專利名稱：Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物及其編碼核酸和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及凝集素受體Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60 聚合物及其編碼這些多肽的核酸分子和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Dectin-1基因定位在染色體12pl3，屬于II型凝集素受體，分為胞內(nèi)，跨膜以及 胞外三部分。其中胞外段含有單個(gè)C型凝集素樣序列(C-type lectin-like domains, CTLD)序列以及不含Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，其中在C型凝集素樣序列內(nèi)含有QPD模序(可以 識別半乳糖和N-乙酰氨基半乳糖)；胞內(nèi)段含有免疫受體酪氨酸激活基序 (immunorec印tor tyrosine-based activation-like motif， ITAM)。 Dectin-l由于 剪切位點(diǎn)不同，導(dǎo)致形成兩種主要有功能的受體形式以及一些無功能的小的多肽形式 存在。兩種功能受體分別命名a， e， a受體為約33kd的糖蛋白，P受體胞外部分只
含有單個(gè)c型凝集素樣序列，缺少頸部區(qū)域，頸部區(qū)域存在與否可能與識別和內(nèi)化e-
葡聚糖作用有關(guān)。Dectin-1主要表達(dá)在與免疫相關(guān)的器官，如脾，胸腺，淋巴結(jié)等， 而在腦，目艮，肌肉等中不表達(dá)。在細(xì)胞中Dectin-l主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞， 中性粒細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞上，在部分T細(xì)胞中也有表達(dá)。
現(xiàn)有技術(shù)表明，Dectin-1作為一種模式識別受體，它能認(rèn)識各種l， 3和1, 6連 接的e-葡聚糖，但是不識別單糖。可以結(jié)合和內(nèi)化酵母聚糖，也可以結(jié)合完整的酵母。 海帶聚糖，磷酸化葡聚糖可以競爭抑制e-葡聚糖與Dectin-l的結(jié)合，抑制e-葡聚糖 的生物學(xué)功能。Dectin-l作為一種吞噬受體，介導(dǎo)e-葡聚糖的吞噬與巨噬細(xì)胞的活化， 在機(jī)體的真菌感染中發(fā)揮著重要的功能。Dectin-l能夠吞噬致病性真菌，促進(jìn)ROS的 產(chǎn)生，從而殺滅病原體，同時(shí)Dectin-1能夠激活下游信號，促進(jìn)TNF- a ， IL-12， IL-10, IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)解機(jī)體的免疫功能。最近的研究表明，Dectin-l介導(dǎo)其信 號傳導(dǎo)可以與TLR的相互協(xié)同作用，提高細(xì)胞因子表達(dá)水平和殺滅病原微生物的能力。
現(xiàn)在的研究表明，Dectin-l也能夠識別T細(xì)胞表面的分子，促進(jìn)T細(xì)胞的活化。 到目前為止，這種存在T細(xì)胞表面的Dectin-l的配體分子還沒有被鑒定。另外，很多c型凝集素受體不僅能夠識別碳水化合物，還能夠識別體內(nèi)的內(nèi)源性配體分子，包括 蛋白質(zhì)，脂類分子等，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。篩選Dectin-l的內(nèi)源性配體分 子，為研究Dectin-l在免疫系統(tǒng)中的功能以及進(jìn)一步闡明他們的信號傳導(dǎo)機(jī)制奠定基 礎(chǔ)，并為以Dectin-l為藥物靶點(diǎn)的藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
Hsp60在進(jìn)化上是高度保守的蛋白質(zhì)之一，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) 的折疊，阻止蛋白質(zhì)的聚集，對于細(xì)胞的生存是非常必需的。在哺乳動(dòng)物中，Hsp60 定位在線粒體內(nèi)，在外界環(huán)境的壓力下，包括應(yīng)激和病態(tài)條件等，Hsp60可以易位到 胞漿，細(xì)胞膜，還可以分泌到細(xì)胞外；在外界損傷的情況下，細(xì)胞壞死也可以釋放大 量的Hsp60。在健康人體的血漿中，存在著低水平的Hsp60，隨著年齡的升高，Hsp60 水平逐漸下降。但在高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病以及內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中， 血漿水平的Hsp60明顯升高。近年來研究表明Hsp60在自身免疫性疾病及慢性感染等 的發(fā)病中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在應(yīng)激狀態(tài)下，包括感染等，Hsp60過表達(dá)或異位 表達(dá)可以作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識別，誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體 的免疫學(xué)功能。另外，在細(xì)胞受到外界刺激導(dǎo)致細(xì)胞壞死也可以釋放大量Hsp60到血 漿中，以及Hsp60可以通過一些未知的分泌途徑分泌到血漿中，這些可溶性的Hsp60 能夠調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。這種血漿中的Hsp60在 機(jī)體中發(fā)揮著一種調(diào)節(jié)免疫的作用，因此通常把血漿中的Hsp60可以作為一種危險(xiǎn)信 號。