專利名稱：：蝎毒素基因轉(zhuǎn)化的殺蟲真菌工程菌株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更特別地，本發(fā)明涉及一種優(yōu)化的編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的多核苷酸，可表達(dá)北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的真菌工程菌株，以及利用所述菌株殺滅昆蟲的方法。
背景技術(shù)：
：隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們對生活水平要求的提高，環(huán)境友好的微生物殺蟲劑的研究和應(yīng)用受到越來越高的重視。微生物殺蟲劑種類很多，已發(fā)現(xiàn)的有2000多種，按照微生物種類可分為細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物和線蟲等。目前被開發(fā)應(yīng)用并形成商品化產(chǎn)品的主要有細(xì)菌類殺蟲劑、真菌類殺蟲劑、病毒類殺蟲劑。真菌類殺蟲劑已經(jīng)有多年應(yīng)用歷史，目前應(yīng)用的真菌種類主要是一些寄生譜較廣的昆蟲病原真菌，種類主要有白僵菌、綠僵菌、擬青霉、座殼孢菌和輪枝菌。真菌殺蟲的主要機(jī)制是通過昆蟲體壁主動入侵，屬于觸殺性微生物殺蟲劑，因而比病毒或細(xì)菌昆蟲病原微生物通過消化道感染具有獨特的優(yōu)勢，如對刺吸式害蟲的控制、害蟲不易產(chǎn)生抗性及容易取得持續(xù)控制效果等。但與細(xì)菌或病毒殺蟲劑相似的是，真菌殺蟲劑同樣具有殺蟲效果緩慢的弱點，適宜條件下，一般需要3-7天的時間，這在很大程度上阻礙了包括真菌殺蟲劑在內(nèi)的微生物農(nóng)藥的大面積應(yīng)用，尤其在爆發(fā)性害蟲的控制上，微生物殺蟲劑具有很大的局限性。因此，本領(lǐng)域還需要找到可更為有效快速地殺滅昆蟲且安全性高的殺昆蟲制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于提供一種可表達(dá)北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的真菌工程菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供一種有效的、可顯著提高真菌殺蟲劑殺蟲效率的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQIDNO:l中第163-375位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:l中第106-375位所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:l中第l-375位所示的核苷酸序列；或(d)與SEQIDNO:1中第163-375位有至少95%相同性，且編碼SEQIDNO:2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌中表達(dá)。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制備防治昆蟲的制劑。在本發(fā)明的第三方面，提供一種昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子，所述的啟動子選自下組(1)具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)在嚴(yán)格條件下能夠與(1)限定的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸；或(3)與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的啟動子的用途，所述的啟動子用于指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)。在本發(fā)明的第五方面，提供一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物從5，至3'依次含有以下元件本發(fā)明所述的啟動子；和目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因可編碼具有對昆蟲有毒性的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述昆蟲血腔特異性表達(dá)啟動子的下游，且與所述啟動子的間隔小于2000bp(優(yōu)選的，小于1000bp;更優(yōu)選的，小于500bp;最優(yōu)選的，小于300bp)。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，在啟動子和目的基因之間，還包含核糖體翻譯識別元件，和/或信號肽編碼元件。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物中，所述的目的基因是昆蟲毒素多肽的編碼元件；所述的核糖體翻譯識別元件具有SEQIDNO:l中第9-105位的核苷酸序列；所述的信號肽具有SEQIDNO:2中l(wèi)-19位所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲毒素多肽的編碼元件為北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件。在另一優(yōu)選例中，所述的北非蝎神經(jīng)毒素多肽AalT具有SEQIDNO:2中20-89位所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的信號肽的編碼序列具有SEQIDNO:1中106-162位所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件選自下組(i)具有SEQIDNO:1中第163-375位所示的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO:1中第163-375位有至少95%相同性，且編碼SEQIDNO:2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌(優(yōu)選的為綠僵菌或白僵菌)中表達(dá)。在本發(fā)明的第六方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物。在本發(fā)明的第七方面，提供一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體；或其基因組中整合有外源的所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是重組真菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的真菌選自綠僵菌或白僵菌。在另一優(yōu)選例中，所述的真菌細(xì)胞為孢子形式。在本發(fā)明的第八方面，提供一種孢子，所述的孢子由所述的真菌細(xì)胞產(chǎn)生。在本發(fā)明的第九方面，提供一種防治昆蟲的制劑，所述的制劑含有(a)所述的細(xì)胞和/或所述的孢子；以及(b)農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑含有1X10、lXl(^個/ml(優(yōu)選的為1X103-1Xl(T個/ml;更優(yōu)選的為lX10tlXl()S個/ml)所述的孢子(可以是濃縮形式或稀釋形式)。在本發(fā)明的第十方面，提供一種防治昆蟲的方法，所述方法包括給予需要防治昆蟲的對象或場所施用所述的孢子。