專(zhuān)利名稱(chēng)：：誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的系統(tǒng)及誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更特別的，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法以及通過(guò)所述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：小鼠的早期胚胎發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。在妊娠早期(E2.5-E4.5)，小鼠胚胎由滋養(yǎng)外胚層(Trophectoderra)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellniass，ICM)組成。伴隨著發(fā)育的進(jìn)行，ICM細(xì)胞經(jīng)過(guò)重組，形成了另一群多潛能的上皮樣細(xì)胞，即上胚層(Epiblast)(E4.5-E6.5)。上胚層的細(xì)胞經(jīng)過(guò)原腸運(yùn)動(dòng)形成小鼠胚胎的三個(gè)胚層(E6.5-E7.5)，即外胚層(Ectoderm),中胚層(Mesoderm)和內(nèi)胚層(Endoderm)。隨后胚胎發(fā)育進(jìn)入器官形成期(organogenesisstage)(E7.5-E12.5)。這一時(shí)期中，最早開(kāi)始發(fā)育的是神經(jīng)系統(tǒng)，前方外胚層衍生出神經(jīng)板(neuralplate)結(jié)構(gòu)，神經(jīng)板再演化為神經(jīng)管(neuraltube),最后形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括腦和脊椎。神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育幵始之后，整個(gè)胚胎的軀體規(guī)劃己經(jīng)成型，可以看出頭尾。與此同時(shí)心臟和循環(huán)系統(tǒng)也開(kāi)始發(fā)育，隨之而來(lái)的是身體其他內(nèi)臟器官的發(fā)育。原腸運(yùn)動(dòng)對(duì)整個(gè)生命是如此重要，但由于技術(shù)手段的局限性，人們卻對(duì)它所知甚少。就發(fā)育時(shí)間而言，上胚層在原腸運(yùn)動(dòng)前形成，可以直接響應(yīng)來(lái)自原腸運(yùn)動(dòng)的信號(hào)。因此要研究胚胎著床后的發(fā)育事件，上胚層會(huì)是非常合適的選擇。早期的小鼠胚胎非常難以獲得，要利用早期胚胎進(jìn)行分子機(jī)制的研究一直舉步維艱。來(lái)源于小鼠早期胚胎發(fā)育不同階段的多潛能干細(xì)胞可作為研究體內(nèi)早期發(fā)育的細(xì)胞模型。這些體外培養(yǎng)的干細(xì)胞具有與體內(nèi)相應(yīng)發(fā)育階段的細(xì)胞類(lèi)似的特征，而且就形態(tài)和分子標(biāo)記的表達(dá)順序而言，干細(xì)胞形成的胚胎樣小體的發(fā)育過(guò)程與早期胚胎的發(fā)育過(guò)程非常類(lèi)似，因此常被用于研究早期胚胎發(fā)生中重要事件的分子機(jī)制。ES細(xì)胞來(lái)源于E3.5天左右的ICM，具有ICM特征性的FGF4+FGF5-的表達(dá)模式，以及與ICM相同的分化潛能，可以分化成完整的小鼠胚胎。人們較感興趣的是多潛能細(xì)胞如何作為研究早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的模型。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期，形成神經(jīng)外胚層的細(xì)胞大多形成柱狀上皮形狀(神經(jīng)上皮)并迅速增殖。稍后，這些細(xì)胞停止分裂并分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。這些神經(jīng)上皮前體細(xì)胞的增殖及分化可以用神經(jīng)上皮組織的原代培養(yǎng)進(jìn)行有效的研究，但是想研究早期神經(jīng)外胚層的發(fā)育就無(wú)計(jì)可施了。因此，用早期多潛能細(xì)胞建立體外分化成神經(jīng)外胚層細(xì)胞的系統(tǒng)來(lái)研究胚胎發(fā)育早期的分子事件就成為極其有效的手段。經(jīng)過(guò)過(guò)去數(shù)十年的努力，現(xiàn)在已有幾套比較成熟的方法從ES細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)體外神經(jīng)外胚層，包括l)用RA誘導(dǎo)經(jīng)血清刺激的胚胎樣小體(EBs);2)在添加特定化學(xué)分子的無(wú)血清培液中培養(yǎng)胚胎樣小體；3)ES在基質(zhì)細(xì)胞表面無(wú)血清培養(yǎng)分化；4)條件性培養(yǎng)液培養(yǎng)分化；5)無(wú)血清培液中ES細(xì)胞貼壁分化。不過(guò)，這些方法各有不足之處。比如，有些方法需要在體外培養(yǎng)很長(zhǎng)時(shí)間，在如此長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間里研究機(jī)制是比較困難的；有的需要與一些成分不確定的條件性培養(yǎng)液或者活性不明的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，這樣不利于明確分析神經(jīng)誘導(dǎo)活性成分。在多數(shù)培養(yǎng)條件下，并不能得到高比例的神經(jīng)干細(xì)胞，除非用特定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性培液來(lái)進(jìn)行篩選。并且，這些方法得到的神經(jīng)干細(xì)胞多數(shù)不具有特定的位置信息，這一點(diǎn)與體內(nèi)情況是不一致的，因?yàn)轶w內(nèi)神經(jīng)外胚層細(xì)胞在形成初期是帶有前端特性的(anteriorcharacter)。此外，ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)并不能很好的模擬體內(nèi)誘導(dǎo)的過(guò)程。在體內(nèi)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)必須重排組合形成上胚層后才會(huì)起始原腸運(yùn)動(dòng)，而神經(jīng)誘導(dǎo)通常認(rèn)為在原腸運(yùn)動(dòng)早期發(fā)生。ES的神經(jīng)誘導(dǎo)包含了從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到上胚層再到神經(jīng)外胚層這樣兩個(gè)轉(zhuǎn)換過(guò)程，那些對(duì)上胚層形成起作用的信號(hào)可能會(huì)干擾對(duì)神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程的研究。因此，建立一套從上胚層類(lèi)似的細(xì)胞快速誘導(dǎo)高比例的，具有前端特性的神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)，來(lái)研究從上胚層到神經(jīng)外胚層的神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程還是很有必要的。小鼠胚胎性癌細(xì)胞P19在發(fā)育時(shí)期上類(lèi)似于上胚層細(xì)胞，它們的細(xì)胞表面抗原表達(dá)模式和蛋白合成模式也和上胚層細(xì)胞同源，因此被廣泛應(yīng)用于研究胚胎發(fā)育原腸期的事件?，F(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)以P19細(xì)胞作為體外研究模型，在研究早期神經(jīng)分化和肌肉分化的機(jī)制方面得到了長(zhǎng)足的進(jìn)展。在10—6M視磺酸(RA)的誘導(dǎo)下，P19細(xì)胞經(jīng)過(guò)成團(tuán)過(guò)程(aggregation)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。此方法被廣泛應(yīng)用于研究早期神經(jīng)誘導(dǎo)分化過(guò)程中的分子機(jī)制。不過(guò)，這個(gè)方法有幾個(gè)缺點(diǎn)。首先，RA誘導(dǎo)的P19胚胎樣小體是一個(gè)比較雜的群體，其中只有較低比例的神經(jīng)干細(xì)胞，其它都是雜細(xì)胞，這會(huì)嚴(yán)重干擾對(duì)神經(jīng)分化機(jī)制的研究；其次，在胚胎發(fā)育早期抑制體內(nèi)RA信號(hào)通路并不影響神經(jīng)板/神經(jīng)管的形成，這就提示在體內(nèi)RA信號(hào)并不參與神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程，因此，用RA誘導(dǎo)P19神經(jīng)分化的系統(tǒng)來(lái)研究分子機(jī)制并不能很好的模擬體內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生過(guò)程；再次，RA在體內(nèi)的作用主要在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)前后軸模式的形成。它能把前端的神經(jīng)組織后方化，并且阻礙前端神經(jīng)組織的形成。在體外用RA處理ES細(xì)胞形成的胚胎樣小體同樣會(huì)影響誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的位置特性。并且經(jīng)RA誘導(dǎo)形成的神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育潛能上有限制，只能形成有限的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型。因此，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，從而有利于分析從上胚層細(xì)胞到神經(jīng)外胚層的神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)分化過(guò)程，為研究胚胎著床后的發(fā)育事件提供更理想的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)P19胚胎性癌細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過(guò)所述的方法制備獲得的細(xì)胞群，所述細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%。在本發(fā)明的第一方面，提供一種促進(jìn)P19胚胎性癌細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而使P19胚胎性癌細(xì)胞形成神經(jīng)干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中基本上不含有視黃酸(RA)和血清。優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基中視黃酸的含量低于0.01pM;更優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基中視黃酸的含量低于0.005pM;最優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基中視黃酸的含量低于0.001(iM。在另一優(yōu)選例中，所述的N2B27培養(yǎng)基中血清的含量低于l。/。(v/v)。更優(yōu)選的，所述的N2B27培養(yǎng)基中血清的含量低于0.5。/。(Wv);最優(yōu)選的，所述的N2B27培養(yǎng)基中血清的含量低于O.l%(v/v)。在另一優(yōu)選例中，所述的N2B27培養(yǎng)基含有(a)加入了Ins、TF、Pro、Put、Sel和BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基；禾口(b)加入了B27的Neurobasal培養(yǎng)基；其中，(a)與(b)以(1-2):(1-2)的比例混合。更優(yōu)選的，(a)與(b)以1:1混合。在另一優(yōu)選例中，在(a)中，Ins的終濃度為15-35yg/ml;TF的終濃度為80-120iig/ml、Pro的終濃度為4-8nM、Put的終濃度為12-20uM、Sel的終濃度為20-40nM;或BSA的終濃度為35-75ug/ml。