專利名稱：：抗人絨毛膜促性腺激素β亞基的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域以及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，特別是一種抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤生物治療是繼手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療之后新型的腫瘤治療手段，其中，針對腫瘤抗原物質(zhì)而研制的單克隆抗體(monoclonalantibody,mAb)是目前腫瘤生物治療的熱點之一?？乖贵w反應(yīng)的特異性決定了針對腫瘤特異性靶抗原的mAb會優(yōu)先與相應(yīng)的腫瘤組織結(jié)合，而不識別正常的組織。單克隆抗體不僅可以通過ADCC(抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用)及CDC(細胞依賴的細胞毒作用)等免疫效應(yīng)機制發(fā)揮抗瘤作用，還可以直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；同時利用單克隆抗體識別腫瘤細胞的特異性，可通過將放療化療藥物偶聯(lián)到單克隆抗體上給藥從而降低藥物對正常組織的非特異損傷，減少治療的副作用。單克隆抗體正是以其特異性和敏感性成為眾所矚目的腫瘤治療的新方法。人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin，hCG)是由孕婦胚胎合體滋養(yǎng)層細胞分泌的糖蛋白激素，在維持早孕婦女的黃體功能和促進妊娠進行、防止母體排斥妊娠產(chǎn)物等方面具有重要的生理功能。hCG與人黃體生成素(hLH)、卵泡刺激素(FSH)和促甲狀腺激素(TSH)等同屬糖蛋白激素家族。hCG由ot鏈和卩鏈組成，hCG與hLH、FSH禾BTSH具有完全相同的a鏈，而具有獨特的與功能相關(guān)的p鏈。自Gailani等報道非滋養(yǎng)層腫瘤細胞異位表達hCG以來，腫瘤細胞表達的異位hCG(ectopicehCG，ehCG)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系受到人們關(guān)注。許多不同類別和組織來源的腫瘤細胞都能不同程度地表達ehCG。腫瘤細胞自分泌的ehCG具有生長因子活性，能促進和調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化和生長，使腫瘤細胞在其微環(huán)境中能自我生長；膜結(jié)合型ehCG使腫瘤細胞表面呈負電荷，推測可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移特性、免疫耐受等有一定的關(guān)系，因而，ehCG可以作為mAb生物治療的一種理想靶抗原。由于hCG與其他性激素具有相同的oc鏈，因此以hCG獨特的(3鏈(hCG卩)作為靶抗原，制備抗hCGp的mAb，可以成為腫瘤免疫生物治療的一種理想手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體及其制備方法，所述的這種抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體及其制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的抗腫瘤藥物治療腫瘤效果不佳，副作用大的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白、或者特異性結(jié)合表達人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白的腫瘤細胞。進一歩的，所述的人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。進一步的，所述的人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白具有SEQIDNO:2所示的DNA序列。進一步的，所述的單克隆抗體的恒定區(qū)基因序列等同于所有BALB/c小鼠來源IgG2a抗體的相應(yīng)序列，與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)(含關(guān)鍵CDR序列和附屬骨架區(qū)序列)具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。進一步的，所述的單克隆抗體的恒定區(qū)基因序列等同于所有BALB/c小鼠來源lgG2a抗體的相應(yīng)序列，與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)(含6關(guān)鍵CDR序列和附屬骨架區(qū)序列)具有SEQIDNO:4所示的DNA序列。具體的，與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR1序列包括SEQIDNO:5所示的DNA序列(ACGGTTAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTG)。具體的，與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR2序列包括SEQIDNO:6所示的DNA序列(AGGACTTCCAACCTGGCTTCT)。具體的，與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR3序列包括SEQIDNO:7所示的DNA序列(CACCAGTATCATCGTTCCCCACGGACG)。進一步的，所述的表達人絨毛膜促性腺激素(3亞基蛋白的腫瘤包括但不限于HeLa細胞、或者H印G2細胞、或者HL-60細胞、或者7721細胞、或者K562細胞、或者SKOV3細胞、或者PC-3細胞。本發(fā)明還提供了一種抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的制備方法，包括一個獲得編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因DNA的步驟，包括一個構(gòu)建含有編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因的質(zhì)粒的步驟，包括一個利用表達質(zhì)粒免疫小鼠的步驟，包括一個利用獲得的分泌高效價抗hCGp抗體的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合的步驟，包括一個反復(fù)篩選得到分泌抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的雜交瘤細胞株的步驟，包括一個利用獲得的雜交瘤細胞株分泌抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的步驟。