在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲選自(但不限于)鱗翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲。在本發(fā)明的第十一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子，作為啟動子元件。在另一優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子可操作性連接的目的基因。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT基因序列及其它功能性序列的融合序列，其含有j/a7mRNA5'-非翻譯區(qū)、#"7信號肽編碼序列、AaIT編碼序列，且兩端攜帶BamHI酶切位點。7圖2顯示了北非蝎神經(jīng)毒素多肽AalT的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3顯示了真菌轉(zhuǎn)化及表達(dá)驗證的結(jié)果。A，使用綠僵菌GFP-549轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)實驗，表明綠色熒光蛋白GFP的信號只有當(dāng)真菌侵染至昆蟲血腔時才表達(dá)；B，A的光學(xué)顯微鏡圖片；C，RT-PCR檢測，使用引物ToxU和ToxL擴(kuò)增表明當(dāng)轉(zhuǎn)化子AalT-549在腐生培養(yǎng)基薩氏葡萄糖營養(yǎng)液中生長時毒素基因不表達(dá)，只有在昆蟲血淋巴中(包括離體)生長時才表達(dá)；D，時間序列RT-PCR分析，表明當(dāng)真菌在昆蟲血淋巴中生長時可以被快速表達(dá)；E，Western雜交驗證，表明轉(zhuǎn)化子AalT-549在昆蟲血液離體培養(yǎng)(泳道3)或感染剛死亡的煙草天蛾幼蟲體內(nèi)表達(dá)AalT多肽(泳道4-8)，當(dāng)轉(zhuǎn)化子在基本培養(yǎng)基或薩氏葡萄糖培養(yǎng)液中生長時(泳道l，2)，毒素多肽不會被表達(dá)；F、G，轉(zhuǎn)化子AalT-549在昆蟲血淋巴中離體生長72小時后用于注射麗蠅(F，上)和煙草天蛾(G，左)幼蟲，引起典型的蟲體收縮現(xiàn)象，F(xiàn)下或G右為注射在昆蟲血淋巴中生長的野生型菌株549后的情況。圖4顯示了ARSEF549野生型(WT)和毒素轉(zhuǎn)化菌株(AalT-549)在相同使用濃度下對煙草天蛾(a)和埃及伊蚊(b)生物測定時的存活曲線。A，測定孢子濃度CI-C3分別為5x105,1x106和2x107分生孢子/毫升。對照(control)為僅以0.05%吐溫-20處理的陰性對照的相應(yīng)情況。內(nèi)圖上為野生型ARSEF549感染后剛死亡的煙草天蛾幼蟲，下為AaIT-549感染后死亡的身體收縮的幼蟲；B,測定孢子濃度CI-C3分別為1x104，1x105和5x105分生孢子/毫升。對照(control)為僅以0.05%吐溫-20處理的陰性對照的相應(yīng)情況。內(nèi)圖上為野生型ARSEF549感染后剛死亡的埃及伊蚊成蟲，下為AalT-549感染后死亡的翅膀展開的成蟲。圖5顯示了ARSEF549野生型(WT)和毒素轉(zhuǎn)化菌株(AalT-549)感染煙草天蛾后的蟲糞干重比較。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次根據(jù)真菌的基因偏好，通過基因優(yōu)化手段在真菌細(xì)胞中表達(dá)了北非蝎神經(jīng)毒素多肽AalT。本發(fā)明將真菌細(xì)胞感染昆蟲并寄生在昆蟲體內(nèi)的能力和北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的神經(jīng)毒性良好地結(jié)合在一起，大大提高了真菌的殺昆蟲效率。為了提高真菌的殺蟲效率，本發(fā)明人考慮在真菌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化外源的毒素基因，通過表達(dá)毒素來提高殺蟲效率。蝎、蜘蛛和螞蟻的毒液或唾液腺中含有不同種昆蟲特異性神經(jīng)毒素，一般在微量的水平可以麻痹或殺死被捕食昆蟲。因此，本發(fā)明人選擇了北非蝎(^K/ro"o/7M,^rah.s)神經(jīng)毒素多肽AaIT，按照殺蟲真菌的基因編碼偏好，將AaIT反編碼成殺蟲真菌的基因序列，并在5'-端添加分泌信號肽序列進(jìn)行基因合成，在可控啟動子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行殺蟲真菌的轉(zhuǎn)化。經(jīng)過對技術(shù)手段的不斷探索和改進(jìn)，最終在殺蟲真菌中成功表達(dá)了AaIT并經(jīng)驗證其可提高真菌的殺蟲效率。真菌本發(fā)明中，所述的真菌是指一類具有感染昆蟲能力并能夠寄生在昆蟲體內(nèi)的殺蟲真菌。優(yōu)選的，所述的真菌選自綠僵菌或白僵菌。綠僵菌0/e"r/L^j'，朋"oph'ae)屬子囊菌類，它是一種廣譜的昆蟲病原菌，能寄生昆蟲8個目，30科共約200余種，也能寄生螨類，它可以誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生綠僵病。綠僵菌的菌落呈絨毛狀或棉絮狀，最初白色，產(chǎn)生孢子時呈綠色，故稱綠僵菌。綠僵菌以孢子發(fā)芽侵入昆蟲體內(nèi)，并在體內(nèi)繁殖和形成毒素，導(dǎo)致昆蟲死亡，但對植物沒有毒害。死蟲在體表形成的病菌孢子散出后，可再次侵染其它健蟲，在昆蟲種群內(nèi)形成重復(fù)侵染，在一定時間內(nèi)可引起昆蟲死亡。其寄主范圍已超過200余種昆蟲，較常見的有金龜甲、象甲、金針蟲、鱗翅目昆蟲幼蟲、椿象等。但天然的綠僵菌具有殺蟲效果緩慢的弱點。白僵菌(5efl匿r/fltes/a—屬于子囊菌亞門、白僵菌屬CSeawvm'a)。菌絲有橫隔有分枝的真菌。白僵菌可以侵入6個目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內(nèi)大量繁殖，同時產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結(jié)晶，這些物質(zhì)可引起昆蟲中毒，使體液發(fā)現(xiàn)機(jī)能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致昆蟲死亡，然而有殺蟲速度較慢。北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT是一種分離自北非蝎的昆蟲特異性神經(jīng)毒素多肽，其含有70個氨基酸(SEQIDN0:2)，作用于昆蟲神經(jīng)細(xì)胞的離子通道上，在低濃度(如納克水平)即可以麻痹或直接殺死昆蟲，引起的典型癥狀是導(dǎo)致昆蟲蟲體收縮，但對哺乳動物無害。以往，本領(lǐng)域人員曾在昆蟲桿狀病毒中表達(dá)AaIT，利用可表達(dá)AaIT的桿狀病毒來殺滅昆蟲，證明是一種可一定程度提高昆蟲病毒殺蟲效率的可行方法。然而，利用昆蟲病毒進(jìn)行殺蟲具有很大的局限性，主要缺點在于病毒需要活體培養(yǎng)繁殖，生產(chǎn)成本高；另一方面昆蟲病毒通過消化道感染，殺滅昆蟲的速度慢。目前本領(lǐng)域至今還沒有在殺蟲真菌中成功表達(dá)AaIT的先例。在本發(fā)明中，本發(fā)明人將AaIT多肽的編碼基因轉(zhuǎn)化入殺蟲真菌的基因組中，所述真菌分生的孢子與昆蟲接觸后，通過昆蟲體壁主動入侵到昆蟲體內(nèi)，在昆蟲體內(nèi)表達(dá)AaIT多肽，從而大大地提高了真菌的殺蟲效率。更特別的，本發(fā)明人通過在AaIT多肽的編碼基因序列的5'端設(shè)計特定的啟動子序列和信號肽編碼序列，從而使得AaIT多肽可在昆蟲血腔內(nèi)被特異性高表達(dá)且被分泌到真菌細(xì)胞外。