更優(yōu)選的，Ins的終濃度為20-30ug/ml;TF的終濃度為90-110ug/ml、Pro的終濃度為5-7nM、Put的終濃度為14-18uM、Sel的終濃度為25-35nM;或BSA的終濃度為40-70Pg/ml。在另一優(yōu)選例中，在(b)中，B27在Neurobasa培養(yǎng)基中的終濃度為l-3。/。(v/v);更優(yōu)選的，為1.5-2.5%(v/v)。在另一優(yōu)選例中，將P19胚胎性癌細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)(即采用成團(tuán)誘導(dǎo)的方式)。在另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96士10小時(shí)。優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96土6小時(shí)；更優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96土3小時(shí)；最優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96士1小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)條件是37土3X:，5±1%C02。更優(yōu)選的，培養(yǎng)條件是37士rC，5±0.5%CO2。在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而獲得所述的細(xì)胞群。優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的85-100%;更優(yōu)選的，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的90-100%。在另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96土10小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，將P19胚胎性癌細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述的N2B27培養(yǎng)基中基本上不含有視黃酸(RA)和血清。在另一優(yōu)選例中，還包括從富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群中分離所述的神經(jīng)干細(xì)胞。在本發(fā)明的第三方面，提供一種通過(guò)所述的方法制備獲得的富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)P19胚胎性癌細(xì)胞直接從多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變到神經(jīng)干細(xì)胞而獲得，不是通過(guò)選擇性篩選(即通過(guò)選擇性篩選使非神經(jīng)細(xì)胞凋亡)而獲得。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Sox，不表達(dá)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Oct。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞是具有前端神經(jīng)外胚層特性的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞可用于作為神經(jīng)誘導(dǎo)模型，模擬體內(nèi)從上胚層細(xì)胞到神經(jīng)外胚層的分化過(guò)程，從而用于研究該分化過(guò)程的分化機(jī)制。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記Nestin、RC2、3CB2、Vimentin、Pax6。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記Soxl、Sox2、Sox3，低表達(dá)中胚層的分子標(biāo)記Brachyury、Goosecoid，低表達(dá)內(nèi)胚層的分子標(biāo)記HNF3、GATA6。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)前端神經(jīng)外胚層分子標(biāo)記Otx2、Hesxl、Six3，不表達(dá)后方神經(jīng)外胚層分子標(biāo)記Gbx2，后腦和脊髓分子標(biāo)記Hoxb4,脊髓分子標(biāo)記Hoxb9。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化的全能性，可分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元可表達(dá)膽堿能神經(jīng)元的分子標(biāo)記ChAT，GABA能神經(jīng)元分子標(biāo)記GAD67，谷氨酸能神經(jīng)元分子標(biāo)記VGLUT1，多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)記TH，5-羥色氨能神經(jīng)元分子標(biāo)記TPH1，1TH2。在本發(fā)明的第四方面，提供一種N2B27培養(yǎng)基的用途，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞使之形成神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1A顯示了RT-PCR檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和上胚層的分子標(biāo)記在ES細(xì)胞和P19細(xì)胞的表達(dá)情況的結(jié)果。以e-actin(RT+)(即模板為經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄的RNA)作為內(nèi)標(biāo)；actin(RT—)(即模板為未經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA)用來(lái)證明RNA沒(méi)有被基因組DNA污染。圖1B顯示了免疫染色檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和上胚層的分子標(biāo)記FGF4和FGF5在ES細(xì)胞和P19細(xì)胞的表達(dá)情況的結(jié)果(a-d);以及分子標(biāo)記Gbx2的原位雜交結(jié)果(e，f)。圖2A顯示了N2B27誘導(dǎo)的P19細(xì)胞的體外分化的基本步驟。圖2B顯示了免疫染色檢測(cè)P19細(xì)胞(P19EC)、誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞(P19Agg4d)、誘導(dǎo)4天且用RA處理的P19細(xì)胞(P19RA/Agg4d)、用N2B27無(wú)血清培液誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞(P19NB/Agg4d)表達(dá)0ct4、Sox的情況。圖2C顯示了P19細(xì)胞(P19EC)、誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞(P19Agg4d)、誘導(dǎo)4天且用RA處理的P19細(xì)胞(P1服A/Agg4d)、用N2B27無(wú)血清培液誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞(P19NB/Agg4d)表達(dá)0ct4—Sox+的情況的免疫染色計(jì)數(shù)。圖2D顯示了對(duì)N2B27誘導(dǎo)1到4天的細(xì)胞進(jìn)行染色分析并計(jì)數(shù)，確定0"4+Sox+和0ct4—Sox+的細(xì)胞比例。圖3A顯示了免疫染色檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記(即Nestin，RC2，3CB2，Viraentin，Pax6)的表達(dá)情況。圖3B顯示了對(duì)N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行染色分析并計(jì)數(shù)，確定表達(dá)Nestin，RC2，3CB2，Vimentin，Pax6的細(xì)胞比例。圖3C顯示了RT-PCR檢測(cè)RA誘導(dǎo)1-4天和N2B27誘導(dǎo)1-4天的P19細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)外胚層(Soxl，2，3)、中胚層(Brachyury，Goosecoid)、內(nèi)胚層(HNF3P，GATA6)分子標(biāo)記的情況。以p-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖3D顯示了FACS檢測(cè)未處理的P19細(xì)胞、RA誘導(dǎo)1-4天和N2B27誘導(dǎo)1-4天過(guò)程中細(xì)胞凋亡情況。圖3E顯示了T麗EL染色檢測(cè)未處理的(Agg4d)、RA處理的(RA/Agg4d)和N2B27處理的(NB/Agg4d)P19細(xì)胞的凋亡情況。圖4A顯示了RT-PCR檢測(cè)P19EC細(xì)胞、RA處理4天(RA4d)、N2B27處理4天(NB4d)、N2B27處理6天(NB6d)、N2B27處理8天(NB8d)、N2B27處理2天且RA處理2天(NB2dRA2d)、N2B27處理4天且RA處理2天(NB4dRA2d)、N2B27處理4天且RA處理4天(NB4dRA4d)的P19細(xì)胞表達(dá)前端神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記0tx2和Hesxl，前腦特異表達(dá)的同源盒基因Six3，中后腦界限處的分子標(biāo)記Gbx2，后腦和脊髓的分子標(biāo)記Hoxb4，脊髓的分子標(biāo)記Hoxb9的情況。以3-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖4B顯示了免疫染色檢測(cè)N2B27處理4天(NB4d)，N2B27處理8天(NB8d)，N2B27處理4天且RA處理4天(NB4dRA4d)的P19細(xì)胞表達(dá)Hoxb4情況。圖4C顯示了對(duì)N2B27處理4天(NB4d)，N2B27處理8天(NB8d)，N2B27處理4天且RA處理4天(NB4dRA4d)的P19細(xì)胞進(jìn)行染色分析并計(jì)數(shù)，確定表達(dá)Hoxb4的細(xì)胞比例。圖5A顯示了免疫染色檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)在細(xì)胞分化后表達(dá)分子標(biāo)記Tujl、MAP2、GFAP、04的情況。Rld表示重鋪板(r印lating)第l天，R10d表示重鋪板(r印latirig)第10天。圖5B顯示了對(duì)N2B27處理后重鋪板0-7天(R0-R7)的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定各個(gè)時(shí)間段表達(dá)Tujl和MAP2的細(xì)胞比例。圖5C顯示了RT-PCR檢測(cè)未經(jīng)處理的P19細(xì)胞、N2B27處理后重鋪板5、9、11天(R5d、R9d、Rlld)，RA處理后重鋪板11天(RA/R11)的P19細(xì)胞表達(dá)膽堿能神經(jīng)元的分子標(biāo)記ChAT、GABA，谷氨酸能神經(jīng)元分子標(biāo)記VGLUT1，多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)記TH，5-羥色氨能神經(jīng)元分子標(biāo)記TPH1，TPH2的情況。以P-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖5D顯示了FACS檢測(cè)未處理的P19細(xì)胞、RA誘導(dǎo)后重鋪板1-4天和N2B27誘導(dǎo)后重鋪板1-4天過(guò)程中細(xì)胞凋亡情況。圖5E顯示了免疫染色檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)GAD65和VGLUT1的情況。圖5F顯示了對(duì)N2B27誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定表達(dá)GAD65和VGLUT1的細(xì)胞比例。圖6A顯示了免疫染色檢測(cè)P19EC細(xì)胞、未經(jīng)處理且成團(tuán)培養(yǎng)4天(P19Agg4d)，RA處理4天(P19RA/Agg4d)、N2B27處理4天(R19NB/Agg4d)、N2B27和RA共處理4天(P19NBRA/Agg4d)的P19細(xì)胞表達(dá)Tujl的情況。