專利名稱:水稻OsCS編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)以及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種在水稻中表達(dá)的檸檬酸合酶(水稻檸檬酸合酶,citrate synthase,OsCS)的克隆,拷貝數(shù)分析,基因表達(dá)模式分析,轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建,植物轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及相應(yīng)的生理生化特性的鑒定。
背景技術(shù):
世界上有近40%的耕作土壤受到酸雨的侵蝕。其中鋁(Al)毒是酸性土壤限制作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。采用遺傳工程手段培育優(yōu)良品種適應(yīng)不良土壤具有一定應(yīng)用潛力。根系分泌的有機(jī)酸對植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)具有一定的重要性。尤為重要的是,分泌有機(jī)酸提高了植物對鋁毒的抗性,主要是有機(jī)酸可螯合根區(qū)鋁離子,減少了鋁進(jìn)入細(xì)胞的量,因此使植物免遭鋁毒傷害。有機(jī)酸與抗鋁毒具有密切關(guān)系,在擬南芥、燕麥和小麥等物種中都有相關(guān)的報(bào)道。進(jìn)行鋁毒處理,不同植物以及同一植物的不同品種間,分泌有機(jī)酸的種類與能力均有所不同,主要包括檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和草酸等。
由于檸檬酸在抗鋁毒上的有效性,檸檬酸合酶已成為目前研究的熱點(diǎn)。檸檬酸合酶是線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)和質(zhì)體內(nèi)乙醛酸循環(huán)起始反應(yīng)中的酶,催化CoA和草酰乙酸生成檸檬酸。生成的檸檬酸不僅作為代謝的中間產(chǎn)物,同時(shí)其分泌植物體外具有螯合毒素離子的作用。因此,檸檬酸合成的關(guān)鍵酶-檸檬酸合酶的基因克隆與轉(zhuǎn)基因工作也顯得尤為重要。目前已在擬南芥和胡蘿卜等植物品種中分離到檸檬酸合酶編碼基因,并多為線粒體特異表達(dá)。檸檬酸合酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化功能證明此基因的表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株的檸檬酸的分泌量和植物的鋁毒抗性。
本發(fā)明研究了一種從水稻中克隆催化生成檸檬酸的檸檬酸合酶(OsCS),轉(zhuǎn)入煙草后提高檸檬酸分泌量的技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)不僅可提高鋁毒處理下植物中檸檬酸分泌量,預(yù)期可以使植物在鋁含量較高的土壤環(huán)境下正常生長,同時(shí)可能提高磷的有效利用率,可擴(kuò)大植物(如水稻)等的栽培范圍。
在本發(fā)明被公布之前,尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請中提及的水稻OsCS序列及其核酸序列。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的水稻基因OsCS,該基因是一個(gè)線粒體的檸檬酸合酶基因。
本發(fā)明的第二目的是提供這種水稻蛋白OsCS編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物檸檬酸分泌量,以及鋁毒抗性的應(yīng)用。
本發(fā)明一方面提供一種分離出的DNA分子,其編碼水稻檸檬酸合酶的開放閱讀框,具體見SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面還提供,上述序列編碼的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還提供了一種檢測OsCS mRNA時(shí)空表達(dá)模式的方法,其步驟如下(1)取水稻幼苗(兩葉一心期)葉片和根,固定,石蠟切片。
(2)利用OsCS的開放讀框的RNA為探針,雜交顯色。
本發(fā)明還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有水稻OsCS酶活性的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入煙草以提高檸檬酸分泌量的方法,其步驟如下(1)將水稻OsCS基因的開放讀框連于植物表達(dá)載體,形成含有水稻OsCS基因(SEQID NO.1的核苷酸序列)的植物表達(dá)載體;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌,將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同煙草葉片共培養(yǎng),在25±2℃條件下,暗培養(yǎng)2天;(3)通過抗生素篩選,PCR鑒定,獲得水稻OsCS基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因植株。含有水稻OsCS基因的轉(zhuǎn)基因植株的檸檬酸分泌量有較大程度的提高。
本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中水稻檸檬酸合酶拷貝數(shù)的方法,它包括用SEQ IDNO.1所示序列與樣品雜交,然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是水稻和轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸序列。
這里所述探針為下述核酸分子,它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中第893-910個(gè)連續(xù)的核苷酸和第1405-1425個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中水稻檸檬酸合酶表達(dá)模式的方法,它包括用用SEQ IDNO.1所示序列制備探針,并與樣品進(jìn)行雜交,然后檢測是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是水稻幼苗葉片和根的石蠟切片。