因此，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸可編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT，其含有SEQIDNO:l中163-375位所示的核苷酸序列。所述的多核苷酸是根據(jù)真菌的基因編碼偏好，通過基因優(yōu)化改造后獲得的，從而使得其可在真菌中良好地被表達(dá)。所述的多核苷酸與AaIT的天然多核苷酸(GenBank登錄號M27706，無法在真菌中表達(dá))的相同性為71.6%。本發(fā)明所述的多核苷酸中，除了編碼AaIT多肽的多核苷酸以外，還可包括附加的編碼信號肽序列和/或核糖體翻譯識別序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其也能夠編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT，且其在轉(zhuǎn)化入真菌(優(yōu)選綠僵菌或白僵菌)后能夠表達(dá)AaIT多肽，但所述的變異體的序列與天然的AaIT基因序列不相同。所述的核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的序列和功能。優(yōu)選的，所述的多核苷酸的變異體與SEQIDNO:1中第163-375位具有80%的相同性；更優(yōu)選的，所述的多核苷酸的變異體與SEQIDNO:1中第163-375位具有90%的相同性；最優(yōu)選的，所述的多核苷酸的變異體與SEQIDNO:1中第163-375位具有95%或更高的相同性，例如兩者的相同性為96%、97%、98%或99%。本發(fā)明的多核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了本發(fā)明的多核苷酸序列，就可以用重組法來大批量地獲得該序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到該序列。此外，還可用人工合成的方法來合成本發(fā)明的多核苷酸序列，所述的人工合成可以是單次合成(適用于片段長度較短的情況)或多次合成(即先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接)。目前，已經(jīng)可以完全通過人工合成來得到編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的DNA序列。然后可將該DNA序列引入適當(dāng)?shù)腄NA分子(如載體)和細(xì)胞中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science1985;230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化所擴(kuò)增的DNA/RNA片段。昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子及其指導(dǎo)的基因表達(dá)如本文所用，所述的"啟動子"或"啟動子區(qū)(域)"是指一種核酸序列，其通常存在于編碼序列的上游(5')，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變異體，該變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。所述變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本文所用，"組織特異性啟動子"又稱"器官特異性啟動子"，在這類啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)。如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接"到該核酸序列上。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少10倍，優(yōu)選至少高100倍，更優(yōu)選至少高1000倍水平被表達(dá)，則該啟動子被認(rèn)為是組織或器官特異性的。本發(fā)明提供一種啟動子，所述的啟動子選自下組(1)具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)在嚴(yán)格條件下能夠與(1)限定的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸；或(3)與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(l)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)的功能。本發(fā)明的啟動子是組織或器官特異性的，更特別的，其是昆蟲血腔特異性的。在本發(fā)明的實例中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的啟動子的指導(dǎo)下，可以使AaIT基因或GFP基因特異地在昆蟲血腔中表達(dá)，而在其它組織、器官或其它培養(yǎng)條件不表達(dá)。本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子可以是外源(異源)的。所述的目的基因通?？梢允侨魏魏怂嵝蛄?優(yōu)選結(jié)構(gòu)性核酸序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些對于昆蟲有毒性的蛋白。本發(fā)明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進(jìn)的目的基因序列上，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進(jìn)來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進(jìn)來增加表達(dá)量，提高毒性，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信號等。此外，啟動子和目的基因可以設(shè)計成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。任何一種前述的啟動子和目的基因序列可被包含在重組載體中。所述的重組載體一般包括(從5'到3'方向)引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3'轉(zhuǎn)錄終止子，3'多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語"重組表達(dá)載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。包含上述適當(dāng)?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如CaCl2法，MgCl2法。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。構(gòu)建物和載體本發(fā)明還提供一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物從5'至3'依次含有以下元件本發(fā)明的昆蟲血腔特異性表達(dá)啟動子，目的基因。通常，所述的目的基因位于所述昆蟲血腔特異性表達(dá)啟動子的下游，且與所述啟動子的間隔小于2000bp(優(yōu)選的，小于1000bp;更優(yōu)選的，小于500bp;最優(yōu)選的，小于300bp)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在啟動子和目的基因之間，還包含核糖體翻譯識別元件，和/或信號肽編碼元件。