)。 7天后細(xì)胞生長(zhǎng)至融合，形成典型的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征"峰""谷"狀生長(zhǎng)(圖4)。 原代培養(yǎng)的細(xì)胞與傳代細(xì)胞形態(tài)一致。(3) 平滑肌a-Actin抗原的免疫熒光檢測(cè)采用平滑肌a-Actin單克隆抗體對(duì)培 養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并采用國(guó)際常用的復(fù)染法進(jìn)行染色，用MPI對(duì)所有細(xì)胞核進(jìn)行染色， 保證細(xì)胞純度計(jì)算的可靠性。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)FITC標(biāo)記的細(xì)胞 槳平滑肌a-Actin抗原發(fā)綠色熒光，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核發(fā)紅色熒光(圖5)。高倍鏡下 觀察，平滑肌細(xì)胞胞漿中的肌絲平行于細(xì)胞長(zhǎng)軸呈細(xì)絲狀表達(dá)(圖6)。陰性對(duì)照無(wú)加 一抗，僅檢測(cè)到DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核沒(méi)有檢測(cè)FITC標(biāo)記的平滑肌a -Actin，所以僅見(jiàn)發(fā) 紅色熒光(圖7)。低倍鏡計(jì)算細(xì)胞純度，每張片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少檢測(cè) 200個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)視野中ci-Actin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占該視野總細(xì)胞數(shù)的比例，為平滑 肌細(xì)胞純度。平均達(dá)98%以上(圖8)。(4) 透射電鏡檢測(cè)透射電鏡下觀察到遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌胞槳中有與細(xì)胞長(zhǎng)軸平 行的肌絲及與其相連的有密體、密斑(圖9)，顯典型的收縮表形結(jié)構(gòu)特征。實(shí)施例二具體步驟1、主要實(shí)驗(yàn)材料(1)試劑配制1、 HBSS:含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15 ymol/L氯化鈣、15mol/L無(wú)水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ml鏈霉素水溶液，該 溶液的PH值為7.4。2、 無(wú)鈣的HBSS:含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15mol/L無(wú)水葡萄糖、105U/ml青霉素和105mg/ral鏈霉素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。3、 預(yù)消化液含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15mol/L無(wú)水葡萄糖、1.3mg/ml I型膠原酶、105 U/ml青霉素和105mg/ml鏈霉素水溶 液，該溶液的PH值為7.4。4、 消化液含125raol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、15mol/L無(wú)水葡萄糖、2.0mg/ml I型膠原酶、10 U/ml木瓜蛋白酶、lmg/ml牛血清白蛋白、0. 5mmol/L DTT、 105 U/ml青霉素和105mg/ml鏈霉素水溶液，該溶液的PH值為 7.4。5、 胰蛋白酶溶液含0. 1% (m/v)胰蛋白酶和0. 1% (m/v)EDTA。6、 培養(yǎng)基含90U/ml青霉素、90mg/ml鏈霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混 合溶液，所述的胎牛血清占培養(yǎng)基總體積的20%。以上試劑經(jīng)0. 2 P m濾膜過(guò)濾除菌。(2)組織來(lái)源無(wú)肺動(dòng)脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除，取切除的肺葉的遠(yuǎn) 端肺組織。2、操作步驟(1)獲取成人肺動(dòng)脈平滑肌1) 在無(wú)菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的朋ss中，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2) 將肺組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用冷朋SS清洗去除血污；置于體式顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡觀察下小心分離遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈；在分離過(guò)程中需要不斷更換冷HBSS;分離得到的肺動(dòng)脈組織置于冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動(dòng)脈組織放入預(yù)消化液中2(TC溫度下進(jìn)行預(yù)消化8min，將血管放入冷朋SS 中以洗去預(yù)消化液，于顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝離外膜的血管條縱向剪開(kāi)，內(nèi)面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜，留中膜平滑肌層； (2)獲取原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3mm，放入HBSS中4°C靜置20min，無(wú)含鈣的HBSS 中室溫靜置15min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液35。C消化35min，可見(jiàn)組織塊松軟、邊緣發(fā)毛；3) 輕輕吸出消化液，加入培養(yǎng)基2.5ml，室溫放置.4min。廣口巴氏吸管吹打數(shù)次， 可見(jiàn)液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉淀于離心管底部，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一離心管中。 原消化液加回組織塊中繼續(xù)消化5min，按上述步驟收集細(xì)胞。再重復(fù)5min消化操作3次；5)將收集的細(xì)胞懸浮液離心(800rpm, 5min)，棄上清液，加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 密度以2X105個(gè)/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板中(其中2孔放入蓋玻片，鑒定時(shí)用)。置 37°C、 5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，10 14天后換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即 完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。(3)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，即可傳代。屆時(shí)，用2mlPBS溶液清洗細(xì)胞2次，加入0. 5ml 0. 1X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 35'C消化3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間 隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之形成細(xì) 胞懸浮液，以2X105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳 孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果與實(shí)施例一相同。 實(shí)施例三-具體步驟-1、主要實(shí)驗(yàn)材料(1)試劑配制1、 HBSS:含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 25umol/L氯化鈣、5mol/L無(wú)水葡萄糖、90 U/ml青霉素和90mg/ml鏈霉素水溶液，該 溶液的PH值為7.4。2、 無(wú)鈣的HBSS:含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、 15mol/LHEPES、 5mol/L無(wú)水葡萄糖、90 U/ml青霉素和90mg/ml鏈霉素水溶液，該溶液 的PH值為7.4。3、 預(yù)消化液含135mol/L氯化鈉、3raol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 5raol/L無(wú)水葡萄糖、1.0mg/ml I型膠原酶、90U/ml青霉素和90mg/ml鏈霉素水溶液， 該溶液的PH值為7.4。4、 消化液含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 5mol/L無(wú)水葡萄糖、3. 0mg/ml I型膠原酶、9 U/ml木瓜蛋白酶、3mg/ml牛血清白蛋白、 1. 5mmol/L DTT、 90 U/ml青霉素和90mg/ml鏈霉素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。5、 胰蛋白酶溶液含0. 15% (m/v)胰蛋白酶和0. 1% (m/v)EDTA。6、 培養(yǎng)基:含105U/ml青霉素、105mg/ml鏈霉素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清) 混合溶液，所述的胎牛血清占培養(yǎng)基總體積的15%。以上試劑經(jīng)0. 21IX m濾膜過(guò)濾除菌。(2)組織來(lái)源無(wú)肺動(dòng)脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除，取切除的肺葉的遠(yuǎn) 端肺組織。