專利名稱：一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種獲得高產(chǎn)量鵝型 溶菌酶的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶是一種堿性球蛋白，全稱為1,4-N-溶菌酶或者粘肽N-乙
?；邗Ｋ饷浮Ｋ芩饧?xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙
酰葡萄糖胺之間的e-i，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在細(xì)菌內(nèi)部滲透壓作 用下導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，達(dá)到殺菌效果。
在臨床上，溶菌酶對(duì)眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎癥均有一定
療效，特別是對(duì)急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。 與抗生素聯(lián)合使用，對(duì)于嚴(yán)重的急性炎癥亦有一定療效。在治療皮膚病方面， 溶菌酶亦有廣泛用途，可用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳濕 疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對(duì)于帶狀皰疹，內(nèi)服溶菌酶即可。此外，溶菌 酶可用于小兒或乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內(nèi)膜腫脹等，能夠使黏膜腫脹 很快消除，使痰液變稀、呼吸通暢。溶菌酶亦可預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤 其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機(jī)體內(nèi)溶菌酶還具有抗流感 病毒的活性，其與膽酸鹽酸鹽的復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制流感病毒和腺病毒的生 長(zhǎng)，并能防止皰疹性病毒感染。
迄今，國(guó)內(nèi)尚無(wú)人溶菌酶的規(guī)模生產(chǎn)。各實(shí)驗(yàn)室使用的溶菌酶大多為進(jìn) 口產(chǎn)品，隨著對(duì)溶菌酶的臨床應(yīng)用研究的深入，國(guó)內(nèi)迫切需要質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的溶 菌酶供應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法，使溶菌酶的產(chǎn)量穩(wěn)定 于較高水平，從而達(dá)到規(guī)模生產(chǎn)要求。
本發(fā)明提供了一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法，即將序列如SEQIDNO. 1所示的DNA序列裝入真核表達(dá)載體，并在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)。 本發(fā)明中，所述的方法包括以下歩驟
(1) 將轉(zhuǎn)入溶菌酶DNA序列的畢赤酵母菌種置于培養(yǎng)基中發(fā)酵1-3天；
(2) 在(1)的培養(yǎng)基中加入甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)l-5天；
(3) 收集發(fā)酵產(chǎn)物，去菌體，即可。 本發(fā)明中，(2)中發(fā)酵時(shí)間為36-60小時(shí)。
本發(fā)明中，(2)中加入甲醇的量為每6-15小時(shí)添加甲醇2. 5-30ml/L
培養(yǎng)基o
本發(fā)明中，(3)中去菌體方法為離心、過(guò)濾或者超濾。 本發(fā)明中，離心條件為1500-5000rpm， 3-15分鐘，0-10。C。 本發(fā)明中，所用的真核表達(dá)載體可以是所有可以在畢赤酵母中表達(dá)蛋A
的載體，例如，pPIC9K， pPICZaA, pPICZaT，等等。所用的畢赤酵母可以是
gsl15， GSM1168等。
本發(fā)明中，表達(dá)溶菌酶蛋白的畢赤酵母菌種可以采用基因工程將溶菌酶
基因序列插入畢赤酵母的基因組而得。溶菌酶基因序列可以釆用從適當(dāng)?shù)纳?br> 物體組織細(xì)胞中提取或者人工合成而得。
本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以使用常規(guī)培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基中甘油含
量為5-40ml/L,蛋白胨含量為10-50g/L。培養(yǎng)基中還可以加入酵母粉，酵
母粉的含量為10-50g/L。培養(yǎng)基中還可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量為
10-40g/L。培養(yǎng)基中還可以加入磷酸鹽，磷酸鹽含量為0-0. 05M/L。該培養(yǎng)
基在PH值為7-8. 5時(shí)效果較好Z