圖6B顯示了對(duì)P19EC細(xì)胞、未經(jīng)處理且成團(tuán)培養(yǎng)4天(Agg4d)，RA處理4天(RA/Agg4d)、N2B27處理4天(NB/Agg4d)、N2B27和RA共處理4天(NBRA/Agg4d)的P19細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定Tujl+和0ct4—Sox+的細(xì)胞比例。圖6C顯示了RT-PCR檢測(cè)N2B27處理4天(NB4d)，RA處理4天(RA4d)，N2B27和RA共處理4天(NBRA4d)的P19細(xì)胞的中胚層和內(nèi)胚層分子標(biāo)記(Brachyury、Goosecold、HNF30和GATA6)的表達(dá)情況。以3-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖6D顯示了RT-PCR檢測(cè)N2B27處理4天(NB4d)，N2B27和RA共處理4天(NBRA4d)的P19細(xì)胞的0tx2、Hesxl、Six3、Gbx2、Hoxb4、Hoxb9的表達(dá)情況。以P-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖7A顯示了RT-PCR檢測(cè)RA處理(RA/Agg)1-4天和N2B27處理(NB/Agg)1-4天的P19細(xì)胞表達(dá)BMP2、BMP4、BMP7、Noggin、Chordin、Follistatin的情況。以e-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖7B顯示了熒光素酶法檢測(cè)P19細(xì)胞成團(tuán)培養(yǎng)1-4天，RA處理1-4天(RA/Agg)，N2B27處理1-4天(NB/Agg)，N2B27和RA共處理1-4天(NBRA/Agg)的P19細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因活性。—圖7C顯示了未處理的P19細(xì)胞，N2B27誘導(dǎo)且加入BMP或者同時(shí)加入BMP和Noggin后P19細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因活性。圖7D顯示了對(duì)N2B27處理4天且不加入BMP和Noggin、加入BMP或同時(shí)加入BMP和Noggin的P19細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定0ct4+Sox+和0ct4—Sox+的細(xì)胞比例。圖8A顯示了RT-PCR檢測(cè)未處理的P19細(xì)胞，RA處理1-4天(RA/Agg)，N2B27處理1-4天(NB/Agg)的P19細(xì)胞表達(dá)FGFl、FGF2、FGF4、FGF5、FGF8的情況。以P-actin(RT+)作為內(nèi)標(biāo)。圖8B顯示了對(duì)N2B27處理4天且不加入SU5402和Noggin、加入SU5402、同時(shí)加入SU5402和Noggin的P19細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定0ct4+Sox+和0ct4—Sox+的細(xì)胞比例。圖8C顯示了未處理的P19細(xì)胞，N2B27誘導(dǎo)且加入SU5402或者同時(shí)加入SU5402和Noggin后P19細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因活性。圖8D顯示了對(duì)N2B27處理4天(NB4d)，N2B27和SU5402共處理4天(NBSU54024d)，N2B27和U0126共處理4天(NBU01264d)，N2B27和Wortmannin共處理4天(NBWort,nin4d)，N2B27和U73122共處理4天(NBU731224d)的P19細(xì)胞進(jìn)行免疫染色計(jì)數(shù)分析，確定0ct4+Sox+和0ct4—Sox+的細(xì)胞比例。圖8E-G顯示了WesternBlot檢測(cè)未經(jīng)處理的P19細(xì)胞(P19N)，N2B27處理30分鐘(P19NB30，)，N2B27處理l小時(shí)(P19NBlhr)，N2B27和U0126共處理30分鐘(P19NBU012630，)，N2B27和FGF共處理10分鐘(P19NBFGF10，)，N2B27和U0126和FGF共處理10分鐘(P19NBFGFU012610，)的P19細(xì)胞，MAPK/ERK(E)，PI3K/Akt(F)，和PLC-y(G)信號(hào)途徑的活化情況。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，采用N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，可獲得含有高比例神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群，所述的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端神經(jīng)外胚層特性及分化全能性。并且，N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)并不伴隨著中胚層和內(nèi)胚層的誘導(dǎo)，不是通過(guò)非神經(jīng)細(xì)胞的選擇性凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。P19胚胎性癌細(xì)胞如本文所用，所述的P19胚胎性癌細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)為P19細(xì)胞，或P19EC細(xì)胞，其來(lái)源于上胚層細(xì)胞形成的畸胎瘤。所述的P19胚胎性癌細(xì)胞是將上胚層來(lái)源的細(xì)胞植入成年小鼠的睪丸形成畸胎瘤，進(jìn)而分離出的細(xì)胞系，是具有發(fā)育全能性的干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)劑作用下可以分化出三個(gè)胚層來(lái)源的所有細(xì)胞，只是不能整合至生殖嵴并發(fā)育為有功能的生殖細(xì)胞。雙向電泳實(shí)驗(yàn)也表明，P19EC細(xì)胞的表面抗原表達(dá)模式和蛋白合成模式與E5.5天的上胚層同源，因此P19細(xì)胞在發(fā)育階段上與上胚層類(lèi)似。在本發(fā)明中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的P19細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)P19細(xì)胞，并使之傳代。促進(jìn)P19胚胎性癌細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種促進(jìn)P19胚胎性癌細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而誘導(dǎo)P19胚胎性癌細(xì)胞形成神經(jīng)干細(xì)胞。在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中基本上不含有視黃酸(RA)和血清。如本文所用，所述的"基本上不含有視黃酸"是指所述的培養(yǎng)基中視黃酸的含量低于0.01pM;更優(yōu)選的，視黃酸的含量低于0.005[iM;最優(yōu)選的，視黃酸的含量低于0.001jaM。所述的"基本上不含有血清"是指所述的N2B27培養(yǎng)基中血清的含量低于1。/。(V/V);更優(yōu)選的，血清的含量低于0.5。/。(Wv);最優(yōu)選的，血清的含量低于o.iy。(v/v)。由于(1)RA只能誘導(dǎo)低比例的神經(jīng)干細(xì)胞，并且在誘導(dǎo)同時(shí)就將其后方化，與體內(nèi)的神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程不一致，(2)RA在體內(nèi)并不行使神經(jīng)誘導(dǎo)的功能，因此，RA誘導(dǎo)的神經(jīng)分化不是很好的研究早期胚胎神經(jīng)分化的模型。本發(fā)明人在對(duì)P19細(xì)胞的培養(yǎng)中不加入RA，不加入血清，利用N2B27誘導(dǎo)出高比例的具備前端特性的神經(jīng)干細(xì)胞群體。這些神經(jīng)干細(xì)胞具有分化多潛能性，在體外能分化出高比例的神經(jīng)元，同時(shí)也能分化出星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；并且，它們能被后方化因子RA有效后方化。通常，本領(lǐng)域人員采用貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)等方法來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，采用懸浮培養(yǎng)的方式來(lái)培養(yǎng)P19細(xì)胞，有利于P19細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)液中良好地形成胚胎樣細(xì)胞團(tuán)。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將P19胚胎性癌細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。由于在培養(yǎng)P19細(xì)胞的過(guò)程中，P19細(xì)胞處于不斷的生長(zhǎng)和分化中，因此，在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，需要控制時(shí)間以獲得最高比例的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，利用N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)96士10小時(shí)，可獲得較高比例的神經(jīng)干細(xì)胞；而當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)以?xún)?nèi)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)干細(xì)胞的比例很低(低于20%)，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)106小時(shí)后，N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞開(kāi)始分化出神經(jīng)元，不再是神經(jīng)干細(xì)胞了。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，利用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96土10小時(shí)；更優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96±6小時(shí)；進(jìn)一步優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96士3小時(shí)；最優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96土1小時(shí)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，細(xì)胞培養(yǎng)的條件是37土3。C，5±1%C02。更優(yōu)選的，培養(yǎng)條件是37士rC，5±0.5%CO2。培養(yǎng)基1.N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基以往，N2B27培養(yǎng)基通常被用于培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞以及誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)方向分化。然而，在ES細(xì)胞培養(yǎng)中采用貼壁誘導(dǎo)且方法復(fù)雜。通常人們認(rèn)為N2B27適合于培養(yǎng)已經(jīng)分化的神經(jīng)細(xì)胞，然而還沒(méi)有將之用于培養(yǎng)P19細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的報(bào)道。如本發(fā)明所用，所述的N2B27培養(yǎng)基含有(a)加入了牛胰島素(Ins)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、孕酮(Pro)、尸胺(Put)、硒酸鈉(Sel)和牛血清白蛋白(BSA)的DMEM/F12培養(yǎng)基；和(b)加入了B27(基本上不含維生素A)的Neurobasal培養(yǎng)基；其中，(a)與(b)以(1-2):(1-2)的比例混合(更優(yōu)選的，(a)與(b)以1:1混合)。