在固有免疫系統(tǒng)中，Hsp60能夠激活促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，包括TNF-a, IL-12 等促炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)激活細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，如CD80， CD86,促進(jìn)抗 原呈遞細(xì)胞的成熟等。在獲得性免疫系統(tǒng)中，Hsp60能夠降低T細(xì)胞的趨化功能，增 強(qiáng)T細(xì)胞的黏附。特別在T調(diào)節(jié)細(xì)胞中，Hsp60能夠促進(jìn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，提高IL-10， TGF-ie的分泌，從而調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展。因此專家推測，Hsp60可能作為一種細(xì)胞 因子，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。
Hsp60激活自身免疫系統(tǒng)作為它的新功能，具有非常廣泛的功能重要性，然而對 它發(fā)揮功能的機(jī)制目前尚不清楚。Hsp60的細(xì)胞因子效應(yīng)可能是通過TLR-2/4受體發(fā) 揮其功能的，進(jìn)而激活NFkappaB的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)抗原遞逞細(xì)胞的成熟以及細(xì)胞因 子的產(chǎn)生。然而，越來越多的證據(jù)表明，在抗原遞逞細(xì)胞表面，存在Hsp60的吞噬受 體，并且該受體發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，但是目前還沒有被鑒定。為了更進(jìn)一步的對Hsp60的免疫調(diào)節(jié)功能的研究，鑒定免疫學(xué)細(xì)胞上的Hsp60受體顯得非常必要。 Hsp60受體的鑒定，將為闡明Hsp60在自身免疫性疾病中的生物學(xué)功能以及以Hsp60 作為免疫佐劑或自身免疫性疾病治療藥物的研究提供必要的理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供凝集素受體Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物及其編碼這 些多肽的核酸分子及其應(yīng)用。
本發(fā)明公開了凝集素受體Dectin-l與其內(nèi)源性配體熱休克蛋白Hsp60的相互作 用，更具體地說，熱休克蛋白Hsp60作為凝集素樣受體Dectin-l的內(nèi)源性配體分子， 以及Hsp60通過Syk酪氨酸激酶介導(dǎo)其生物學(xué)活性。其中Hsp60中的氨基酸多肽片斷 P540 (aa540-573)，介導(dǎo)了 Hsp60與Dectin-l的結(jié)合。
本發(fā)明所述的集素受體Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物，其中，
a) 包含分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述分離的哺乳動(dòng) 物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域由與SEQ ID NO: 2所示的Hsp60 Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu) 域有至少70%相同性的氨基酸序列組成；
或，
b) 包含Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域由與SEQ ID NO: 2所示的Hsp60 Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域有至少70%相同性的氨基酸序 列組成，條件是所述多肽不是全長Hsp60多肽；
或，
c) 包含SEQ ID NO: 2所示的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。 所述的多肽中做了保守性氨基酸置換。
所述的分離的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO: 2所示的大約540—573位氨基 酸所示的氨基酸序列組成。
本發(fā)明還提供了鑒定化合物的方法，該化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗 原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的能力，該方法包括
使含Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的無細(xì)胞混和物與測試化合物接觸； 測定測試化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力，從而鑒定出能調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的化合物；或，
使表達(dá)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞與測試化合物接觸；
測定測試化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力，從而鑒定出能調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的化合物。
上述方法包括調(diào)節(jié)Hsp60多肽或其Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性，或，包括調(diào)節(jié) Hsp60或其Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)。