具體的，所述的一種抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的制備方法包括以下步驟(1)獲得編碼hCGp蛋白的基因DNA;(2)通過酶切位點插入真核表達質(zhì)粒載體中；(3)將表達質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫；(4)免疫后以ELISA方法證實小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價的抗hCGp抗體后，分離得到小鼠脾細胞，與B淋巴細胞瘤按照常規(guī)方法進行融合，篩選永生化的分泌抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的融合雜交瘤細胞株；(5)利用獲得的雜交瘤細胞株分泌的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體。具體的，所述的小鼠為BALB/c小鼠。具體的，所述的真核表達質(zhì)粒載體為TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。本發(fā)明還提供了一種雜交瘤細胞株，采用如下步驟制備，包括一個獲得編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因DNA的步驟，包括一個構(gòu)建含有編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因的質(zhì)粒的步驟，包括一個利用表達質(zhì)粒免疫小鼠的步驟，包括一個利用獲得的分泌高效價抗hCGp抗體的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合的步驟，包括一個反復(fù)篩選得到分泌抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的雜交瘤細胞株的步驟。具體的，所述的一種雜交瘤細胞株的制備方法，包括以下步驟(1)獲得編碼hCGp蛋白的基因DNA;(2)通過酶切位點插入真核表達質(zhì)粒載體中；(3)將表達質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫；(4)免疫后以ELISA方法證實小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價的抗hCGp抗體后，分離得到小鼠脾細胞，與B淋巴細胞瘤按照常規(guī)方法進行融合，篩選永生化的分泌抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的融合雜交瘤細胞株。具體的，所述的小鼠為BALB/c小鼠。具體的，所述的真核表達質(zhì)粒載體為TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。本發(fā)明還提供了一種具有抗腫瘤功能的藥物組合物，含有有效量的上述的單克隆抗體、或者含有有效量的上述的雜交瘤細胞株、或者含有有效量的上述的雜交瘤細胞株和抗腫瘤藥物的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑，含有有效量的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體。本發(fā)明所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體可在體外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，加入腫瘤細胞培養(yǎng)上清中時，可以劑量依賴性的方式抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞(HeLa)的增殖。進一步的，所述的抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體可以在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。將單克隆抗體注射成瘤小鼠(HeLa細胞注射的裸鼠)后，可以抑制腫瘤的生長并且可延長荷瘤小鼠的存活時間。本發(fā)明所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體可在體內(nèi)、外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的機制在于單克隆抗體可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可以導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)明顯的細胞鈹縮、細胞核固縮、DNA片段化等。本發(fā)明人通過長期廣泛的研究發(fā)現(xiàn)雖然抗hCGp單克隆抗體也可以通過常規(guī)的以hCGJ3蛋白免疫的方法獲得，但是所獲得的單克隆抗體不一定具有較強的抗腫瘤活性，此外，蛋白免疫的代價相對基因免疫非常昂貴。更為重要的是，如需對hC鄰進行某種程度的必要的改造或修飾，則基因疫苗可在基因水平上快速簡便地進行操作；而在hCG(3蛋白水平上操作難度大、費用昂貴。因此通過基因疫苗形式來構(gòu)建表達hCGp蛋白，并誘導(dǎo)hCG卩蛋白特異性抗體從而制備單克隆抗體技術(shù)，是行之有效而簡便易行的新技術(shù)。本發(fā)明中，所述的表達hCGp的真核表達質(zhì)粒的載體，包括任何可以轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的高效真核表達質(zhì)粒載體，包括但不限于pcDNA3、pVAX和TR421等以及常見和市售的真核質(zhì)粒載體。本發(fā)明中，hCGp蛋白編碼基因的獲得，可以通過多種方式獲得，包括但不限于1)化學(xué)合成DNA;2)通過適當(dāng)引物以PCR技術(shù)擴增得到DNA。本發(fā)明中，將編碼hCGp的基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方式，以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行以注射器吸取"00)J質(zhì)粒液體直接注射小鼠脛骨前肌肉，可僅注射小鼠一條腿，也可分別取5C^I質(zhì)粒注射于小鼠兩條腿。