作為優(yōu)選的方式，在(a)中，Ins的終濃度為15-35ug/ml;TF的終濃度為80-120ug/ml、Pro的終濃度為4-8nM、Put的終濃度為12-20uM、Sel的終濃度為20-40nM;或BSA的終濃度為35-75ixg/ml。更優(yōu)選的，Ins的終濃度為20-30"g/ml;TF的終濃度為90-110wg/ml、Pro的終濃度為5-7nM、Put的終濃度為14-18yM、Sd的終濃度為25-35nM;或BSA的終濃度為40-70yg/ml。作為優(yōu)選的方式，在(b)中，B27在Neurobasal培養(yǎng)基中的終濃度為l-3。/。(v/v);更優(yōu)選的，為1.5-2.5。/。(v/v)。2.分化培養(yǎng)基在本發(fā)明中，對(duì)用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞使之分化的培養(yǎng)基沒(méi)有特別的限制，通常根據(jù)所需獲得的神經(jīng)細(xì)胞的種類(lèi)的不同而不同。例如，可在分化培養(yǎng)基中加入血清來(lái)使神經(jīng)干細(xì)胞盡可能多地分化為膠質(zhì)細(xì)胞；或者，利用無(wú)血清的分化培養(yǎng)基來(lái)使神經(jīng)干細(xì)胞盡可能多地分化為神經(jīng)元。作為本發(fā)明的一種方式，采用N2培養(yǎng)基作為神經(jīng)干細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基質(zhì)中不含有血清。作為本發(fā)明的實(shí)例，所述的N2培養(yǎng)基含有加入了Ins、TF、Pro、Put和Sel的DMEM/F12培養(yǎng)基。優(yōu)選的，在N2培養(yǎng)基中，Ins的終濃度為3-7ug/ml;TF的終濃度為30-70ug/ml、Pro的終濃度為15-25nM、Put的終濃度為45-75iiM、Se的終濃度為20-40nM。更優(yōu)選的，在含有N2的培養(yǎng)基質(zhì)中，Ins的終濃度為4-6ng/ml;TF的終濃度為40-60Ug/ml、Pro的終濃度為18-22nM、Put的終濃度為55-65yM、Sel的終濃度為25-35nM。富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群本發(fā)明還提供了一種制備富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%(優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的85-100%;更優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的90-100%)，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而獲得所述的細(xì)胞群。所述的N2B27培養(yǎng)基中基本上不含有視黃酸(RA)和血清。本發(fā)明還提供了通過(guò)所述的方法制備獲得的富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%。經(jīng)過(guò)本發(fā)明人的驗(yàn)證，在N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)4天左右后，所獲得的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Sox，不表達(dá)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Oct。并且，本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記Nestin、RC2、3CB2、Vimentin、Pax6。并且，本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)前端神經(jīng)外胚層分子標(biāo)記Otx2、Hesxl、Six3，不表達(dá)后方神經(jīng)外胚層分子標(biāo)記Gbx2，后腦和脊髓分子標(biāo)記Hoxb4，脊髓分子標(biāo)記Hoxb9。因此，所述的神經(jīng)干細(xì)胞是具有前端神經(jīng)外胚層特性的細(xì)胞。并且，本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化的全能性，可分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。并且，本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記Soxl、Sox2、Sox3，低表達(dá)中胚層的分子標(biāo)記Brachyury、Goosecoid，低表達(dá)內(nèi)胚層的分子標(biāo)記HNF3、GATA6。并且，本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元可表達(dá)膽堿能神經(jīng)元的分子標(biāo)記ChAT，GABA能神經(jīng)元分子標(biāo)記GAD67，谷氨酸能神經(jīng)元分子標(biāo)記VGLUT1，多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)記TH，5-羥色氨能神經(jīng)元分子標(biāo)記TPH1，TPH2。作為本發(fā)明的一種方式，還可以從富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群中分離所述的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明對(duì)分離神經(jīng)干細(xì)胞的方法沒(méi)有特別的限制，可采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法。所述的富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群或分離的神經(jīng)干細(xì)胞可用于作為神經(jīng)誘導(dǎo)模型，模擬體內(nèi)從上胚層細(xì)胞到神經(jīng)外胚層的分化過(guò)程，從而用于研究該分化過(guò)程的分化機(jī)制。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明首次揭示了采用N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，可獲得含有高比例神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的神經(jīng)千細(xì)胞具有前端神經(jīng)外胚層特性以及分化全能性。本發(fā)明的培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的方法比之傳統(tǒng)的RA誘導(dǎo)方法的優(yōu)勢(shì)在于(a)在無(wú)血清的環(huán)境中培養(yǎng)，排除了成分復(fù)雜的血清的干擾；(b)不需要RA的參與，避免獲得的神經(jīng)干細(xì)胞被RA后方化；(。能夠得到高比例(94%以上)的神經(jīng)干細(xì)胞。(2)采用本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端神經(jīng)板特性，可很好地模擬體內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生過(guò)程，因此其可以作為研究模型，用于分析從上胚層細(xì)胞到神經(jīng)外胚層的神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)分化過(guò)程，為研究胚胎著床后的發(fā)育事件提供了更理想的途徑。(3)本發(fā)明方法條件易于控制、操作簡(jiǎn)單、成本低廉。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。I.材料與方法細(xì)胞P19C6細(xì)胞(購(gòu)自日本理化學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))。細(xì)胞培養(yǎng)DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，多聚賴(lài)氨酸(PLL)，牛胰島素(Ins)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)，尸胺(Put)，孕酮(Pro),硒酸鈉(Sel)，全反式視磺酸(RA)，多聚甲醛，DMS0。以上試劑為Sigma公司產(chǎn)品。MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(MinimalEssentialMediumAlphaMedium),NeuralBasal細(xì)胞培養(yǎng)基，B27(不含維生素A)，胰蛋白酶-EDTA，纖粘蛋白，牛血清白蛋白(BSA)。以上試劑為Gibco公司產(chǎn)品。月臺(tái)牛血清(Fetalbovineserum，F(xiàn)BS，Hyclone)。分子標(biāo)記及其檢測(cè)抗體見(jiàn)表1;用于檢測(cè)分子標(biāo)記的引物見(jiàn)表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>P19細(xì)胞的傳代培養(yǎng)P19細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，培液為5ml含10%FBS的DMEM/F12。隔天傳代。傳代時(shí)，吸去原有培液，用5mlPBS洗一遍，再加入0.5mlTrypsin-EDTA(IX)于37。C消化5分鐘，取出輕輕拍打，使細(xì)胞脫壁。加入2.5ml含10%FBS的培養(yǎng)液終止胰酶作用，吹打成單細(xì)胞，并將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。1，000rpm離心3min，棄上清。加入3ml含10%FBS的新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞充分懸浮，以3X105細(xì)胞/瓶接種。細(xì)胞培養(yǎng)在37。C、5%C02的培養(yǎng)箱中。N2B27誘導(dǎo)的P19細(xì)胞的體外分化N2B27誘導(dǎo)的P19細(xì)胞的體外分化的基本步驟如圖2A所示。1.N2B27的配制和誘導(dǎo)A.每50mlDMEM/F12(每1000ml配制的DMEM/F12中加入了31mg青霉素，50mg鏈霉素，2.2g碳酸氫鈉；購(gòu)自Invitrogen)中加入以下6種因子，使其終濃度分別為25ug/mllns，100ug/mlTF，6nMPro，16nMPut，30nMSel，50ug/mlBSA;B.每50mlNeuralBasal培養(yǎng)基中加入lmlB27(不含維生素A)(購(gòu)自GIBCO);A和B二者以1:1混合。P19細(xì)胞以1X105細(xì)胞/ml的密度接種于底部不經(jīng)處理的細(xì)菌培養(yǎng)皿(petridish)中，培養(yǎng)液為5mlN2B27，不加RA。P19細(xì)胞在此培液中形成胚胎樣細(xì)胞團(tuán)。成團(tuán)誘導(dǎo)4天，中間換液一次，并將培液體積加倍。換液時(shí)用巴斯德吸管將細(xì)胞團(tuán)小心地轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，1,000rpm離心3min。棄去上清，加入N2B27新鮮培液中，小心吹打均勻后分裝至新的petridish中，繼續(xù)在37°C、5%C02培養(yǎng)。2.N2培液的配制和體外分化每100mlDMEM/F12中加入以下五種因子，使其終濃度分別為5ug/mlIns，50ug/ralTF，20nMPro，60uMPut，30nMSel。六孔板用1XPLL37。C包被過(guò)夜(1-1.5ml/孔)。次日，回收1XPLL(4"C保存，可重復(fù)用一次)。d2H20洗六孔板兩次，超凈臺(tái)內(nèi)晾干。收集誘導(dǎo)了四天的P19細(xì)胞團(tuán)，lXTrypsin-EDTA消化為單細(xì)胞，按1.0X106-1.5X106細(xì)胞/孔的接種密度接種于六孔培養(yǎng)板中。培液為N2無(wú)血清培液。隔天換液。RA誘導(dǎo)時(shí)采用的培養(yǎng)基的配制采用的培養(yǎng)基為a-MEM+10%FBS(v/v)。a-MEM培養(yǎng)基配方為每1000mla-MEM培養(yǎng)基中加入青霉素31mg，鏈霉素50mg，碳酸氫鈉2.2g。當(dāng)需要進(jìn)行RA誘導(dǎo)時(shí)，在該培養(yǎng)基中加入RA至所需濃度(luM)。