信號肽編碼元件的加入與否取決于所需表達(dá)的目的基因的種類以及是否需要將目的基因分泌到細(xì)胞外。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了一種可用于表達(dá)昆蟲毒素多肽的構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物從5'至3'依次具有以下元件本發(fā)明的啟動子；核糖體翻譯識別元件；信號肽編碼元件；和昆蟲毒素多肽的編碼元件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲毒素多肽為北非蝎神經(jīng)毒素多肽AdT，所述的北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT具有SEQIDNO:2中20-89位所示的氨基酸序列。更優(yōu)選的，所述的北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件具有SEQIDNO:l中163-375位所示的核苷酸序列，該核苷酸序列經(jīng)過了密碼子優(yōu)化，從而適合于在真菌細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的啟動子可使得AaIT的編碼元件特異性地表達(dá)于昆蟲血腔中，而在其它條件下不表達(dá)或表達(dá)極低，從而避免了AaIT多肽被表達(dá)于昆蟲以外而造成的對環(huán)境或其它動植物的危害，提高了安全性和環(huán)境友好性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的核糖體翻譯識別元件具有SEQIDNO:l中第9-105位的核苷酸序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的信號肽具有SEQIDNO:2中l(wèi)-19位所示的氨基酸序列。更特別的，所述的MCL1蛋白信號肽的編碼序列具有SEQIDNO:l中106-162位所示的核苷酸序列。所述的MCLl蛋白信號肽可使得AaIT被分泌到真菌細(xì)胞(或孢子)外，從而使AaIT與昆蟲的體腔接觸，發(fā)揮毒性。真菌載體和真菌細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的AaIT多核苷酸的載體。本發(fā)明中，編碼AaIT的多核苷酸序列或含有該多核苷酸序列的構(gòu)建物可插入到重組表達(dá)載體中。在本發(fā)明中適用的"重組表達(dá)載體"包括但不限于在真菌中表達(dá)的載體。只要能在真菌內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含AalT編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sarabroook等，MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人將本發(fā)明的啟動子克隆入表達(dá)載體內(nèi)，然后將含核糖體翻譯識別元件、信號肽編碼元件和北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件的序列連接于啟動子的3，端，構(gòu)成重組的表達(dá)載體。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。為了制備可表達(dá)AaIT多肽的重組真菌細(xì)胞，將所述的構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。，本發(fā)明對轉(zhuǎn)化的方法沒有特別的限制。真菌原生質(zhì)體的方法在本發(fā)明中是較合適的，所述方法可參見Wang，C.S.和StLeger，R.J.2006.Acollagenousprotectivecoatenables#etar/j'ziu/B朋j'sop/j'aetoevadeinsectimmuneresponses,尸rociVat_Z爿ca(/5"ci〃5"A103:6647-6652中所描述的。篩選轉(zhuǎn)化子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在獲得遺傳穩(wěn)定的真菌細(xì)胞重組子(重組真菌菌株)后，可將所述重組真菌菌株接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，從而使真菌菌株繁殖和/或產(chǎn)生孢子。重組真菌孢子可被制成防治昆蟲的制劑，從而用于殺滅昆蟲?？蓺绲睦ハx包括(但不限于)鱗翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲。防治昆蟲的制劑本發(fā)明還提供了一種防治昆蟲的制劑(如農(nóng)藥)，所述的制劑含有有效量的所述的重組真菌或其分生孢子。更優(yōu)選的，所述的制劑還含有農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的防治昆蟲的制劑可被制成任何適合的劑型。例如，所述的制劑的形式包括(但不限于)粉劑、顆粒劑、油劑、乳劑、可濕粉、微膠囊劑、無紡布菌劑。在制備制劑時，合適的固體稀釋劑包括(但不限于)硅藻土，玉米殼，磷酸三鈣，軟木粉，高嶺土、膨潤土或硅鎂土等粘土、或水溶性聚合物。固體制劑還可以含有一種或多種相容性潤濕劑，分散劑，乳化劑或色素，這些成分在固態(tài)時也可起稀釋劑的作用。液體制劑的形式可以是溶液、懸浮液或乳液，也可以將其包在天然或合成聚合物中，并可以包含潤濕劑、分散劑或乳化劑。這樣的乳液、懸浮液或溶液可用水性、有機(jī)或水-有機(jī)稀釋劑來制備水溶性聚合物(以及上述稀釋劑的混合物)。此外，所述稀釋劑中可含有例如以上所述離子型或非離子型的潤濕劑、分散劑或乳化劑或它們的混合物。所述的制劑可以是濃縮形式的或稀釋形式的。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的制劑含有l(wèi)X102-1X10'2個/ral(液體)或lX102-1X10"個/g(固體)所述重組真菌菌株的孢子；更優(yōu)選的，所述的制劑含有1X103-lX10"個/ml(液體)或lX103-lXl(T個/g(固體)所述重組真菌菌株的孢子；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的制劑含有1X104-1X1Q8個/ral(液體)或lX104-1X1Q8個/g(固體)所述重組真菌菌株的孢子。制劑中孢子含量可根據(jù)劑型實際情況適當(dāng)增加或減少。適合采用本發(fā)明的制劑保護(hù)的對象或場所沒有特別的限制，可以是(但不限于)谷類作物(例如玉米，小麥，水稻，高粱)；田間、林間、種植院、暖房、果園和葡萄園中的觀賞作物、種植院作物和林木，例如棉花，煙草，蔬菜(例如豆類，油菜，葫蘆，萵苣，洋蔥，西紅柿，胡椒)，田間作物(如馬鈴薯，甜菜，落花生，大豆，油菜)，甘蔗，草地和林木(如玉米，高粱，紫花苜蓿)，種植院作物(茶葉，咖啡，可可，香蕉，油棕，椰子，橡膠，香料)，果園和小樹林(如核果，柑橘，獼猴桃，鱷梨，芒果，橄欖，胡桃)，葡萄園，暖房、花園或公園中的觀賞作物，花卉和灌木，樹林、種植院和花圃中的林木(包括落葉林木，常青林木)。防治昆蟲的方法本發(fā)明還提供一種防治昆蟲的方法，所述方法包括給予需要防治昆蟲的對象有效量的所述的孢子。將采用所述的孢子制劑施用于生長中的植物的合適方法包括固體播撒，葉面噴灑，液體灌溉等。優(yōu)選的施用方式是對葉施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，所述制劑的施用必需隨例如溫度、濕度、待處理區(qū)域和待處理植物等外界條件而改變。因此，施用比應(yīng)可在一較寬的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明制劑的使用頻率可由農(nóng)民、病害防治專業(yè)人士或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)預(yù)期效果來選擇。