本發(fā)明中，發(fā)酵溫度可以采用常溫。
本發(fā)明對(duì)人鵝型溶菌酶的基因序列進(jìn)行了改造，從而使溶菌酶發(fā)酵產(chǎn)量 明顯增加。利用本發(fā)明的制備方法獲得溶菌酶，生產(chǎn)效率明顯提高，成本降 低，為大批量生產(chǎn)溶菌酶及其下游工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
發(fā)酵流程及產(chǎn)量計(jì)算
1.1菌種制備按照《分子克隆》的方法，將序列如SEQ IDN0 1的DNA 序列與酵母表達(dá)載體pPIC9K連接并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSM1168，然后，涂布YPD 平板固體培養(yǎng)基，置于3(TC培養(yǎng)。
1. 2種子培養(yǎng)'YPD平板固體培養(yǎng)基中48h后，挑取直徑2mm菌落接種 100ml優(yōu)選培養(yǎng)基于1L三角瓶，以4層無(wú)菌紗布封口，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，溫度 28 30°C，震蕩速度300rpm， 36h后結(jié)束培養(yǎng)。
1. 3發(fā)酵培養(yǎng)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基6L裝入15L發(fā)酵罐，115。C高壓滅菌25min。 接種1.5L二級(jí)種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)16 24h耗盡培養(yǎng)液中甘油，。培甲醇誘 導(dǎo)階段共持續(xù)72h。重復(fù)培養(yǎng)兩次。
1.4發(fā)酵液處理發(fā)酵結(jié)束，用低溫高速離心機(jī)(5000rpm， 4'C， 10min) 離心發(fā)酵液，收集上清液，加入疊氮鈉至O. 02%濃度，4'C保存。
在進(jìn)行一次純化后，可從250ml發(fā)酵液上清中純化到7. Omg的溶菌酶蛋 白，而發(fā)酵液上清的溶菌酶蛋白總活性減少50%，因此推斷，250ml發(fā)酵液 上清中約含14mg的溶菌酶蛋白，每升發(fā)酵液中含56mg左右的溶菌酶蛋白。' 而在相同培養(yǎng)條件下，用人鵝型溶菌酶發(fā)酵得到的產(chǎn)量大約在3-5mg/L左右。
序列表
<110〉 復(fù)口.人學(xué)
<120〉 一種獲得高產(chǎn)呈鵝型溶菌酶的方法
<130〉 33
<160〉 2
<170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211〉 489
<212〉 DNA <213>人l:合成
<220>
<221〉 CDS
<222〉 (1). . (489)
〈223〉
<400〉 1
tct tac Ser Tyr 1
CC3
Pro
ttc Phe
tec Ser 5
cac His
tct Ser
atg Met
肌g Lys
cca Pro 10
C3C
His
ttg Leu
cac His
cca Pro
3g￡l
Arg 15
ttg Leu
48
tac cac Tyr His
ggt Gly
tgt Cys 20
tac Tyr
ggt Gly
gac Asp
att lie
atg Met 25
acc Thr
atg Met
aag Lys
acc Thr
tct Ser 30
ggt Gly
get Ala
96
act tgt Thr Cys
geic Asp 35
cca Pro
Asn
tct Ser
gtt Val
atg Met 40
朋c Asn
tgt Cys
ggt Gly
att lie
卿 Arg 45
ggt Gly
tct Ser
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144
atg ttc Met Phe 50
get Ala
gag Glu
3tg
Met
g￡lC
Asp
ttg L>eu 55
聊 Arg
get Ala
att lie
aag Lys
cca Pro 60
tac Tyr
caa Gin
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ttg Leu
192
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gag Glu
gtt Val
ggt Gly
caa Gin 70
卿 Arg
cac His
tgt Cys
gtt Val
g3C
Asp 75
cct Pro
get Ala
gtt Val
att lie
get Ala 80
240
get ate Ala lie
ate lie
tct Ser
卿 Arg 85
gag Glu
tec Ser
C3C
His
ggt Gly
ggt Gly 90
tct Ser
gtc Val
ttg Leu
Gin
g3C
Asp 95
ggt Gly
288
tgg gac Trp Asp
cac His
Arg 100
ggt Gly
Leu
肪g
ttc Phe
ggt Gly 105
ttg Leu
atg Met
c肌 Gin
ttg Leu
gate Asp 110
aag Lys
Gin
336
3CC t3C
Thr Tyr
cac His 115
cct Pro
gtt Val