細(xì)胞免疫熒光染色1.培養(yǎng)細(xì)胞的固定用PBS分3次取代原有的培液，之后在預(yù)冷的4。/。PFA中4°C固定30min。而后在-2(TC預(yù)冷30min的CMA(氯仿甲醇丙酮=1:2:1)中低溫固定30min，移至100%甲醇中，-20°C密閉保存。使用前，梯度甲醇復(fù)水(95%,80%，70%,50%,30%甲醇，ddH20，各5min)后，于PBS中平衡2X5min，進(jìn)行免疫化學(xué)染色。2.免疫染色將細(xì)胞置于蓋玻片上，有細(xì)胞面朝上，平放于干凈的載玻片上，濾紙擦邊，蠟筆(immunoedgepen)畫(huà)框。以含0.5%NGS(正常羊血清)，1%BSA的PBS中室溫封閉1小時(shí)。而后用對(duì)應(yīng)于各種待檢測(cè)分子的第一抗體(一抗)室溫孵育11.5小時(shí)或4°C過(guò)夜，PBS洗3次，每次10min。而后用第二抗體(二抗)室溫孵育11.5小時(shí)，PBS洗3次，每次10min。DAP工染色，室溫3-5min，PBS洗1次。最后免疫熒光封固劑封片，封片后在室溫下避光晾干。采用熒光顯微鏡觀察染色情況。RT-PCR采用常規(guī)方法從所述的細(xì)胞中抽提mRNA，利用對(duì)應(yīng)于各待測(cè)基因(如各種分子標(biāo)記)的引物，通過(guò)RT-PCR分別擴(kuò)增待檢測(cè)的基因，將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。原位雜交細(xì)胞培養(yǎng)在種有玻片的35mm皿或六孔板中。實(shí)驗(yàn)時(shí)從培箱中取出。在4%的多聚甲醛中室溫固定20min。然后與制備好的線性DNA模板探針進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，詳見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。FACS檢測(cè)每天收集RA/P19和N2B27/P19的細(xì)胞團(tuán)，PBS洗一次，用胰酶消化成單細(xì)胞，再用PBS洗一次。然后用0.2mlPBS重懸細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇在4°C固定30min。PBS洗一次，以0.5mlPBS重懸。加入Rnase(購(gòu)自Invitrogen，終濃度20pg/ml)于37。C作用30min。PBS洗一次去除RNase，加入PI(購(gòu)自Sigma，終濃度50pg/ml),室溫避光作用30min，上機(jī)進(jìn)行FACS檢測(cè)。G0/G1峰的位置以未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞而定，每次實(shí)驗(yàn)均需重新設(shè)定。Vent2-Luc/P19穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建和熒光素酶檢測(cè)法1.Vent2/P19穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選1)質(zhì)粒Vent2-luc(購(gòu)自Promega)和pRL-TK(購(gòu)自Promega)以4:1共轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%滿(mǎn)時(shí)，傳代并將細(xì)胞稀釋?zhuān)种?個(gè)60mm皿中。2)12小時(shí)后，在培液中添加G418，終濃度為500|ig/ml。添加選擇壓力后，細(xì)胞開(kāi)始死亡。視細(xì)胞死亡程度，隔天換液。3)2-3周后，基本再無(wú)死亡的細(xì)胞。傳代并按比例稀釋細(xì)胞，在IOcm培養(yǎng)皿中接種300-400個(gè)細(xì)胞；剩余的細(xì)胞懸液凍存，保存于液氮中。4)3-4天后10cm培養(yǎng)皿中單個(gè)細(xì)胞將長(zhǎng)成較大的單克隆，在顯微鏡下觀察并選擇形態(tài)較好的單克隆細(xì)胞，在培養(yǎng)皿的底部劃圈標(biāo)記。5)吸去培養(yǎng)液，以lxPBS洗。吸去PBS,勿吸太干，以免細(xì)胞過(guò)度暴露于空氣中。小心將滅過(guò)菌的克隆環(huán)粘在標(biāo)記好的圈上，對(duì)克隆環(huán)中的細(xì)胞分別進(jìn)行傳代操作，將細(xì)胞懸液盡數(shù)轉(zhuǎn)移至十二孔板中。6)待十二孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)至70-80%滿(mǎn)時(shí)，將其傳代，轉(zhuǎn)移至六孔板中。待六孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)至70-80%滿(mǎn)時(shí)，將其分別轉(zhuǎn)移至60mm皿中。將60mm皿中的細(xì)胞凍存。另留一份以裂解緩沖液裂解，測(cè)熒光素酶報(bào)告基因活性。2.報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)用Vent2/P19穩(wěn)定株進(jìn)行RA誘導(dǎo)，N2B27誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中分別加入BMP4，Noggin或SU5402等因子。收取每天的細(xì)胞團(tuán)離心去培液，用lxPBS洗一次后凍在-80。C，收齊一批樣品后以lxPLB(Passivelysisbuffer),室溫裂解30min，收集裂解細(xì)胞。按照Promega提供的操作方法，分別加入底物1和底物2，測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。WesternBlot將待測(cè)細(xì)胞用SDS裂解液裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后分別用相應(yīng)的抗體(Erk兔源多抗(購(gòu)自SantaCruz)，p-ERK鼠源單抗(購(gòu)自SantaCruz)，Akt鼠源單抗(購(gòu)自SantaCruz)，p-Akt兔源多抗(購(gòu)自SantaCruz),PLC-y兔源多抗(購(gòu)自CellSignaling),p-PLC-y兔源多抗(購(gòu)自CellSignaling))進(jìn)行雜交，用化學(xué)發(fā)光法使x光膠片感光，掃描照片進(jìn)行分析。II.具體實(shí)施例實(shí)施例lP19細(xì)胞相當(dāng)于早期胚胎中的上胚層細(xì)胞已有的報(bào)道都認(rèn)為P19細(xì)胞在發(fā)育時(shí)期上類(lèi)似于早期胚胎中的上胚層細(xì)胞。為了進(jìn)一步確認(rèn)這種說(shuō)法，本發(fā)明人用RT-PCR，免疫染色和原位雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和上胚層的分子標(biāo)記在ES細(xì)胞和P19細(xì)胞的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果見(jiàn)圖1A。結(jié)果表明，P19細(xì)胞表達(dá)上胚層(印iblast)的分子標(biāo)記FGF5，但是不表達(dá)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellmass)的分子標(biāo)記FGF4，Gbx2，Rexl，CRTR-1;而ES恰恰相反，它表達(dá)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分子標(biāo)記FGF4，Gbx2，Rexl和CRTR-1，卻不表達(dá)上胚層的分子標(biāo)記FGF5。FGF4和FGF5的免疫染色、Gbx2的原位雜交結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果是一致的，見(jiàn)圖1B。雖然P19和ES都表達(dá)多潛能的分子標(biāo)記0ct4，它們代表了不同的多潛能細(xì)胞群體。ES相當(dāng)于體內(nèi)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，而P19對(duì)應(yīng)了上胚層的細(xì)胞。因此，P19細(xì)胞可以用來(lái)研究從上胚層到神經(jīng)外胚層的過(guò)程。實(shí)施例2N2B27能夠誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化成為高比例的神經(jīng)干細(xì)胞P19細(xì)胞在N2B27無(wú)血清培液中成團(tuán)懸浮培養(yǎng)4天(P19NB/Agg4d)，4天后肉眼即可見(jiàn)培養(yǎng)液中懸浮有大量細(xì)胞團(tuán)。通過(guò)自然沉降小心收集細(xì)胞團(tuán)，將細(xì)胞團(tuán)固定，冰凍切片后通過(guò)免疫雙熒光染色的方法考察干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記0ct4和神經(jīng)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Sox在N2B27誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞團(tuán)中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未誘導(dǎo)的P19細(xì)胞具有多潛能性，所有細(xì)胞為0ct4+Sox+，即具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。在含血清培液里懸浮培養(yǎng)4天，不用RA處理的細(xì)胞團(tuán)(P19Agg4d)不再表達(dá)Sox，但繼續(xù)表達(dá)多潛能細(xì)胞的分子標(biāo)記0ct4;RA(P19RA/Agg4d)或N2B27(P19NB/Agg4d)誘導(dǎo)4天的細(xì)胞團(tuán)不再表達(dá)0ct4，但繼續(xù)表達(dá)Sox，見(jiàn)圖2B。這些0ct4—Sox+細(xì)胞都是神經(jīng)干細(xì)胞。計(jì)數(shù)結(jié)果表明，N2B27能夠誘導(dǎo)高比例(94%)的神經(jīng)干細(xì)胞，而RA只能誘導(dǎo)大約30%的神經(jīng)干細(xì)胞，見(jiàn)圖2C。為了更詳細(xì)地分析N2B27的誘導(dǎo)過(guò)程，本發(fā)明人收取了誘導(dǎo)1到4天的細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行染色分析。結(jié)果表明，多潛能細(xì)胞0ct4+Sox+的比例隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行逐漸下降，神經(jīng)干細(xì)胞0ct4—Sox+在誘導(dǎo)第3天開(kāi)始出現(xiàn)，并在第4天達(dá)到94%，見(jiàn)圖2D。已知放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(radialglia)是體內(nèi)早期神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中廣泛存在的一類(lèi)神經(jīng)干細(xì)胞，是絕大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體。為了進(jìn)一步確認(rèn)N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的性質(zhì)，本發(fā)明人采用如前所述的免疫染色方法檢測(cè)了細(xì)胞團(tuán)中放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記(即Nestin，RC2，3CB2，Vimentin，Pax6)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)多于95%的細(xì)胞都表達(dá)Nestin，RC2，3CB2和Vimentin。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)只有約80%左右的細(xì)胞為Pax6陽(yáng)性，這可能因?yàn)樵诎l(fā)育的大腦皮層中，有些放射狀膠質(zhì)細(xì)胞并不表達(dá)Pax6，見(jiàn)圖3A和圖3B。上述結(jié)果都表明，N2B27能夠把P19細(xì)胞誘導(dǎo)成高比例的神經(jīng)干細(xì)胞。