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明首次將真菌細(xì)胞感染昆蟲并寄生在昆蟲體內(nèi)的能力和北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的神經(jīng)毒性良好地結(jié)合在一起，從而大大提高了真菌的殺昆蟲效率。(2)本發(fā)明中對AaIT的編碼基因進(jìn)行了密碼子改造，從而可利用綠僵菌高效表達(dá)AaIT多肽，克服了現(xiàn)有技術(shù)中天然分離的AaIT基因難以在綠僵菌中表達(dá)的技術(shù)難題。(3)通過在AaIT的編碼基因的5'端添加MCL1信號肽的編碼序列，并以昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子來調(diào)控基因的表達(dá)，從而使得轉(zhuǎn)化有AaIT的重組真菌菌株可特異性在昆蟲血腔內(nèi)高表達(dá)。(4)利用所述的重組真菌孢子可制備成防治昆蟲的制劑(農(nóng)藥)，所述制劑施用方便，對有害昆蟲的殺傷效率高，并且對環(huán)境以及昆蟲以外的其它動植物沒有危害，屬于一種環(huán)境友好的制劑。(5)本發(fā)明首次揭示一種可用于指導(dǎo)外源蛋白在昆蟲血腔中特異性高效表達(dá)的啟動子。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1基因合成及載體構(gòu)建1.基因的構(gòu)建基因的設(shè)計如下，將北非蝎針對昆蟲的特異性神經(jīng)毒素多肽AaIT的氨基酸序列反編碼成殺蟲真菌偏好的基因，并在該基因的5'-端添加金龜子綠僵菌基因iC"(參見GenBank登錄號DQ238488或叫238489;或Wang,C.S.和StLeger，R.J.2006.AcollagenousprotectivecoatenablesJ/etar力izi咖朋j's。/h'aetoevadeinsectimmuneresponses,尸rocvVa"爿cac/〃W.103:6647-6652)的信號肽("SP，氨基酸序列為MRELSSVLALSGLLALASA)編碼序列和mRNA5'-非翻譯區(qū)。并且，在序列兩端分別設(shè)計5a/^/酶切位點以便于切割和連接。通過常規(guī)的方法人工合成該基因，合成的序列如圖l所示，并通過勘/^/酶切位點將之克隆入質(zhì)粒pUC57(Genescript公司)。2.載體的構(gòu)建為了達(dá)到使所述基因在昆蟲血腔中特異表達(dá)的目的，本發(fā)明人使用綠僵菌昆蟲血腔特異高表達(dá)基因#CZ7的啟動子(#CZ7pro)作為指導(dǎo)該基因表達(dá)的啟動子，將該啟動子克隆入表達(dá)載體，具體方法如下采用以下引物PcU(SEQIDNO:4):CGGGATCCAATCATGCAGCGCTATGAGA，(下劃線為Sa/z7#/酶切位點)；禾口PcL(SEQIDNO:5):CTTGGATCCCGGGATGGTCTAGGGAACGGAAA，(下劃線分別為5"/ffa/酶切位點)。以綠僵菌基因組DNA(常規(guī)方法制備)為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得基因ATG翻譯起始位點上游2769bp序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)S3/z^/酶切、純化后克隆入質(zhì)粒pGPS3Bar(參見Wang,C.S.禾口StLeger，R.J.2006.Acollagenousprotectivecoatenablesi/"efai"力izJ'〃歷aoj'sopiiaetoevadeinsectimmuneresponses.■ProcjVat7爿ca(/Scj'"5>/.103:6647-6652)的相應(yīng)位點中，得到質(zhì)粒pBarPc。為了驗證i/a7啟動子的調(diào)控特異性，本發(fā)明人利用以下引物TCCCTAGACCATCCCGTACCGGTCGCCACCATG(SEQIDNO:6);禾口CTGTCGACGGATCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA(SEQIDNO:7)。以質(zhì)粒pEGFP(Clontech)為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得G尸尸基因序列。然后，使用In-FusionDry-downPCR試劑盒(Clontech)將GF尸基因序列克隆到pBarPc的5^a/酶切位點得到質(zhì)粒pPcGFP。利用以下引物-ToxF(SEQIDNO:8):CACCAGACCAGCCCCTCATGGAACATCACACTCG;禾口ToxR(SEQIDNO:9):GTCGACGGATCCCCCTTAGTTGATGATGGTGGTAT。以前述構(gòu)建的攜帶AaIT編碼序列、#617信號肽編碼序列和#a7raRNA5'-非翻譯區(qū)的pUC57質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，使用In-FusionDry-downPCR試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pBarPc的5"鵬/酶切位點得到質(zhì)粒pMcllprAaIT，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)見圖2。實施例2真菌轉(zhuǎn)化及表達(dá)驗證前述構(gòu)建的表達(dá)載體pPcGFP和pMcllprAaIT經(jīng)5Va/酶切、線性化后使用真菌原生質(zhì)體的方法(參見Wang，C.S.和StLeger，R.J.2006.Acollagenousprotectivecoatenables#efar/_z'z_z'i//n朋isop7iaetoevadeinsectimmuneresponses.vProctVsZJ^cad〃1103:6647-6652)進(jìn)行金龜子綠僵菌菌株ARSEF549(購自美國農(nóng)業(yè)部蟲生真菌菌種保藏中心http:〃arsef.fpsnl.Cornell.edu/raycology/ARSEF—Culture—Collection,html#Catalog)的轉(zhuǎn)化，篩選獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子GFP-549和AalT-549。1.使用綠僵菌GFP-549轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)實驗在馬鈴薯瓊脂(PDA，Difco公司)培養(yǎng)基上，接種GFP-549孢子，25。C下培養(yǎng)20天后，收集分生孢子，分別接種于薩氏葡萄糖營養(yǎng)液(SDB,Difco公司)、基本培養(yǎng)基(葡萄糖10克/升，NaNO36克/升，KC10.52克/升，MgSO4.7H200.52克/升，KH2PO40.25克/升)以及離體的昆蟲血液(分離自煙草天蛾5齡幼蟲，65°C加熱處理5分鐘，13000rpm下離心5分鐘，取上清液即獲得)培養(yǎng)72小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白GFP的信號只有當(dāng)GFP-549轉(zhuǎn)化子在昆蟲血淋巴中培養(yǎng)時才表達(dá)。本發(fā)明人還以GFP-549孢子懸浮液感染煙草天蛾5齡幼蟲，3天后分離收集菌體，于熒光顯微鏡下檢測綠色熒光信號。以GFP-549孢子懸浮液感染煙草天蛾5齡幼蟲后的結(jié)果見圖3A，綠色熒光蛋白GFP的信號只有當(dāng)真菌侵染至昆蟲血腔時才表達(dá)。