本發(fā)明還提供了一種鑒定轉(zhuǎn)基因煙草的核酸分子,它包括用前述核苷酸序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng),然后檢測是否擴(kuò)增出目的片段;樣品為轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA。
本發(fā)明的另一方面,還提供了一種測定轉(zhuǎn)基因煙草檸檬酸分泌量的方法,其步驟如下(1)取胞外部分(培養(yǎng)液)依次通過陰陽離子交換樹脂后,用鹽酸將保留于陰離子交換樹脂上的有機(jī)酸洗脫收集,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮洗脫液,溶于700μl水,進(jìn)行高效液相色譜儀測定。
(2)高效液相色譜儀測定程序流動(dòng)相為50mM HClO4,柱溫為50℃,流速為1.0ml/min,測定20min。
本發(fā)明的水稻OsCS蛋白的核苷酸全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法,可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物,并用市售的cDNA或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板,擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí),常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增,然后將各次擴(kuò)增出的片斷按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體,在轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離到有關(guān)序列。
表1為本發(fā)明的水稻OsCS基因編碼的蛋白質(zhì)序列與胡蘿卜(Daucus carota),煙草(Nicotiana tabacum),甜菜(Beta vulgaris subsp.),擬南芥(Arabidopsis thaliana),柑桔(Citrusjunos)氨基酸序列同源性比較表(相同氨基酸序列以“*”表示;相對保守序列以“”表示;線粒體靶信號以“黑體和下劃線”表示)。
圖1水稻OsCS基因的Southern blot鑒定。其中1-3分別為5μg基因組DNA經(jīng)DraI、HindIII和EcoR I酶切圖片右側(cè)為λ-EcoT14 I digest marker。
圖2OsCS在正常與Al處理下根系與葉片的原位雜交結(jié)果其中A,B,C,D為根,E,F(xiàn),G,H為葉,A,E為Al處理1天,B,F(xiàn)為Al處理3天,C,G為Al處理5天,D,H為對照。
圖3轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS8,CS42,CS50為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草植株。A,特異引物檢測;B,載體引物和特異引物檢測。
圖4轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot鑒定。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS8,CS42,CS50為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草植株。
圖5轉(zhuǎn)基因植株的Western blot鑒定。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS8,CS42,CS50為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草植株。
圖6轉(zhuǎn)基因植株的根長測定。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS8,CS42,CS50為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草植株。Al為0.5mM CaCl2-50μM AlCl3(pH4.5)處理1d測定根長,0.5mM CaCl2(pH4.5)處理的作為對照CK。
圖7轉(zhuǎn)基因植株的高效液相色譜(HPLC)鑒定。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS8,CS42,CS50為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草植株。0.5mM CaCl2-50μM AlCl3(pH4.5)處理1d。
圖8轉(zhuǎn)基因植株的鋁處理生長情況檢測。其中EV30為轉(zhuǎn)空載體的煙草;CS42為正向轉(zhuǎn)入外源OsCS的煙草T1植株。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New YorkCold Spring Harbor Labortary Press,1989)中所敘述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1水稻OsCS基因的克隆1.取溫室(25℃)生長的水稻葉片(兩葉一心期)立即置于液氮中冷凍保存,應(yīng)該注意到本實(shí)驗(yàn)所選取的材料與選用的水稻品種沒有必然的聯(lián)系。
2.DNA的提取取部分組織,用研缽研碎,加入盛有預(yù)熱的裂解液的50ml離心管,65℃保溫40min,離心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml),65℃消化RNA 1h;以等體積的酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽一次蛋白,以乙醇沉淀DNA,70%乙醇洗滌兩遍,最后用TE溶液溶解DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA的質(zhì)量。
3.全長基因的克隆根據(jù)其他植物CS同源序列設(shè)計(jì)簡并引物,采用RT-PCR方法從水稻cDNA中擴(kuò)增出一條1.4kb左右的條帶。將PCR產(chǎn)物回收,連接到T-載體上,用SP6和T7做為通用引物進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫,BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的檸檬酸合酶序列高度保守。