實(shí)施例3N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)并不伴隨著蟲(chóng)胚層和內(nèi)胚層的誘導(dǎo)在含血清的培液中進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)常常伴隨著中胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞的出現(xiàn)。為了檢測(cè)在N2B27培液中的神經(jīng)誘導(dǎo)是否也是這種情況，本發(fā)明人用RT-PCR檢測(cè)了三個(gè)胚層的分子標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，祌經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記Soxl，2，3在N2B27誘導(dǎo)(NB/Agg)之后表達(dá)上調(diào)，尤其值得注意的是Soxl的表達(dá)在誘導(dǎo)第3天大幅度上調(diào)，這與神經(jīng)干細(xì)胞在N2B27誘導(dǎo)的第3天開(kāi)始出現(xiàn)的結(jié)果一致。中胚層的分子標(biāo)記Brachyury和Goosecoid在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中只有低水平的表達(dá)，而內(nèi)胚層的分子標(biāo)記HNF3P和GATA6幾乎檢測(cè)不到；這些分子標(biāo)記在RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞中都有高水平的表達(dá)，見(jiàn)圖3C。上述結(jié)果說(shuō)明，N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)并不伴隨著中胚層和內(nèi)胚層的誘導(dǎo)D實(shí)施例4N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)不是通過(guò)非神經(jīng)細(xì)胞的選擇性調(diào)亡實(shí)現(xiàn)的現(xiàn)有的一些神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法往往通過(guò)神經(jīng)特異的營(yíng)養(yǎng)性培液來(lái)篩選神經(jīng)干細(xì)胞，引導(dǎo)非神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而得到高比例的神經(jīng)干細(xì)胞群體。為了檢測(cè)N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)是通過(guò)非神經(jīng)細(xì)胞選擇性的凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，還是直接的從干細(xì)胞到神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變，本發(fā)明人用FACS檢測(cè)了在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞凋亡。FACS檢測(cè)結(jié)果表明，N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中的凋亡和正常P19差不多，而RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞有比較高比例的凋亡，見(jiàn)圖3D。為了更進(jìn)一步的證實(shí)這個(gè)結(jié)果，本發(fā)明人用TUNEL染色(采用TUNEL檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自invitrogen))來(lái)檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)第4天的團(tuán)的凋亡情況。結(jié)果顯示，N2B27誘導(dǎo)的團(tuán)(NB)和正常的有血清培液里培養(yǎng)4天的團(tuán)都沒(méi)有什么凋亡，而RA誘導(dǎo)4天的團(tuán)里有很多TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞，見(jiàn)圖3E。上述結(jié)果表明，N2B27誘導(dǎo)高比例的神經(jīng)干細(xì)胞不是通過(guò)非神經(jīng)細(xì)胞的選擇性調(diào)亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而是一個(gè)直接的從多潛能干細(xì)胞到神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變過(guò)程。實(shí)施例5N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端特性(AnteriorCharacter)早期胚胎的神經(jīng)板具有前后軸和背腹軸的位置信息，賦予它們特定的分化命運(yùn)。為了檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞是否具有特定的位置信息，本發(fā)明人用RT-PCR檢測(cè)前后軸的位置分子標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果如圖4A所示，前端神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記0tx2和Hesxl在正常P19細(xì)胞(P19EC)和N2B27(NB)誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)。在前腦特異表達(dá)的同源盒基因Six3在N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中被極大誘導(dǎo)。而后方神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記，比如中后腦界限處的分子標(biāo)記Gbx2，后腦和脊髓的分子標(biāo)記Hoxb4，脊髓的分子標(biāo)記Hoxb9，在正常P19細(xì)胞和N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中不表達(dá)。RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞團(tuán)，只表達(dá)后方分子標(biāo)記，不表達(dá)前方分子標(biāo)記。上述結(jié)果提示，N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端神經(jīng)外胚層的特性，而RA誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有后方的特性。為了驗(yàn)證這些前端的神經(jīng)外胚層細(xì)胞能否被后方化因子如RA后方化，本發(fā)明人用RA處理N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞切，并檢測(cè)前后方分子標(biāo)記的變化。在RA的處理下，后方化的分子標(biāo)記Gbx2，Hoxb4和Hoxb9能被有效的誘導(dǎo)。有趣的是，這些后方的分子標(biāo)記被最有效誘導(dǎo)的時(shí)間不一樣。Gbx2最佳的誘導(dǎo)時(shí)間2天N2B27誘導(dǎo)加上2天RA處理(NB2dRA2d)，Hoxb9最佳的誘導(dǎo)時(shí)間是4天N2B27誘導(dǎo)加上4天RA處理(NB4dRA4d)，Hoxb4在任何時(shí)間都能得到有效的誘導(dǎo)。前端的分子標(biāo)記，0tx2和Six3，只有在2天N2B27誘導(dǎo)加上2天RA處理時(shí)能得到最有效的抑制。N2B27誘導(dǎo)4天以后，P19細(xì)胞己經(jīng)完全前方化了，即使再用RA處理4天，也只能部分抑制0tx2和Six3的表達(dá)。RA只能在一定的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)前方基因進(jìn)行有效的抑制。作為對(duì)照的細(xì)胞在N2B27培液中繼續(xù)培養(yǎng)到總共8天(NB8d)也不會(huì)發(fā)生位置信息的改變。本發(fā)明人還用免疫染色來(lái)進(jìn)一步證實(shí)RA的后方化作用。Hoxb4染色結(jié)果顯示N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞在N2B27里培養(yǎng)到第8天(NB8d)也不會(huì)表達(dá)Hoxb4。而4天的N2B27誘導(dǎo)加上4天的RA處理能夠使多于95%的細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)Hoxb4(NB4雄4d)，見(jiàn)圖4B和圖4C。上述結(jié)果都表明，N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端神經(jīng)外胚層特性，并且能夠被RA有效的后方化。實(shí)施例6N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化全能性為了檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞是否能夠分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明人把N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞團(tuán)打散成單細(xì)胞，種到事先用PLL包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在無(wú)血清N2培液中培養(yǎng)，并且通過(guò)免疫染色檢測(cè)分子標(biāo)記來(lái)確定這些細(xì)胞的分化情況。在重鋪板(R印lating)的第1天，就有神經(jīng)上皮樣細(xì)胞出現(xiàn)，而后漸漸形成細(xì)胞簇，從中延伸出許多神經(jīng)突觸。免疫染色顯示，隨著分化的進(jìn)行，這些細(xì)胞能分化出Tujl和MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞，GFAP陽(yáng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞，04陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞。Tujl和MAP2陽(yáng)性的細(xì)胞在r印lating第1天就出現(xiàn)，在第4-5天達(dá)到高峰(多于90%)，隨后下降。星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分別在第IO天和第14天開(kāi)始出現(xiàn)，見(jiàn)圖5A，B。為了確定在N2B27誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元中有哪些神經(jīng)元亞型，本發(fā)明人用RT-PCR來(lái)檢測(cè)各種神經(jīng)元亞型的分子標(biāo)記。結(jié)果如圖5C，RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞表達(dá)很強(qiáng)的GABA能神經(jīng)元分子標(biāo)記，GAD67和EAAC1，這與前人的工作一致(已報(bào)導(dǎo)RA誘導(dǎo)的P19神經(jīng)元絕大多數(shù)是GABA能的神經(jīng)元)。而N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)元表達(dá)膽堿能神經(jīng)元的分子標(biāo)記ChAT，GABA能神經(jīng)元分子標(biāo)記GAD67，谷氨酸能神經(jīng)元分子標(biāo)記VGLUT1，多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)記TH，5-羥色氨能神經(jīng)元分子標(biāo)記TPH1，TPH2。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，本發(fā)明人用免疫染色觀察到了約10%的GAD65和5%的VGLUT1陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖5E和圖5F。為了檢測(cè)這樣高比例的神經(jīng)元是直接的神經(jīng)干細(xì)胞分化的結(jié)果還是非神經(jīng)干細(xì)胞選擇性調(diào)亡的結(jié)果，本發(fā)明人用FACS來(lái)檢測(cè)r印lating后4天內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果見(jiàn)圖5D，RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞在r印lating第1天會(huì)有大量的死亡，隨后凋亡細(xì)胞減少。