圖3B為圖3A的光學(xué)顯微鏡圖片。2.綠僵菌AaIT-549轉(zhuǎn)化子的生長和表達(dá)a.RT-PCR將轉(zhuǎn)化子AalT-549分別接種于腐生培養(yǎng)基薩氏葡萄糖營養(yǎng)液(SDB，購自Difco公司)和昆蟲血淋巴(Hemoly即h，分離自煙草天蛾5齡幼蟲，65。C加熱處理5分鐘，13000rpm下離心5分鐘，取上清液即獲得)中，在25'C溫度，180rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)。其中WT為同步處理的野生型金龜子綠僵菌菌株ARSEF549對照。培養(yǎng)24小時后，采用布氏漏斗、WhatmanN0l濾紙過濾法分別收集菌絲，取0.1克，用RNeasyminikit(Qiagen公司)試劑盒抽提總RNA，然后取1微克總RNA，使用oligo-dTprimer試劑盒(購自ABgene公司)制備單鏈cDNA。以ToxU(GCGTGAACTTTCTTCGGTTC(SEQIDNO:10))和ToxL(TAGCCCTTATCGGCGTAGTG(SEQIDNO:ll))為引物，以上述方法獲得的cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)的RT-PCR。分離擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果見圖3C，表明當(dāng)轉(zhuǎn)化子AalT-549在腐生培養(yǎng)基薩氏葡萄糖營養(yǎng)液中生長時毒素基因不表達(dá)，只有在昆蟲血淋巴中(包括離體)生長時才表達(dá)。b.時間序列RT-PCR將金龜子綠僵菌菌株野生型菌株ARSEF549與毒素基因轉(zhuǎn)化子AalT-549孢子接種于薩氏葡萄糖營養(yǎng)液(SDB，Difco公司)，25。C溫度，180rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)36小時，如上述方法過濾收集菌絲，再轉(zhuǎn)入到昆蟲血淋巴中(制備方法同a中所述)培養(yǎng)不同時間(如圖所示)，以同樣方法收集菌絲、提取總RNA及進(jìn)行單鏈cDNA制備并用作PCR模板。結(jié)果見圖3D，時間序列RT-PCR分析表明當(dāng)真菌在昆蟲血淋巴中生長時可以被快速表達(dá)。c.Western雜交試驗將轉(zhuǎn)化子AalT-549分別接種于腐生培養(yǎng)基薩氏葡萄糖營養(yǎng)液、基本培養(yǎng)基(葡萄糖10克/升，NaN036克/升，KC10.52克/升，MgS04.7H200.52克/升，KH2P040.25克/升)以及離體的昆蟲血液(制備同a中所述)中，采用如a所述同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)72小時，5000rpm離心5分鐘，收集上清液。用轉(zhuǎn)化子AalT-549感染煙草天蛾幼蟲U/朋o^caseW3)，收集剛死亡的幼蟲血淋巴，13000rpm下離心5分鐘，取上清液。用SDS上樣緩沖液將上述不同上清液樣本制成勻漿，經(jīng)16.5%Tris-TricineSDS-PAGE膠(Bio-Rad公司)分離后，用抗北非蝎毒液抗體(購自MicroPharm公司，英國)進(jìn)行雜交、染色后由ECL曝光成像。以18S核糖體rRNA基因作為陽性對照。結(jié)果如圖3E所示，表明轉(zhuǎn)化子AaIT-549在昆蟲血液離體培養(yǎng)可表達(dá)AaIT多肽(泳道3);AaIT-549轉(zhuǎn)化子感染剛死亡的煙草天蛾幼蟲后可在體內(nèi)表達(dá)AaIT多肽(泳道4-8);當(dāng)AalT-549轉(zhuǎn)化子在基本培養(yǎng)基或薩氏葡萄糖培養(yǎng)液中生長時，毒素多肽不會被表達(dá)(泳道l，2)。3.昆蟲注射試驗將轉(zhuǎn)化子AalT-549置于昆蟲血淋巴中離體生長，在72小時后，5000rpm離心5分鐘，收集上清液用于注射麗蠅(^^0/7^^0^/^")和煙草天蛾幼蟲，注射量分別為20和100微升，觀察兩種昆蟲的變化。以野生型金龜子綠僵菌菌株ARSEF549在昆蟲血淋巴中的離體培養(yǎng)物作為對照。結(jié)果見圖3F和圖3G，可見轉(zhuǎn)化子AalT-549的培養(yǎng)上清液可引起典型的蟲體收縮現(xiàn)象，其中圖3F上和圖3G左分別是麗蠅和煙草天蛾幼蟲注射后的情況；圖3F下或圖3G右分別是將野生型菌株549培養(yǎng)上清液注射麗蠅和煙草天蛾幼蟲后的情況。實施例3農(nóng)藥制劑的制備在馬鈴薯瓊脂(PDA，購自Mfco公司)培養(yǎng)基上，接種AalT-549孢子，在25。C下培養(yǎng)20天后，收集分生孢子，用0.05%吐溫-20(Sigma公司)配制各菌株孢子懸浮液。所述的農(nóng)藥制劑配方如表1:表1AalT-549孢子<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>懸浮液制備實施例4昆蟲生物測定為了比較野生型菌株ARSEF549與AaIT毒素基因轉(zhuǎn)化子AalT-549在殺蟲毒力上的差異，用0.05%吐溫-20配制各菌株孢子懸浮液，梯度孢子濃度分別從2xl07-lx105分生孢子/毫升。供試?yán)ハx分別選擇剛蛻皮5齡煙草天蛾幼蟲和埃及伊蚊U^/waeg;;/^)雌性成蟲(羽化后3天)，進(jìn)行生物測定，方法參見Wang,C.S.禾口StLeger，R.J.2006.Acollagenousprotectivecoatenables#etar/7J'zii/ys/2iso/7iaetoevadeinsectimmuneresponses,尸j"oc淑7XcW5W腦.103:6647-6652。結(jié)果表明，對于煙草天蛾和埃及伊蚊而言，AalT-549比野生型ARSEF549造成50%死亡率所需的菌株孢子濃度分別降低22倍和9倍；對于煙草天蛾和埃及伊蚊而言，施加AalT-549比野生型ARSEF549的50%存活時間分別縮短約30%和40%(表2;圖4)。通過測定蟲糞干重，毒素轉(zhuǎn)化菌株AaIT-549比野生型感染時的煙草天蛾取食量下降約50%(圖5)。表2ARSEF549(WT)及AalT-549對煙草天蛾及埃及伊蚊的毒力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*使用檢測的孢子濃度為2x107分生孢子/毫升；**使用檢測的孢子濃度為1x105分生孢子/毫升;括號內(nèi)數(shù)值為95%置信區(qū)間；LD5。，致死中量；ST5。，50%存活率。實施例5啟動子變體采用常規(guī)的基因合成方法合成SEQIDNO:3所示序列的啟動子的變異形式I，該變異形式將SEQIDNO:3序列的第63位的G—C;采用常規(guī)的基因合成方法合成SEQIDNO:3所示序列的啟動子的變異形式II，該變異形式將SEQIDNO:3序列的5'端加上2個核苷酸GT。采用與實施例2類似的方法，檢測由變異形式的啟動子指導(dǎo)的^尸在昆蟲血腔中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP的信號只有當(dāng)轉(zhuǎn)化子在昆蟲血淋巴中培養(yǎng)時才表達(dá)。