2、操作步驟(1) 獲取成人肺動(dòng)脈平滑肌1) 在無(wú)菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的HBSS中，置入冰盒 中低溫保存并于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2) 將肺組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用冷HBSS清洗去除血污；置于體式顯微鏡下，用 顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡觀察下小心分離遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈；在分離過(guò)程中需要不斷更換冷 朋SS;分離得到的肺動(dòng)脈組織置于冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動(dòng)脈組織放入預(yù)消化液中23。C溫度下進(jìn)行預(yù)消化5min，將血管放入冷HBSS 中以洗去預(yù)消化液，于顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝離外 膜的血管條縱向剪開(kāi)，內(nèi)面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜，留中膜平滑肌層；(2) 獲取原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3畫(huà)，放入朋SS中4°C靜置25min，無(wú)含鈣的HBSS 中室溫靜置10min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液36nC消化38min，可見(jiàn)組織塊松軟、邊緣發(fā)毛；3) 輕輕吸出消化液，加入培養(yǎng)基2ml，室溫放置5min。廣口巴氏吸管吹打20次， 可見(jiàn)液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉淀于離心管底部，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一離心管中。原消化液加回組織塊中繼續(xù)消化5min,按上述步驟收集細(xì)胞。再重復(fù)5min消化操作4 次；5)將收集的細(xì)胞懸浮液離心(800rpm， 5min),棄上清液，加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 密度以2. 5X 1()5細(xì)胞/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板中(其中2孔放入蓋玻片，鑒定時(shí)用)。 置37。C、 5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，10 14天后換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。(3)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，即可傳代。屆時(shí)，用2mlPBS溶液清洗細(xì)胞2次，加入0. 4ml 0. 15X(m/v)胰蛋白酶溶液36t;消化3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除 胰蛋白酶溶液，加入5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之形成細(xì)胞懸浮液，以2.5 X105個(gè)Ai1的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37'C、 5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每 2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果與實(shí)施例一相同。
權(quán)利要求
1、一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)獲取原代培養(yǎng)的成人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞從獲取的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌層中分離肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；(2)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)步驟(1)中的原代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取出原代細(xì)胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培養(yǎng)液，使之形成細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟(2)中的胰蛋白酶溶 液中含有O. 1%乙二胺四乙酸，所述的細(xì)胞接種密度為2 3Xl()S個(gè)/ml。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的完全培養(yǎng)基是含90 105U/ml青霉素、90 105mg/ml鏈霉素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎 牛血清占培養(yǎng)基總體積的10 20%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟(l)獲取原代培養(yǎng)的 成人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的具體步驟為1〉采用分次酶消化法，將分離并剝離了內(nèi)外膜的血管中膜組織剪成小塊，放入HBSS 中4T靜置20 30min，然后放入無(wú)含鈣的HBSS中室溫靜置10 20min;再將組織塊放入 離心管中加入消化液35 37 。C消化35 45min;2〉吸出消化液，向離心管中加入完全培養(yǎng)基2 3ml，室溫放置3 5min;廣口巴氏 吸管吹打10 15次，靜置片刻使組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一離心管中，再 將原消化液加入原離心管中進(jìn)行再次消化并按以上步驟收集細(xì)胞；將收集的細(xì)胞懸浮液 離心，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度并以該密度種植于培養(yǎng)板中，置37。C、 5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，3d后半量更換培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，便獲得了 原代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟2〉中的細(xì)胞密度是2 3 Xl。5個(gè)/ml。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的朋SS溶液含125 135mol/L 氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、15 25iimol/L氯化轉(zhuǎn)、5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ml鏈霉素的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的無(wú)鈣的HBSS溶液是含 125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基 哌嗪乙硫磺酸、5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ral鏈霉素 的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的消化液* 125 135mol/L 氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、5 15mol/L無(wú)水葡萄糖、2. 0 3. 0mg/ml1型膠原酶、9 10 U/ml木瓜蛋白酶、1 3mg/ml 牛血清白蛋白、0. 5 1. 51腿ol/L 1,4-二硫代蘇糖醇、90 105 U/ml青霉素和90 105mg/ml鏈霉素的水溶液，該溶液的ra值為7 7. 5。
9、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的完全培養(yǎng)基是含90 105U/ml青霉素、90 105mg/ml鏈霉素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎 牛血清占培養(yǎng)基總體積的10 20%。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟2〉中依據(jù)組織消化的 情況，重復(fù)收集細(xì)胞操作2 4次。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)從獲取的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌層中分離肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)；(2)獲取傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)步驟(1)中的原代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取出原代細(xì)胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培養(yǎng)液，使之形成細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的成人遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。該培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好，且具有典型的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101250500SQ20071003301
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者冉丕鑫, 盧文菊, 彭公永, 冰 李, 李曉巖, 城 洪, 健 王, 胡錦興 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院