而N2B27誘導(dǎo)的P19細(xì)胞在r印lating后4天內(nèi)都沒(méi)有明顯的凋亡。綜上可見(jiàn)，N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化的全能性，可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且它能分化出高比例的神經(jīng)元不是通過(guò)N2培養(yǎng)基的篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)的，是直接的從神經(jīng)干細(xì)胞到神經(jīng)細(xì)胞的分化結(jié)果。實(shí)施例7RA在P19細(xì)胞神經(jīng)誘導(dǎo)的過(guò)程中會(huì)加速神經(jīng)元分化，并促進(jìn)內(nèi)胚層分子標(biāo)記表達(dá)RA誘導(dǎo)多潛能細(xì)胞的神經(jīng)分化長(zhǎng)期以來(lái)作為研究體內(nèi)神經(jīng)誘導(dǎo)的體外模型。但是，RA對(duì)神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)分化的不同作用至今所知甚少。前人在爪蟾胚胎里的工作表明，RA能夠加速神經(jīng)板中神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)分化，本實(shí)施例驗(yàn)證了是否因?yàn)檫@個(gè)原因，RA誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)里神經(jīng)干細(xì)胞比例比較低。本發(fā)明人對(duì)各種誘導(dǎo)方法得到的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行Tujl染色，發(fā)現(xiàn)在N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)(P蘭/Agg4d)中Tujl的陽(yáng)性比例很低(<5%)，而在RA誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)(P19RA/Agg4d)中有16。/。的Tujl陽(yáng)性細(xì)胞。如果在N2B27誘導(dǎo)的同時(shí)加入了RA，'4天后的細(xì)胞團(tuán)里就能檢測(cè)到25%的Tujl陽(yáng)性細(xì)胞(P19NBRA/Agg4d)。上述結(jié)果表明，RA能夠加速P19細(xì)胞形成的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過(guò)程，從而導(dǎo)致在RA處理的細(xì)胞團(tuán)中只能得到相對(duì)低比例的神經(jīng)干細(xì)胞，見(jiàn)圖6A和圖6B。值得注意的是，N2B27本來(lái)能夠誘導(dǎo)約9496的神經(jīng)干細(xì)胞，加入RA以后只剩55%左右，這很難用25%的神經(jīng)分化比例來(lái)解釋。為了尋求其它的可能性，本發(fā)明人檢測(cè)了在RA處理的N2B27細(xì)胞團(tuán)中中胚層和內(nèi)胚層分子標(biāo)記(Brachyury、Goosecold、麗F3P和GATA6)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RA能夠極大促進(jìn)內(nèi)胚層分子標(biāo)記的表達(dá)，見(jiàn)圖6C。這就意味著除了加速神經(jīng)分化以外，RA也促進(jìn)了P19細(xì)胞向內(nèi)胚層分化。并且還發(fā)現(xiàn)，RA能夠在N2B27誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)中引起后方化(圖6D)。綜上所述，RA對(duì)干細(xì)胞的命運(yùn)決定有多重作用，包括誘導(dǎo)后方化神經(jīng)命運(yùn)，加速誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元，以及促進(jìn)千細(xì)胞向內(nèi)胚層方向分化。實(shí)施例8BMP信號(hào)通路在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中完全被阻斷N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)是一個(gè)很高效的誘導(dǎo)系統(tǒng)，本實(shí)施例驗(yàn)證在這個(gè)過(guò)程中有哪些信號(hào)通路在起作用。己知BMP信號(hào)通路的抑制對(duì)于神經(jīng)誘導(dǎo)是必需的。本發(fā)明人先用RT-PCR檢測(cè)了BMP家族成員和BMP的拮抗劑在N2B27神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)。結(jié)果顯示，BMP2和BMP4的表達(dá)在N2B27誘導(dǎo)的第3天下調(diào)，而它們的拮抗劑Noggin、Chordin、Follistatin都在N2B27誘導(dǎo)的第1天就顯著上調(diào)。相反的，在RA誘導(dǎo)的P19神經(jīng)分化中，BMP2和BMP4是持續(xù)表達(dá)的，它們的拮抗劑的表達(dá)也處于比較低的水平，見(jiàn)圖7A。上述結(jié)果提示，BMP信號(hào)在N2B27過(guò)程誘導(dǎo)中被削弱。為了檢測(cè)N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中BMP信號(hào)途徑的活性，本發(fā)明人建立了Vent2-Luc/P19穩(wěn)定細(xì)胞株。Vent2是BMP下游的耙基因，對(duì)BMP信號(hào)有很靈敏的響應(yīng)性。Vent2-Luc是由Vent2的啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，由此可以反映出BMP信號(hào)的強(qiáng)弱。本發(fā)明人用Vent2/P19細(xì)胞株來(lái)做P19誘導(dǎo)，收取每天的細(xì)胞團(tuán)，裂解以后采用常規(guī)方法檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的活性。RA和N2B27誘導(dǎo)條件的區(qū)別之處在于，前者在有血清環(huán)境，并且有RA存在；而后者是無(wú)血清環(huán)境，沒(méi)有RA。為了分清血清和RA對(duì)BMP信號(hào)通路的影響，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了4組實(shí)驗(yàn)，把Vent2/P19在以下4種環(huán)境中培養(yǎng)4天有血清培液(Agg)，有血清培液加RA(RA/Agg),N2B27無(wú)血清培液(NB/Agg)，N2B27加RA(順A/Agg)。結(jié)果見(jiàn)圖7B，在有血清培液中成團(tuán)第1天，BMP信號(hào)被極大激活；有血清培液中加入RA可部分抑制BMP信號(hào)。在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中BMP信號(hào)完全被抑制，在其中加入RA也不能激活BMP信號(hào)。由此看來(lái)，血清會(huì)激活P19細(xì)胞中的BMP信號(hào)，而RA可以部分抑制這種活性。在N2B27的無(wú)血清誘導(dǎo)環(huán)境中，BMP信號(hào)是完全被抑制的。已有報(bào)道，血清中痕量的BMP會(huì)抑制ES和P19細(xì)胞的神經(jīng)分化。為了證實(shí)這一點(diǎn)，本發(fā)明人在N2B274天誘導(dǎo)過(guò)程中加入麗P4(10ng/ml)，熒光素酶活性測(cè)定顯示BMP活性在第1天也是較高的。然而這種BMP活性能夠被BMP的抑制劑Noggin有效抑制。為了進(jìn)一步確認(rèn)這個(gè)BMP活性情況與神經(jīng)誘導(dǎo)相關(guān)，本發(fā)明人檢測(cè)了在N2B27中加入BMP或者同時(shí)加入BMP和Noggin時(shí)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入BMP能夠極大程度的抑制神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)，而同時(shí)加入Noggin可以逆轉(zhuǎn)(rescue)這種情況，見(jiàn)圖7C和圖7D?？傊?，上述結(jié)果顯示BMP信號(hào)活性的完全抑制在N2B27神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了較為重要的作用。實(shí)施例9FGF信號(hào)參與N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)已有報(bào)道，F(xiàn)GF信號(hào)在雞胚的神經(jīng)誘導(dǎo)中起著很重要的作用，在ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)中也是必不可少的。本實(shí)施例驗(yàn)證FGF信號(hào)是否在RA或N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中起作用。本發(fā)明人先用RT-PCR檢測(cè)了RA或N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中FGF家族成員的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF1，F(xiàn)GF2，F(xiàn)GF4和FGF8在N2B27神經(jīng)誘導(dǎo)的不同階段被誘導(dǎo)表達(dá)，見(jiàn)圖8A。為了檢測(cè)FGF信號(hào)對(duì)于N2B27神經(jīng)誘導(dǎo)是否是必需的，本發(fā)明人在N2B27培液中加入FGF受體的抑制劑SU502來(lái)阻斷FGF信號(hào)通路，通過(guò)免疫染色以及檢測(cè)熒光素酶活性來(lái)確定其影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SU5402(5uM)可以極大程度抑制神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)，見(jiàn)圖8B。這些結(jié)果顯示FGF信號(hào)參與了N2B27誘導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)。根據(jù)以往的報(bào)道，F(xiàn)GF的神經(jīng)誘導(dǎo)功能可能是通過(guò)兩種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一種是依賴(lài)于對(duì)BMP信號(hào)的抑制FGF信號(hào)通過(guò)抑制BMP成員的表達(dá)，和/或刺激BMP拮抗劑的表達(dá)，或者通過(guò)激活Erk，進(jìn)而阻止Smadl的入核來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)BMP信號(hào)途徑的抑制。另一種是不依賴(lài)于BMP抑制的，F(xiàn)GF信號(hào)通過(guò)磷酸化Erk直接參與了P19細(xì)胞的神經(jīng)分化。本發(fā)明人還驗(yàn)證了在N2B27誘導(dǎo)中FGF是通過(guò)那種方式來(lái)作用的。如果FGF是僅僅通過(guò)抑制BMP來(lái)實(shí)現(xiàn)的，那么用試劑來(lái)完全抑制BMP活性應(yīng)該可以逆轉(zhuǎn)阻斷FGF通路的效果，重新實(shí)現(xiàn)神經(jīng)千細(xì)胞的誘導(dǎo)。在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中，本發(fā)明人通過(guò)加入過(guò)量的Noggin來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)BMP信號(hào)的完全抑制，發(fā)現(xiàn)并不能逆轉(zhuǎn)SU5402對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的抑制。