因此說明，上述的變異形式的啟動子也能夠指導(dǎo)基因特異性地在昆蟲血腔中進(jìn)行表達(dá)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉蝎毒素基因轉(zhuǎn)化的殺蟲真菌工程菌株及應(yīng)用<130>071836<160〉11<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>383<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>融合基因〈400〉1Cggg3tCCtgttcatgg幼catcacactcgctaattcgttcctggctcaaattcttttcctcggttctcgccctttcgggcttgctggccgtcgatagcagcgg,ggcccccgagtgcaccaaggtccactacgccgataagggctacctgaacgatgcctggagatcaccatcatcaactaaggatcccgctgactctggacaccaactgtattcactcg60gttccctagaccatcatgcgtgaactttct120ctggcgtcggcaaagaagaacggctacgcc180ctgctgagcaactactgcaacaaccagtgc240tgctgcctgctgagctgctactgcttcggc300agcgatacccgtaagagctactgcgatacc360383<210〉2<211>70<212>PRT<213>北非蝎(Androctonusaustralis)<400〉2LysLysAsnGlyTyrAlaValAspSerSerGlyLysAlaProGluCys151015LeuLeuSerAsnTyrCysAsnAsnGinCysThrLysValHisTyrAla202530AspLysGlyTyrCysCysLeuLeuSerCysTyrCysPheGlyLeuAsn354045AspAspLysLysValLeuGlulieSerAspThrArgLysSerTyrCys505560AspThrThrlielieAsn6570<210〉3<211〉2769<212〉DNA<213>綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)<220><221>misc—feature<223〉啟動子<400>3￡L￡LtC￡LtgC￡LgcgctatgagatxccaELgtgaatgactcgct603tgtgtg3CgtagcattgatgtCCgCgC3gtcctttccacgC3tagt3gC120ataaaatatgacaatalgattcaatctagctgcatgtatagagtaatttagacacggtgt180gctaagattggcccctcatggcgag卿agtaatacc3gcgattcgctttccgggtgccg240ctctccaatgccttgctgtcaggcactttgggcggtatgcatggactccccttgtaacgc300aaatattaaatatagtgcttatagcgtttaatgattcgtaaacggctgacag犯gcccga360tgtggcgatctattggatgatgcaacagcg3CtgCg3CELtaatttcttct420ctcgctatttgagc柳鄉(xiāng)atttgataggacacgcacgaccccgtcagc480ctggtatgtatgtttgagttgcatgcggacttgacagccaagccgggtgatgtttattgc540tcgcaacccgctctagaagg犯gtgtctggtcgcgcaaacatgacaggaaC肌gg3gC犯600ccccaaatgattatcattttctctgtggaggaaatgattcgcaggataacagagctctac660C3gtggg,3ttg3tg3tttccca33gcaggcgcgc鄉(xiāng)720ggctgcgcacattcttccgcacgcgcaacgcatgatcaatact犯ttaaa780gatgattccattcg鄉(xiāng)卿tgaccgacgcUgtgcctgg犯gc犯t兆cattcgcatat840taattcatccgactcgagtcgggctatttgcacggcgctaagctgtttttgtgttggcgg900ccttggtcacacccatgctcgcgcccgctttttt肌犯3Cttgacattgttttcaagcca960ttcttgaacaacttgagagc3gtca3gacctaagtcgcat3朋tCgCC3t1020ttccgcttcctt"Uggggatatttataccattcaaagccttttcattactctgccactac1080tgtcggcgctgctcgaacccatccatccgag鄉(xiāng)cgacggctcttccggc1140tgcggttcagggatacgtagtcgtttccccgatttctggagaccctactccgcactgctc1200ctcctcctacttgctctgtggcatgtccaccggttagtcatgttggtggttgaggttgtg1260cgt幼tttgc3geigttatccgaictgct3cggcaagagtatcgcgagggttgcgccgcgac1320atctggaaccttcaactagctccgcttgtgttgttggattgactcatacgtgataacc犯13803g3gtCt犯Ctg犯gacgctaccctgagccacgtcctattctcccccaaaagcacaatgt1440ggcgggagtctcccttcatccgcgtcatgtgggcUccgtattaggacgccgggcagggt1500taccctagctggcgatgatggcatctaccgaaattccgccaccttctggccacatttggc1560g3gtg3gtgtggggttg33tgcagaatcttggCCg3tggg1620cgtcttgggagggagtagca犯gtacgt3Caccgtgcgccttgctagcca1680tcccttgcgccatgcttataaagtaatccc"ggtgccgagctggacagggggaccatga1740gtatgagcaggaccagacacgttttccccattggctcacattgctcggaa1800ca鄉(xiāng)cgatgagtactacgctccacaaccgcgtttgcagcgctaacgtctttagcatggc1860atagtgtgttggt鄉(xiāng)3tgggtcact3ggt1920aggttctcaaccgccgtagtgatgccgtgcgtgcttaaacaagggcggac1980ggggtttccaaaatgtcggtcaatctatgtaccgtcgagcctgcggtttattcccatcac2040tctggattgccc柳gg卿ctcgttgtgggctgtcaatttatcccacag2100cttccatggccaccttcaaattacattgctgacgcgtgacgatccatctc2160aacagatccattc犯tgt犯aaatgtcaaagagtattcagcccgaatctcttgcattgtc2220acgtatactagtacatacgagcacctattcta犯aggtgg2280a犯catcatctcacagcaaggcggatgccagcgcgttgcc2340tcactccacaccctgcaaggcgcggcctgtgtcctagaatacatatgtgc2400agtatax;atgatagagtctattsctgaaaagggg站肪tggagcccagaatgtcaatagc24603tC3ggCC3tggcttggcggUg3cc鄉(xiāng)ggctgccaagtcccgctgactcttgaccaag2520atttcgattcatgcaggcccc犯tagcgcaaatgattgtggggatgacgcCELgtgCELELgC2580agg犯tgcaggtacaagtttgtataattcttctgaaatatatatatcagtagtgactccg2640gcaatccgtaccatcttgcgccaccagaccagctgttcatggaacatcacactcgctgac2700tctggacaccaactgtattcactcgctaattcgttcctggctcaaattcttttccgttcc2760ctagaccat2769<210〉4<211〉28<