本發(fā)明提供了凝集素受體Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物的應(yīng)用，所述的應(yīng) 用包括但不限于免疫佐劑、調(diào)節(jié)免疫功能、治療包括內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫 疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明通過酵母雙雜交，免疫沉淀以及細(xì)胞流式等實(shí)驗(yàn)證明了 Hsp60作為Dectin-l 的內(nèi)源性配體分子，P540介導(dǎo)他們之間的結(jié)合。Hsp60與它的受體結(jié)合以后激活氨酸 激酶Syk，從而促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案證明Hsp60作為Dectin-l的內(nèi)源性配體分子并激活syk 酪氨酸激酶介導(dǎo)生物學(xué)功能
通過酵母雙雜交篩選，發(fā)現(xiàn)Hsp60能夠與Dectin-l胞外段(aal 12-247)相互作用， 能很強(qiáng)的激活酵母報(bào)告基因的表達(dá)，表明它們之間存在很強(qiáng)的相互作用；
通過免疫沉淀技術(shù)，細(xì)胞流式技術(shù)，免疫熒光以及能量共振等實(shí)驗(yàn)，證明了Hsp60 作為Dectin-1的內(nèi)源性配體，能夠被Dectin-1吞噬；
通過免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Hsp60能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，在抗原呈遞細(xì)胞中，Hsp60 能夠激活Syk酪氨酸激酶，上調(diào)CD80， CD86的表達(dá)水平，促進(jìn)抗原遞逞細(xì)胞的成熟；
通過缺失突變Hsp60研究分析Hsp60與Dectin-l結(jié)合的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Hsp60的氨基 酸片斷P540 (aa540-573)能夠與Dectin-l結(jié)合并吞噬。
本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，該蛋白包括由分離的Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的 第一多肽和非Hsp60的第二多肽。
本發(fā)明還提供了一種載體，它包含下列的核苷酸序列其中的一種 a)編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述分離的哺乳動(dòng) 物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 2所示的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域有70%的氨
基酸序列相同性；
b) 編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列 在45。C6XSSC中、然后在50—65。C下用0.2SSC和0.1%SDS洗滌一遍或多遍后 與編碼Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交；
c) 如SEQIDNO: 1所示的編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。


圖1顯示了 Dectin-l和Hsp60， P540在酵母中的相互作用。
圖2顯示了 Dectin-l和Hsp60免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明Hsp60能夠結(jié)合Dectin-1。
圖3顯示了 Hsp60能夠劑量依賴地結(jié)合到表達(dá)Dectin-l的細(xì)胞表面。
圖4顯示了不同濃度的Hsp60能夠結(jié)合到固定Dectin-1的芯片表面。
圖5顯示了 Dectin-1能夠結(jié)合并吞噬熒光標(biāo)記的P540。
圖6顯示了 Hsp60能夠激活Syk酪氨酸激酶的磷酸化。
圖7顯示了 Hsp60能夠通過Syk酪氨酸激酶促進(jìn)抗原遞逞細(xì)胞的成熟。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
人Hsp60的cDNA以及P550的cDNA通過分子生物學(xué)技術(shù)分別連接到pGEX-4T-l 載體，轉(zhuǎn)化DH5a，通過氨芐青霉素篩選到的陽性克隆，通過質(zhì)粒純化，測序，證明 所挑選的克隆序列正確，分別命名為pGEX-4T/Hsp60 ， pGEX-4T/P540 。用 pGEX-4T/Hsp60 ， pGEX-4T/P540質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，挑克隆接種到LB培 液中，37'C培養(yǎng)，菌液達(dá)到OD0.6-0.8時(shí)，IPTG濃度0. 2mM的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后收細(xì)胞，裂解。按照GST純化手冊，通過GST珠子純化目的蛋白。 通過SDS-PAGE和Western blot鑒定所純化的產(chǎn)物即為目的蛋白Hsp60以及P540。
實(shí)施例2 :
人的Dectin-l的胞外段(aall2-247) cDNA通過分子克隆技術(shù)，以EcoRI與BamHI 位點(diǎn)接入pGBKT7載體，隨后轉(zhuǎn)化DH5a，通過卡拉霉素篩選到陽性克隆，挑選單克隆 菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。結(jié)果表明，人的Dectin-l的胞外段(aall2-247)的cDNA