實(shí)施例2水稻OsCS基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的水稻OsCS基因的長度為1425bp,詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1。該基因編碼的多肽由475個(gè)氨基酸殘基組成,分子量52443.55道爾頓,等電點(diǎn)為8.268,詳細(xì)序列見SEQ ID NO.2。
將水稻OsCS全長基因的編碼區(qū)序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDS translations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與胡蘿卜,煙草,甜菜,擬南芥,柑桔的CS存在一定的同源性。在氨基酸水平上,有大于70%的相似性(見表1)。由上可見,該OsCS基因與胡蘿卜,煙草,甜菜,擬南芥,柑桔的CS基因存在較高的同源性,可以認(rèn)為在功能上也有很高的相似性。
BLAST的結(jié)果表明從水稻中得到的基因可能為檸檬酸合酶基因。已知的檸檬酸合酶基因催化TCA循環(huán)中的檸檬酸合成,轉(zhuǎn)入植物中能提高植物檸檬酸的分泌量,同時(shí)提高鋁毒抗性,故推測此基因具有相同的功能。
實(shí)施例3水稻OsCS基因的拷貝數(shù)分析以CTAB方法大量抽提水稻基因組DNA,取10μg DNA分別用DraI、EcoRI和HindIII酶切,以0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行片段分離,將DNA轉(zhuǎn)到Hybond-N+尼龍膜上,固定;以水稻OsCS基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交,鑒定它在水稻中的拷貝數(shù),結(jié)果表明,OsCS基因?yàn)槎嗫截悺?br>
實(shí)施例4水稻OsCS表達(dá)模式分析用原位雜交的方法檢測水稻OsCS時(shí)空表達(dá)模式。鋁處理后,分別取水稻幼苗(二葉一心期)的葉片和根,經(jīng)石蠟切片,雜交,顯色。結(jié)果表明,在正常培養(yǎng)條件下,OsCS在水稻的葉和根中均有表達(dá),葉中的表達(dá)強(qiáng)度比根中的高。Al處理對OsCS的表達(dá)影響,主要表現(xiàn)在根上,隨著處理時(shí)間的延長,OsCS的表達(dá)量有微弱的提高。
實(shí)施例5水稻OsCS基因在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定含目的基因(水稻OsCS基因)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)其它植物CS同源序列設(shè)計(jì)簡并引物,設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物,并在正反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(視選用的載體而定),以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將水稻OsCS基因正向克隆到雙元表達(dá)載體pBI121中,在保證閱讀框架的前提下,將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。利用葉圓盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用滅菌牙簽挑取YEB選擇培養(yǎng)基上的陽性克隆,接種于2mlYEB液體(利福平40mg/L,鏈霉素50mg/L,卡那霉素50mg/L),28℃200rpm振蕩培養(yǎng)24-36h;2.室溫下4000g離心10min;3.棄上清,菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸,稀釋到原體積的5-20倍,使OD600=0.5左右;4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片,去其葉主脈,將其剪成約1平方厘米見方的小葉片;5.將葉片放入制備好的菌液中,浸泡2-5min,在無菌濾紙上吸干菌液;6.將侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上,28℃暗培養(yǎng)48h;7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)上,25-28℃光照下培養(yǎng),7-15天見愈傷組織形成;8.約20天后可見分化芽長出,待芽長大后,切下,置于生根培養(yǎng)基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L);9.待根系發(fā)達(dá)后,將植株取出,用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基,移入土壤中,溫室中培養(yǎng)。
對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定以CTAB方法小量抽提經(jīng)部分轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,以轉(zhuǎn)pBI121空載體的煙草作為負(fù)對照,根據(jù)水稻OsCS基因的特異序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR檢測(部分結(jié)果)。
轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定得到多個(gè)轉(zhuǎn)基因植株,其中有三棵轉(zhuǎn)基因煙草的檸檬酸分泌量比轉(zhuǎn)空載型分別提高了約100%,60%和200%。推測外源OsCS基因在宿主煙草中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá),增加了煙草檸檬酸分泌量。試驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)施例1中得到的水稻OsCS基因?yàn)橛泄δ艿幕?,可以用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻鋁毒抗性的研究和產(chǎn)業(yè)化中。