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉4cgggatccaatcatgcagcgctatgaga28<210〉5<211>32<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>5cttggatcccgggatggtctagggaacgga<210〉6<211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉6tccctagaccatcccgtaccggtcgccaccatg<210>7<211〉35<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物<400〉7ctgtcgacggatcccttacttgtacagctcgtcca<210〉8<211>34<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc一feature〈223〉引物<400>8caccagacc3gcccctcatgga3C3tc3cactcg<210〉9<211〉35<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc一feature<223〉引物<400〉9gtcgacggatcccccttagttgatgatggtggtat<210〉10<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉10gCgtg33CtttcttCggttC<210〉11<211〉20<212〉DM<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400〉11tagcccttatcggcgtagtg權(quán)利要求1.一種編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQIDNO1中第163-375位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO1中第106-375位所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO1中第1-375位所示的核苷酸序列；或(d)與SEQIDNO1中第163-375位有至少95％相同性，且編碼SEQIDNO2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌中表達(dá)。2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制備防治昆蟲的制劑。3.—種昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子，其特征在于，所述的啟動子選自下組(1)具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)在嚴(yán)格條件下能夠與(1)限定的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸；或(3)與SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)功能的多核苷酸。4.權(quán)利要求3所述的啟動子的用途，其特征在于，所述的啟動子用于指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異性表達(dá)。5.—種構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物從5'至3'依次含有以下元件權(quán)利要求3所述的啟動子；和目的基因。6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建物，其特征在于，在啟動子和目的基因之間，還包含核糖體翻譯識別元件，和/或信號肽編碼元件。7.如權(quán)利要求5或6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的目的基因是昆蟲毒素多肽的編碼元件；所述的核糖體翻譯識別元件具有SEQIDNO:1中第9-105位的核苷酸序列；所述的信號肽具有SEQIDNO:2中l(wèi)-19位所示的氨基酸序列。8.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的昆蟲毒素多肽的編碼元件為北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件。9.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的編碼元件選自下組(i)具有SEQIDNO:1中第163-375位所示的核苷酸序列；(ii)與SEQIDNO:1中第163-375位有至少95%相同性，且編碼SEQIDNO:2中20-89位所示氨基酸序列的核苷酸序列，并且所述的多核苷酸序列可在真菌中表達(dá)。10.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求l所述的多核苷酸或權(quán)利要求5所述的構(gòu)建物。11.一種細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有權(quán)利要求10所述的載體；或其基因組中整合有外源的權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求5所述的構(gòu)建物。12.如權(quán)利要求ll所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是重組真菌細(xì)胞。13.—種孢子，其特征在于，所述的孢子由權(quán)利要求12所述的真菌細(xì)胞產(chǎn)生。14.一種防治昆蟲的制劑，其特征在于，所述的制劑含有(a)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞和/或權(quán)利要求13所述的孢子；以及(b)農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。15.—種防治昆蟲的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要防治昆蟲的對象或場所施用權(quán)利要求13所述的孢子。16.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求3所述的昆蟲血腔特異表達(dá)啟動子，作為啟動子元件。全文摘要本發(fā)明公開了一種優(yōu)化的編碼北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的多核苷酸序列，其適于在真菌中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明還公開了一種可表達(dá)北非蝎神經(jīng)毒素多肽AaIT的真菌菌株。本發(fā)明還公開了一種可用于防治昆蟲的制劑，所述制劑對環(huán)境以及昆蟲以外的其它動植物沒有危害，屬于一種環(huán)境友好的制劑。本發(fā)明還公開了一種可用于指導(dǎo)目的基因在昆蟲血腔中特異表達(dá)的啟動子。本發(fā)明首次將真菌細(xì)胞可感染昆蟲并寄生在昆蟲體內(nèi)的特性和昆蟲毒素多肽的毒性良好地結(jié)合在一起，大大提高了真菌的殺昆蟲效率。文檔編號C12N15/63GK101307313SQ20071004081公開日2008年11月19日申請日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2007年5月18日發(fā)明者呂丁丁,王成樹申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院