序列與載體的讀框一致。該載體稱之為pGBKT7/CTLD，將pGBKT7/CTLD與pGADT7 載體共轉(zhuǎn)入AH109酵母，培養(yǎng)基上篩選，結(jié)果表明，pGBKT7/CTLD沒有自激活現(xiàn)象。 按照Clontech公司酵母雙雜交操作手冊，采用pGBKT7-CTLD進(jìn)行篩選人胸腺的 cDNA文庫。挑選能生長在SD-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal培養(yǎng)基并且變藍(lán)的陽性克隆， 按照操作手冊進(jìn)行3輪篩選后，對篩選到的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒分離和測序。測序結(jié)果 在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)三個(gè)陽性克隆編碼Hsp60蛋白分子。為了確定Hsp60 分子與Dectin-l的結(jié)合區(qū)域，本發(fā)明將Hsp60進(jìn)行缺失突變，其中的分離的核酸分子， 它包含下列的核苷酸序列的 一種
編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述分離的哺乳動(dòng)
物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 2所示的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域有70%的氨基酸
序列相同性；
編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列 在45'C6XSSC中、然后在50—65"C下用0.2SSC和0.1%SDS洗滌一遍或多遍后與編 碼Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交；
如SEQ ID NO: 1所示的編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。 所述的分離的核酸分子，其中分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO: 2的大約540—573位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼融合蛋白。 所構(gòu)建的融合蛋白，該蛋白包括由分離的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的第一多肽和 非Hsp60的第二多肽。
本發(fā)明構(gòu)建了一種載體，它包含有上述的核酸分子。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hsp60的氨基酸多肽片斷P540 (aa540-573)能夠與Dectin-l的結(jié) 合。如圖1所示，Hsp60與P540能夠很強(qiáng)的激活報(bào)告基因的表達(dá)，半乳糖苷酶活性 很高，說明在酵母中，Hsp60與Dectin-l相互作用，激活報(bào)告基因的表達(dá)，是通過 Hsp60的氨基酸540-573這一肽段介導(dǎo)的。
實(shí)施例3
人Dectin-l的cDNA通過分子生物學(xué)技術(shù)按照pCDNA3.1/Myc載體的讀框克隆到 該載體。其中，人Dectin-l的cDNA終止密碼子缺失，能夠產(chǎn)生Dectin-l/Myc融合蛋
白。測序表明所構(gòu)建的該質(zhì)粒是正確的，命名為pMyc-Dectin-l。用pMyc-Dectin-l轉(zhuǎn) 染HEK293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，細(xì)胞在裂解液中裂解，進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。 步驟如下
1. 實(shí)施例1中原核表達(dá)的Hsp60在4'C與GST sepharose 4B珠子輪轉(zhuǎn)孵育2小 時(shí)，用冷的PBS洗滌一次。
2. 步驟1的珠子然后與上述的細(xì)胞裂解液在fC輪轉(zhuǎn)孵育4小時(shí)后離心，用冷 的裂解緩沖液充分把珠子洗3遍，加入上樣緩沖液煮10分鐘進(jìn)行免疫印記 實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果表明，Hsp60能夠與Dectin-l相結(jié)合，進(jìn)一步證明了他們之間的相互作用(圖 2所示)。
實(shí)施例4
實(shí)施例1原核表達(dá)的Hsp60按照pierce公司的操作手冊進(jìn)行熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記 的產(chǎn)物分裝儲存在-2(TC。 pMyc-Dectin-l轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，用 冷得PBS洗3遍，與熒光標(biāo)記的Hsp60在4'C孵育l小時(shí)，再用PBS充分洗3遍，進(jìn) 行細(xì)胞流式分析。在研究受體配體的競爭抑制分析中，上述細(xì)胞預(yù)先與未標(biāo)記的Hsp60 孵育30分鐘，然后加入熒光標(biāo)記的Hsp60。流式分析的結(jié)果如圖3所示，表明Hsp60 能夠劑量依賴性的結(jié)合到表達(dá)人Dectin-l表達(dá)的細(xì)胞表面，并且未標(biāo)記Hsp60能夠競 爭抑制熒光標(biāo)記的Hsp60結(jié)合到Dectin-1表達(dá)的細(xì)胞表面。這種特性表明，Hsp60與 Dectin-1的結(jié)合是一種受體與配體的關(guān)系。
實(shí)施例5
原核表達(dá)Dectin-l胞外段并純化。通過Biacore sensor (Biacore， Uppsala, Sweden)直 接分析他們之間的相互作用。預(yù)先在芯片上固定1000單位的Dectin-l純化產(chǎn)物，然后 用不同濃度梯度的Hsp60進(jìn)樣分析。生物傳感器能直接研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相 互作用，結(jié)果表明，Hsp60能夠劑量依賴地結(jié)合到Dectin-l連接的生物芯片上，Kd分 別為1.04e-6，進(jìn)一步說明他們之間能夠相互作用(圖4)。