表1水稻OsCS基因編碼的蛋白質(zhì)序列與胡蘿卜(Daucus carota),煙草(Nicotiana tabacum),甜菜(Beta vulgaris subsp.),擬南芥(Arabidopsis thaliana),柑桔(Citrus junos)氨基酸序列同源性比較Daucus carota MVFF V LL L AVQQSNLSNTVRWFQVQTSASDLDLRSQLKELIPEQQERIKKLK 60Nicotiana tabacum MVFY V LL L AVQQTNLSNSVRWLQVQTSSG-LDLRSELQELIPEQQDRLKKLK 59Beta vulgaris subsp.-------------------------------------SSNLDLRSELQELIPEQQERLKKIK 25Arabidopsis thalianaMVFF V AF L VGQQSSLSNSVRWIQMQ-SSTDLDLKSQLQELIPEOQDRLKKLK 59Citrus junosMAFF V AL L VGQQSNLSNSVRWLQMQ-SSSDLDLHSOLKEMIPE00ERLKKVK 59OsCSMAFF L AV L VAQEATTLGGVRWLQMQ-SASDLDLKSQLQELIPEQQDRLKKLK 59: ***:*:*:*:*****:*:**:*Daucus carota AEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGLSIPECQKLLPGAKPGG 120Nicotiana tabacum SEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPDEGIRFRGLSIYECQKVLPAAKPGG 119Beta vulgaris subsp.KEFGSFQLGNINVDMVLGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGFSIPECQKLLPAASAGA 85Arabidopsis thalianaSEHGKVQLGNITVDMVIGGMRGMTGLLWETSLLDPEEGIRFRGLSIPECQKVLPTAQSGA 119
Citrus junos SELGKAQLGNITVDMVIGGMRGMTGLLWETSLLDPDEGIRFRGLSIPECQKLLPAAKPDG 119OsCS SEHGKVQLGNITVDMVLGGMRGMTGMLWETSLLDPDEGIRFRGLSIPERQKVLPTAVKDG 119* *. *****.****:********:*********:*******:** * **:** * ..
Daucus carotaEPLPEGLLWLLLTGKVPTKEQVDALSAELRSRAAVPEHVYKTIDALPVTAHPMTQFATGV 180Nicotiana tabacumEPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDSLSQELRSRATVPDHVYKTIDALPVTAHPMTQFATGV 179Beta vulgaris subsp. EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDALSADLRKRASIPDHVYKTIDALPITAHPMTQFCTGV 145Arabidopsis thaliana EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVEALSKDLANRAAVPDYVYNAIDALPSTAHPMTQFASGV 179Citrus junos EPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDGLSKELRDRATVPDYVYKAIDALPVTAHPMTQFASGV 179OsCS EPLPEGLLWLLLTGKVPTKEQVDALSKELASRSSVPGHVYEAIDALPVTAHPMTQFTTGV 179*****************:****:.** :* .*:::* :**::***** ******** :**Daucus carotaMALQVQSEFQKA-YEKGIHKTKYWEPTYEDSITLIAQLP-VVAAYIYRRMYKNGQSISTD 238Nicotiana tabacumMALQVQSEFQKA-YEKGIHKSKLWEPTYEDSMSLIAQVP-LVAAYVYRRMYKNGNTIPKD 237Beta vulgaris subsp. MALQTQSEFQKA-YEKGIHKSKFWEPTYEDCLSLIAQVP-VVAAYVYRRMYKNGQVIPLD 203Arabidopsis thaliana MALQVQSEFQKA-YENGIHKSKFWEPTYEDCLNLIARVP-VVAAYVYRRMYKNGDSIPSD 237Citrus junos MALQVQSEFQEA-YEKGIHKSKYWEPTYEDSLNLIARVP-VVAAYVYQRIYKDGKIIPKD 237OsCS MALQVESEFQKSPMTKGMSKSKFWEPTYERLLKFDSSPSSSGLSYVYRRIFKGGKTIAAD 239****..****:: :*: *:* ****** :.: : .:*:*:*::*.*. *. *Daucus carotaDSLDYGANFAHMLGYDSPSMQELMRLYVTIHTDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 298Nicotiana tabacumDSLDYGANFAHMLGFSSSDMHELMKLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 297Beta vulgaris subsp. DSLDYGGNFAHMLGFDSPQMLELMRLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVGSPLSDPYLSFAA 263Arabidopsis thaliana KSLDYGANFSHMLGFDDEKVKELMRLYITIHSDHEGGNVSAHTGHLVGSALSDPYLSFAA 297Citrus junos DSLDYGGNFSHMLGFDDPKMLELMRLYVTIHSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAA 297OsCS NALDYAANFSHMLGFDDPKMLELMRLYITIHTDHEGGNVSAHTGHLVGSALSDPYLSFAA 299.:***..