ggt Gly
get Ala
tgg Trp 120
Asp
tct Ser
卿 Lys
gag Glu
cac His 125
ttg Leu
tct Ser
c肌 Gin
384
get act Ala Thr 130
ggt Gly
att lie
ttg Leu
act Thr
gag Glu 135
卿 Arg
ate lie
Lys
get Ala
ate lie 140
Gin
aag Lys
肌g Lys
ttc
Phe
432
cct act Pro Thr 145
tgg Trp
tct Ser
gtt Val
get Ala 150
c朋 Gin
C3C
His
ttg Leu
aag Lys
ggt Gly 155
aga Arg
ttg Leu
tac Tyr
tct Ser
gag Glu 160
480
tac ttc gtt Tyr Phe Vsl
489<210〉 2
<211> 163
<212〉 PRT
<213〉 Eastern equine encephalomyelitis virus
<400〉 2
Ser Tyr Pro Phe Ser His Ser Met Lys Pro His Leu His Pro Arg Leu 15 10 15
Tyr His Gly Cys Tyr Gly Asp lie Met Thr Met Lys Thr Ser Gly Ala 20 25 30
Thr Cys Asp Pro Asn Ser Val Met Asn Cys Gly lie Arg Gly Ser Glu 35 40 45
Met Phe Ala Glu Met Asp Leu Arg Ala lie Lys Pro Tyr Gin Thr Leu 50 55 60
lie Lys Glu Val Gly Gin Arg His Cys Val Asp Pro Ala Val lie Ala 65 70 75 80
A丄a J'丄e lie Ser Arg Glu Ser His Gly Gly Ser Val Leu Gin Asp Gly 85 90 95
Trp Asp His Arg Gly Leu Lys Phe Gly Leu Met Gin Leu Asp Lys Gin 100 105 110
Thr Tyr His Pro Val Gly Ala Trp A印Ser Lys Glu His Leu Ser Gin 115 120 125Ala Thr Gly lie Leu Thr Glu Arg lie Lys Ala lie Gin Lys Lys Phe 130 135 140
Pro Thr Trp Ser Val Ala Gin His Leu Lys Gly Arg Leu Tyr Ser Glu 145 150 155 160
Tyr Phe Val
權(quán)利要求
1.一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法，其特征在于，將序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列裝入真核表達(dá)載體，并在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下歩驟(1) 將轉(zhuǎn)入溶菌酶DNA序列的畢赤酵母菌種置于培養(yǎng)基中發(fā)酵1-3天；(2) 在(1)的培養(yǎng)基中加入甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)l-5天；(3) 收集發(fā)酵產(chǎn)物，去菌體，即可。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中發(fā)酵時(shí)間為36-60 小時(shí)。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中加入甲醇的量為每 6-15小時(shí)添加甲醇2. 5-30ml/L培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(3)中去菌體方法為離心、過(guò)濾或者超濾。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，離心條件為1500-5000rpm， 3-15分鐘，0-10。C。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法。本發(fā)明提供了一種獲得高產(chǎn)量鵝型溶菌酶的方法，即將序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列裝入真核表達(dá)載體，并在畢赤酵母中發(fā)酵表達(dá)。本發(fā)明對(duì)人鵝型溶菌酶的基因序列進(jìn)行了改造，從而使溶菌酶發(fā)酵產(chǎn)量明顯增加。利用本發(fā)明的制備方法獲得溶菌酶，生產(chǎn)效率明顯提高，成本降低，為大批量生產(chǎn)溶菌酶及其下游工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101353630SQ20071004425
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 李宗林, 鵬 黃 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)