為了進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明人用Vent2/P19來(lái)檢測(cè)這些過(guò)程中BMP信號(hào)通路的活性，發(fā)現(xiàn)加入SU5402能夠很低程度的釋放一些內(nèi)源的BMP活性，而這些活性能夠被Noggin完全抑制，見(jiàn)圖8C。該結(jié)果表明，F(xiàn)GF信號(hào)直接參與了N2B27神經(jīng)誘導(dǎo)，并且主要是通過(guò)不依賴(lài)于MP的抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。FGF信號(hào)通常會(huì)激活MAPK/ERK，PI3K/Akt，禾d/或PLC-y信號(hào)途徑。為了檢測(cè)哪種信號(hào)途徑參與了N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)，本發(fā)明人用WesternBlot檢測(cè)了各個(gè)通路的活化情況。結(jié)果見(jiàn)圖8E-G，發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK在此系統(tǒng)中并未被激活，這與體內(nèi)的報(bào)道是一致的，即在早期小鼠胚胎神經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生的區(qū)域內(nèi)不能檢測(cè)到明顯的ERK磷酸化形式。本發(fā)明人分別用各種途徑的抑制劑，U0126(5uM)來(lái)抑制MEK途徑，Wortmannin(100nM)來(lái)抑制PI3K途徑，U73122(100nM)(前述抑制劑購(gòu)自Calbiochem)來(lái)抑制PLC-y途徑，發(fā)現(xiàn)它們都不能抑制N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)。而在同等情況下，它們的確能夠抑制自己的目的蛋白的磷酸化，見(jiàn)圖8D?？偠灾?，這些結(jié)果顯示，F(xiàn)GF信號(hào)通過(guò)不依賴(lài)于BMP抑制的途徑參與了N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)，并且己知的途徑都不參與這個(gè)過(guò)程，提示很可能有新的途徑在其中起作用。討論內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(InnerCellMass,ICM)來(lái)源的上胚層(印iblast)是小鼠發(fā)育過(guò)程中最后的多潛能細(xì)胞群，能夠派生出所有的胚層體系，包括神經(jīng)外胚層。從上胚層樣細(xì)胞中誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的系統(tǒng)可以很好的用來(lái)研究胚胎發(fā)育原腸運(yùn)動(dòng)時(shí)期的神經(jīng)命運(yùn)決定事件。小鼠P19胚胎性癌細(xì)胞在發(fā)育時(shí)期上正對(duì)應(yīng)于體內(nèi)的上胚層階段。P19細(xì)胞在成團(tuán)條件下經(jīng)RA誘導(dǎo)，可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這是廣泛應(yīng)用于研究哺乳動(dòng)物胚胎早期神經(jīng)發(fā)育機(jī)制的體外模型。然而，這一系統(tǒng)有其不足之處。首先，它只能誘導(dǎo)低比例的神經(jīng)干細(xì)胞，并且在誘導(dǎo)同時(shí)就將其后方化，與體內(nèi)的神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程不一致；另外在體內(nèi)，RA并不行使神經(jīng)誘導(dǎo)的功能。因此，RA誘導(dǎo)的神經(jīng)分化不是很好的研究早期胚胎神經(jīng)分化的模型。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明人建立了新的無(wú)血清誘導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)出高比例的具備前端特性的神經(jīng)干細(xì)胞群體(94%)，并能被后方化因子RA有效后方化。這些神經(jīng)干細(xì)胞具有分化多潛能性，在體外能分化出高比例的神經(jīng)元(>90%)，同時(shí)也能分化出星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。為探討是何種機(jī)制在其中起作用，本發(fā)明人考察了神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程中的核心角色BMP通路在其中的活化情況。本發(fā)明人建立了穩(wěn)定表達(dá)Vent2/Luc的P19細(xì)胞株，用來(lái)監(jiān)測(cè)各種誘導(dǎo)過(guò)程中BMP信號(hào)的活性。在N2B27誘導(dǎo)過(guò)程中BMP信號(hào)通路是完全被抑制的。而在其他不能進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)，或者只能進(jìn)行不完全的神經(jīng)誘導(dǎo)條件下，BMP信號(hào)都有不同程度的激活，提示BMP信號(hào)通路的完全抑制是N2B27進(jìn)行高比例神經(jīng)誘導(dǎo)的主要原因。本發(fā)明人還考察了FGF通路在其中的作用。用FGF信號(hào)通路的廣譜性抑制劑SU5402能夠有效抑制N2B27的神經(jīng)誘導(dǎo)，并且此抑制不能被BMP的拮抗劑Noggin回復(fù)，提示FGF信號(hào)也在其中扮演了不可或缺的角色，并且其功能是通過(guò)不依賴(lài)于BMP抑制的方式，直接促進(jìn)P19細(xì)胞的神經(jīng)命運(yùn)決定。本發(fā)明人主要運(yùn)用P19細(xì)胞來(lái)進(jìn)行體外神經(jīng)分化研究，使用P19細(xì)胞模型的優(yōu)越性在于它省略了由ICM向上胚層發(fā)育分化的階段，進(jìn)而直接反映了由上胚層向神經(jīng)外胚層發(fā)育分化的過(guò)程，因此提供的信息可能更為準(zhǔn)確。傳統(tǒng)的RA誘導(dǎo)P19神經(jīng)分化的方法不能很好地反應(yīng)體內(nèi)的情況，在本發(fā)明中，本發(fā)明人建立了新的P19神經(jīng)誘導(dǎo)模型，該方法能夠快捷迅速的誘導(dǎo)高比例的神經(jīng)干細(xì)胞，這些神經(jīng)干細(xì)胞具有發(fā)育的多潛能性，在特定條件下能夠分化出不同亞型的神經(jīng)元，星型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)這些神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)前端神經(jīng)外胚層的分子標(biāo)記，能夠被后方化信號(hào)RA有效的后方化，這與體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成的two-st印模型是一致的。現(xiàn)有的一些神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法很多需要運(yùn)用特定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性培液來(lái)選擇性篩選，使得非神經(jīng)細(xì)胞選擇性調(diào)亡，從而得到高比例的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明人的方法不需要非神經(jīng)細(xì)胞的選擇性調(diào)亡，是直接的從多潛能干細(xì)胞到神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變。與傳統(tǒng)的RA誘導(dǎo)模型相比，本發(fā)明的模型不需要血清，從而排除了血清里復(fù)雜成分的干擾；不需要RA，不需要特定培養(yǎng)基的篩選，直接誘導(dǎo)就可以得到更高比例的具有前端特性(anteriorcharacter)的神經(jīng)干細(xì)胞群體，能夠更好的模擬體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的過(guò)程。本發(fā)明的模型的建立為更好的研究胚胎早期神經(jīng)發(fā)生的分子機(jī)制提供了很好的體外模型，同時(shí)也為從小鼠胚胎癌細(xì)胞定向誘導(dǎo)特定亞型的神經(jīng)元，從而應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的千細(xì)胞移植治療提供了可能。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種促進(jìn)P19胚胎性癌細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而使P19胚胎性癌細(xì)胞形成神經(jīng)干細(xì)胞。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的N2B27培養(yǎng)基含有(a)加入了Ins、TF、Pro、Put、Sd和BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基；和(b)加入了B27的Neurobasal培養(yǎng)基；其中，(a)與(b)以(1-2):(1-2)的比例混合。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，將P19胚胎性癌細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞的時(shí)間是96士10小時(shí)。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件是37土3。C，5±1%C02。6.—種制備富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%，其特征在于，所述方法包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞，從而獲得所述的細(xì)胞群。7.—種通過(guò)權(quán)利要求6所述的方法制備獲得的富含神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞占所有細(xì)胞的80-100%。8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Sox，不表達(dá)干細(xì)胞特異的分子標(biāo)記Oct。9.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述的神經(jīng)干細(xì)胞是具有前端神經(jīng)外胚層特性的細(xì)胞。10.—種N2B27培養(yǎng)基的用途，其特征在于，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)P19胚胎性癌細(xì)胞使之形成神經(jīng)千細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括用N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)P19細(xì)胞，獲得的細(xì)胞群中神經(jīng)干細(xì)胞可占94％以上。本發(fā)明的方法在無(wú)血清環(huán)境中培養(yǎng)P19細(xì)胞且無(wú)需視黃酸的參與，既可排除成分復(fù)雜的血清的干擾，又可避免獲得的神經(jīng)干細(xì)胞被視黃酸后方化，并且，所述方法不導(dǎo)致選擇性細(xì)胞凋亡，是一個(gè)直接從多潛能干細(xì)胞到神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變過(guò)程。本發(fā)明獲得的神經(jīng)干細(xì)胞具有前端神經(jīng)板特性以及分化全能性，可很好地模擬體內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生過(guò)程，因此可以作為研究模型，用于分析從上胚層細(xì)胞到神經(jīng)外胚層的神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)分化過(guò)程，為研究胚胎著床后的發(fā)育事件提供了理想途徑。文檔編號(hào)C12N5/06GK101294146SQ200710040179公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年4月28日優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日發(fā)明者夏彩虹,景乃禾申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院