**:****:.. .: ***:**:***:***************.*.**********Daucus carotaALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVSECGENVTKEQLKDYIWKTLNSGKVVPGYGHGVLR 358Nicotiana tabacumALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVEECGENISKEQLKDYAWKTLKSGKVVPGFGHGVLR 357Beta vulgaris subsp. ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVDECGENISTEQLKDYVWKTLNSGKVVPGFGLGVLR 323Arabidopsis thaliana ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVEECGEDISKEQLKEYVWKTLNSGKVIPGYGHGVLR 357Citrus junos ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVVDECGENVTTEQLKDYVWKTLNSGKVVPGFGHGVLR 357OsCS ALNGLAGPLHGLANQEVLLWIKSVIGETGSDVTTDQLKEYVWKTLKGGKVVPGFGHGVLR 359************************: * *.:::.:***:* ****:.***:**:* ****Daucus carotaNTDPRYICQREFALKHLPDDPLFQLVSNLFEVVPPILTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 418
Nicotiana tabacumKTDPRYTCQREFALKHLPEDPLFQLVAKLYEVFLQFLQNLAKLN-PWPNVDAHSGVLLNY 416Beta vulgaris subsp. KTDPRYTCQREFALKHLPDDPFFQLVSKLYEVVPPILLELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 383Arabidopsis thaliana NTDPRYVCQREFALKHLPDDPLFQLVSKLYEVVPPVLTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 417Citrus junos KTDPRYTCQREFALKHLPDDPLFQLVSKLFEVVPPILTKLGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 417OsCS KTDPRYTCQREFALKYLPEDPLFQLVSKLYEVVPPILTELGKVKNPWPNVDAHSGVLLNH 419:***** ********:**:**:****::*:**. .*:*.*:: **************:
Daucus carotaYGLTEARYYTVLFGVSRAIGICSQLVWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKSS--472Nicotiana tabacumYGLTEARYYTVLFGVSRALGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKA---469Beta vulgaris subsp. YGLTEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLEKFCKRRA--437Arabidopsis thaliana YGLTEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLALERPKSVTMDWLEAHCKKASSA 473Citrus junos FGLAEARYYTVLFGVSRSLGICSQLIWDRALGLPLERPKSVTLDWIE--------- 464OsCS FGLSEARYYTVLFGVSRSIGIGSQLIWDRALGLPLERPKSVTMEWLENHCKKVAA-474:**:*************::** ***:*******.********::*:*
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度1425bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈-(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11 ATGGCGTTCTTCAGGGgCCTGACCGCGGTGTCGAGGCTTCGATCCCGCGTGGCACAGGAG61 GCCACCACGCTTGGTGGTGTGCGATGGCTGCAGATGCAGAGCGCATCTGATCTTGATCTC121 AAGTCCCAGCTGCAGGAATTGATTCCTGAACAACAGGACCGCTTAAAGAAACTTAAATCG181 GAGCATGGAAAGGTCCAACTTGGAAATATAACAGTCGATATGGTCCTTGGTGGGATGAGA241 GGGATGACTGGAATGCTTTGGGAAACATCATTGCTTGACCCGGATGAGGGTATTCGTTTT301 AGGGGTCTCTCGATTCCAGAGCGCCAGAAAGTGCTGCCGACAGCAGTTAAAGATGGGGAG361 CCTTTGCCTGAGGGTCTACTTTGGCTTCTTTTGACCGGAAAGGTGCCAACCAAAGAGCAA421 GTTGATGCTCTATCAAAGGAATTGGCTAGTCGTTCGAGTGTTCCAGGTCATGTGTATGAG481 GCAATCGATGCTCTTCCTGTAACTGCTCATCCGATGACCCAGTTTACCACAGGAGTGATG541 GCACTTCAGGTGGAGAGTGAGTTTCAAAAAAGCCCTATGACAAAGGGAATGTCAAAATCA601 AAGTTCTGGGAGCCTACCTATGAAAGATTGCTTAAATTTGATAGCTCGCCTTCCAGCAGT661 GGCCTTTCATATGTTTACCGGAGGATATTCAAGGGAGGGAAAACTATAGCAGCTGATAAT721 