實(shí)施例6HEK3T3細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Dectin-l質(zhì)粒，培養(yǎng)48小時(shí)，冷的PBS洗3遍后，與熒光 標(biāo)記的P550在4'C孵育30分鐘，然后用冷的PBS洗3遍，用4%的福爾馬林固定10 分鐘，然后洗滌，封片。若為吞噬分析則繼續(xù)37i:孵育15分鐘后再固定，步驟同上。 最后進(jìn)行共聚焦分析。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，綠色熒光標(biāo)記的為P540，紅色熒光的為 Dectin-1，結(jié)果表明Dectin-l能夠結(jié)合并吞噬P550，說明Dectin-l能通過P540結(jié)合并 吞噬hsp60 (圖5)。
實(shí)施例7
8 10周的雄性BALB/c小鼠通過預(yù)處理，取腹腔巨噬細(xì)胞，37'C培養(yǎng)2小時(shí)后，加 入syk抑制劑或?qū)φ眨?小時(shí)后分別加入Hsp60至10ug/ml， 37。C孵育10分鐘后，收 集細(xì)胞，裂解和蛋白定量后用磷酸化抗體進(jìn)行免疫印記分析。結(jié)果顯示，Hsp60能夠激 活syk酪氨酸的磷酸化，而經(jīng)過熱失活的Hsp60不能夠激活Syk?，F(xiàn)有技術(shù)研究表明， Hsp60能夠激活Erkl/2， JNK以及P38信號通路，本發(fā)明進(jìn)一步研究他們的活化是否是 依賴于syk酪氨酸激酶的活化。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Syk酪氨酸激酶的抑制劑 piceatonnal能明顯抑制Erkl/2以及P38的磷酸化，但是不夠影響JNK的磷酸化，表 明Erkl/2以及P38的活化受Syk調(diào)控的。本發(fā)明證實(shí)了 Hsp60能夠激活Syk酪氨酸激 酶，并且Syk在Hsp60發(fā)揮生物學(xué)功能的信號傳導(dǎo)過程中有非常重要的功能(圖6)。
實(shí)施例8
8 10周的雄性BALB/c小鼠通過預(yù)處理，取腹腔巨噬細(xì)胞，37'C培養(yǎng)2小時(shí)后，加 入syk抑制劑或?qū)φ眨?小時(shí)后加入Hsp60至10ug/ml，培養(yǎng)18小時(shí)收集細(xì)胞，與不 同的共刺激分子抗體分別孵育30分鐘后用PBS洗3遍，然后進(jìn)行細(xì)胞流式分析。結(jié)果 表明，Hsp60能明顯上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞表面共刺激分子CD80, CD86的表達(dá)，而Syk抑 制劑能明顯抑制巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD80, CD86的表達(dá)。CD80，CD86作為共刺激 分子能夠?yàn)門細(xì)胞的活化提供第二信號，他們表達(dá)的降低巨噬細(xì)胞不能有效的為T細(xì) 胞的活化提供第二信號。本發(fā)明結(jié)果證實(shí)，Hsp60能夠激活抗原呈遞細(xì)胞，有效的介導(dǎo) 獲得性免疫的活化。
SEQUENCE LISTING
<110>復(fù)旦大學(xué)
<120> Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物及其編碼核酸和應(yīng)用 <130> 11 <160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 102
<212> DNA
<213>哺乳動(dòng)物
<400> 1
actacagcag aagttgtagt cacagaaatt cctaaagaag agaaggaccc tggaatgggt 60
gcaatgggtg gaatgggagg tggtatggga ggtggcatgt tc 102
<210> 2 <211> 33 <212> PRT <213>哺乳動(dòng)物 <400> 2
Thr Ala Glu Val Val Val Thr Glu He Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro 15 10 15
Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met 20 25 30
Phe
權(quán)利要求
1、Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物，其特征是，包含分離的哺乳動(dòng)物Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述分離的哺乳動(dòng)物Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域由與SEQ ID NO2所示的Hsp60 Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域有至少70％相同性的氨基酸序列組成；或，包含Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述的Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域由與SEQID NO2所示的Hsp60 Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域有至少70％相同性的氨基酸序列組成，條件是所述多肽不是全長Hsp60多肽；或，包含SEQ ID NO2所示的Dectin-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物，其特征是，所 述的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽做了保守性氨基酸置換。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物，其特征是，所 述的分離的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO: 2所示的540—573位氨基酸所 示的氨基酸序列組成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Dectin-l與熱休克蛋白Hsp60聚合物，其中所述的分 離的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫 功能中的用途。