GCACTGGATTATGCAGCAAATTTTTCACACATGCTTGGGTTTGATGATCCCAAAATGCTT781 GAGTTGATGCGACTATATATAACAATCCACACTGATCATGAAGGTGGAAACGTCAGTGCT841 CATACTGGACATCTGGTTGGAAGTGCTCTGTCAGACCCTTATCTTTCTTTTGCAGCTGCA901 CTGAATGGTTTAGCTGGACCGTTGCACGGCCTGGCTAATCAGGAAGTGTTGTTGTGGATC961 AAATCTGTAATAGGTGAGACTGGTAGTGACGTTACAACTGATCAACTCAAAGAGTATGTG1021 TGGAAGACACTAAAAGGTGGAAAGGTTGTTCCTGGCTTTGGTCATGGAGTTCTACGTAAG1081 ACCGATCCACGGTATACATGTCAGAGGGAGTTTGCTTTGAAGTACTTGCCTGAGGATCCA1141 CTTTTCCAACTGGTCTCCAAGTTGTATGAAGTTGTGCCTCCTATCCTCACTGAGCTTGGC1201 AAGGTCAAAAACCCATGGCCTAATGTTGATGCTCACAGCGGAGTTCTACTGAACCACTTT1261 GGATTATCTGAAGCTCGGTATTACACTGTTCTTTTCGGAGTTTCAAGGAGCATTGGAATA1321 GGATCTCAGCTCATTTGGGACCGTGCTCTTGGCCTGCCGCTCGAAAGACCGAAGAGTGTC1381 ACCATGGAGTGGCTGGAGAACCACTGCAAGAAGGTTGCTGCTTGA
(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度474氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 MAFFRGLTAV SRLRSRVAQE ATTLGGVRWL QMQSASDLDL KSQLQELIPE51 QQDRLKKLKS EHGKVQLGNI TVDMVLGGMR GMTGMLWETS LLDPDEGIRF101 RGLSIPERQK VLPTAVKDGE PLPEGLLWLL LTGKVPTKEQ VDALSKELAS151 RSSVPGHVYE AIDALPVTAH PMTQFTTGVM ALQVESEFQK SPMTKGMSKS201 KFWEPTYERL LKFDSSPSSS GLSYVYRRIF KGGKTIAADN ALDYAANFSH251 MLGFDDPKML ELMRLYITIH TDHEGGNVSA HTGHLVGSAL SDPYLSFAAA301 LNGLAGPLHG LANQEVLLWI KSVIGETGSD VTTDQLKEYV WKTLKGGKVV351 PGFGHGVLRK TDPRYTCQRE FALKYLPEDP LFQLVSKLYE VVPPILTELG401 KVKNPWPNVD AHSGVLLNHF GLSEARYYTV LFGVSRSIGI GSQLIWDRAL451 GLPLERPKSV TMEWLENHCK KVAA
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼具有水稻檸檬酸合酶活性的開放讀框,其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子,其特征在于,該序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一種將如權(quán)利要求1所述的編碼具有水稻檸檬酸合酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)入煙草以提高檸檬酸分泌量的方法,其特征在于具體步驟如下(1)將編碼具有水稻檸檬酸合酶的核苷酸序列可操作的連接于植物表達(dá)載體,形成含有SEQ ID NO.1的載體;(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌,將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同煙草葉片共培養(yǎng),在25±2℃條件下,暗培養(yǎng)2天;(3)通過抗生素篩選,PCR鑒定,獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)基因植物的檸檬酸分泌量增加。
4.一種用于檢測樣品中水稻檸檬酸合酶拷貝數(shù)的方法,其特征在于它包括用權(quán)利要求1中所述序列與樣品雜交,然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合;該樣品是水稻和轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸序列。
5.用于鑒定轉(zhuǎn)基因煙草的核酸分子,其特征在于,它包含SEQ ID NO.1所示的DNA分子中893-910個(gè)連續(xù)的核苷酸和1405-1425個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
6.一種用于檢測樣品中是否存在水稻檸檬酸合酶核苷酸序列的方法,其特征在于它包括用權(quán)利要求5所述核苷酸序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng),然后檢測是否擴(kuò)增出目的片段;樣品為轉(zhuǎn)基因煙草組DNA。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種在水稻中表達(dá)的檸檬酸合酶的編碼序列及其在提高植物檸檬酸分泌的應(yīng)用,進(jìn)而預(yù)期能相應(yīng)的提高植物的鋁毒抗性。本發(fā)明涉及包含上述基因的重組表達(dá)載體,還涉及所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞,以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明將所說基因在植物中表達(dá),所獲得的轉(zhuǎn)基因植物檸檬酸分泌量顯著增高,對鋁毒的抗性也有相應(yīng)的增強(qiáng)。
文檔編號C12N9/00GK101058816SQ200710039409
公開日2007年10月24日 申請日期2007年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月12日
發(fā)明者明鳳, 張珊珊, 沈大棱 申請人:復(fù)旦大學(xué)