5、 一種分離的核酸分子，它包含下列的核苷酸序列的一種編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-I結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述分離的哺 乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO: 2所示的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域有70% 的氨基酸序列相同性；編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中所述的核苷酸 序列在45°C6XSSC中、然后在50—65。C下用0.2SSC和0.1%SDS洗滌一遍或多 遍后與編碼Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 雜交；如SEQ ID NO: 1所示的編碼分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸 序列。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l 結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO: 2的540—573位氨基酸所示的氨基酸序列組成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分離的哺乳動(dòng)物Dectin-l 結(jié)合結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫功能中的用 途。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼融合蛋白。
9、 一種融合蛋白，該蛋白包括由分離的Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的第一多肽和 非Hsp60的第二多肽。
10、 一種載體，它包含有權(quán)利要求5所述的核酸分子。
11、 一種介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的方法，該方 法包括調(diào)節(jié)Hsp60多肽或其Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性。
12、 一種介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的方法，該方 法包括調(diào)節(jié)Hsp60或其Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)。
13、 一種鑒定化合物的方法，該化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞 細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的能力，該方法包括使含Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的無細(xì)胞混和物與測試化合物接觸； 測定測試化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力，從而鑒定出能調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的化合物。
14、 一種鑒定化合物的方法，該化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞 細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的能力，該方法包括使表達(dá)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞與測試化合物接觸； 測定測試化合物調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力，從而鑒定出能調(diào)節(jié)Dectin-l結(jié)合結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)免疫功能的化合物。
15、 權(quán)利要求1的Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物在制備免疫佐劑、調(diào)節(jié) 免疫功能或治療自身免疫疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及凝集素受體Dectin-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物及其編碼這些多肽的核酸分子和應(yīng)用。通過酵母雙雜交，免疫沉淀以及細(xì)胞流式等實(shí)驗(yàn)證明，Hsp60通過其Dectin-1結(jié)合域與Dectin-1相互作用，進(jìn)而激活酪氨酸激酶Syk，介導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的成熟，分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的生物學(xué)功能。本發(fā)明提供了至少包括以Hsp60及其Dectin-1結(jié)合域作為疫苗佐劑、調(diào)節(jié)免疫功能、治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫性疾病等方面的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK101096386SQ20071004165
公開日2008年1月2日 申請日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者謝建輝, 亮 郭, 聞?dòng)衩? 陳曉寧, 顧建新 申請人:復(fù)旦大學(xué)