除注射器外，也可選用其他有效的借助于市售儀器的基因免疫的方式，包括但不限于基因槍技術(shù)、電穿孔輔助技術(shù)等。本發(fā)明中，所述的含有抗hCG(3單克隆抗體YN2的藥物復(fù)合物中有效成分的存在形式，包括但不限于以下幾類1)抗hC鄰單克隆抗體YN2蛋白；2)抗hCG(3單克隆抗體YN2蛋白與其他抗腫瘤藥物或分子的組合。在給藥時，可直接給予1)或2)所述的有效成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng))、有合理效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"成分是用于將具有活性的有效成分傳送給人或動物的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑和賦形劑。所述的載體可以是液體、固體或半固體。載體包括但不限于水、PBS緩沖液、生理鹽水、葡萄糖、甘油、疊氮鈉及其組合。本發(fā)明的藥物組合物，含有上述有效成分和藥學(xué)上可接受的載體。通常將其配制于無毒、中性、惰性和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，pH值通常約6—8，但根據(jù)具體腫瘤情況以及有效成分性質(zhì)可有所改變。本發(fā)明通過以編碼hCGp的真核表達質(zhì)粒進行基因免疫的方式，最后篩選獲得了具有較強抗腫瘤活性的但克隆抗體，可通過特異性結(jié)合hCGp蛋白而與膜表達hCGp蛋白的腫瘤細胞發(fā)生結(jié)合，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生調(diào)亡，因此可有效發(fā)揮體外、更重要的是體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。該抗hCG(3單克隆抗體在空間有效結(jié)合了hCGp蛋白的功能部位，從而使腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移特性被有效抑制。含有上述單克隆抗體的藥物組合物能應(yīng)用于腫瘤的免疫生物治療。含有該單克隆抗體的檢測試劑，可用于體內(nèi)示蹤技術(shù)、ELISA檢測方法中的抗體以及腫瘤原位組織切片檢測中的抗體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相對比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明所制備的抗hCGp單克隆抗體，經(jīng)由基因免疫手段制備，具有有效的抗腫瘤效應(yīng)。在10腫瘤免疫生物治療、腫瘤定性定量免疫檢測、腫瘤示蹤定位等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。同時本發(fā)明不采用常規(guī)的蛋白免疫方式制備抗hCGp單克隆抗體，而是利用基因免疫手段免疫小鼠制備抗hCG(3單克隆抗體，能夠得到高效價抗體，為更加有效的利用本發(fā)明的單克隆抗體治療腫瘤提供了堅實的基礎(chǔ)。圖1顯示了真核表達質(zhì)粒TR421-hCGp的構(gòu)建示意圖；其中基因經(jīng)PCR擴增獲得，TR421購自invitrogen，分別經(jīng)Bglll和BamHI酶切，再連接，得到TR421-hCG(3質(zhì)粒。圖2顯示了真核表達質(zhì)粒TR421-hCG(3的鑒定結(jié)果；A圖PCR鑒定，利用不同引物可得到495、625bp條帶，表明基因插入且方向正確；B圖顯示Bglll/BamHI酶切得到503bp條帶；C圖顯示DNA測序證實構(gòu)建無誤。圖3顯示了TR421-hCG(3質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射BALB/c小鼠誘導(dǎo)的血清抗hCGI3抗體效價；H1、H2和H3為小鼠編號；Normal為未免疫小鼠對照。結(jié)果顯示三次基因免疫誘導(dǎo)了高強度的抗hCGp抗體，效價高于105。圖4顯示了獲得的9株抗hCG(3單抗對Hela腫瘤細胞的抑制效率，其中YN2單抗抑制腫瘤效果最好。圖5顯示了單克隆抗體YN2經(jīng)腹水純化后的特性，圖A:YN2經(jīng)腹水?dāng)U增后經(jīng)ProteinG親和層析柱純化，SDS-PAGE鑒定純度達到90%以上；1:Marker;2:未純化腹水；3:純化YN2單克隆抗體(變性)；4:純化YN2(非變性)；圖B:WesternBlot證實YN2可與純的hCGp蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；圖C:YN2雜交瘤染色體核型分析表明染色體數(shù)目90條以上。圖6顯示了YN2單克隆抗體與不同腫瘤細胞上表達的hCG(3結(jié)合圖，結(jié)果提示YN2單克隆抗體可與多種不同腫瘤細胞表達的hC鄰特異結(jié)合。圖7顯示了YN2單克隆抗體的體外抗腫瘤作用，將YN2加入培養(yǎng)細胞上清，可有效抑制HeLa細胞增值，YN2濃度〉6C^g/ml時，抑瘤效率達40。％，丫N2濃度為100|Lig/ml時，抑瘤效率達58%。圖8顯示了YN2單克隆抗體的體內(nèi)抗腫瘤作用，對荷HeLa腫瘤裸鼠腹腔注射YN2抗體500ijg/只/次，每星期3次，其圖A顯示YN2對腫瘤生長的抑制，荷瘤28天，YN2組腫瘤體積為與對照相比縮小一半以上(p<0.01)，圖B顯示了荷瘤小鼠生存率YN2處理組的小鼠平均生存期為77天，而對照小鼠僅為30-37天，證明YN2可有效延長荷瘤動物存活。圖9顯示了YN2單克隆抗體誘導(dǎo)HeLa細胞核凋亡，YN2處理后，Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)細胞核固縮并出現(xiàn)核碎裂、分離，證實細胞凋亡。圖10顯示了YN2單克隆抗體誘導(dǎo)HeLa細胞染色體降解，YN2處理后的細胞的染色體DNA發(fā)生了典型的100bp片段化，證實發(fā)生細胞調(diào)亡。具體實施方式-以下所述本發(fā)明的具體實施例用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。實施例中所采用的質(zhì)粒載體可通過購買獲得，SP2/0細胞等可通過中國科學(xué)院上海細胞所購買；常見生化試劑購自Sigma公司、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；細胞培養(yǎng)試劑購買自GibcoBRL和Invitrogen公司，基因DNA合成委托上海生工公司；hCGp蛋白購買自上海麥莎生物科技有限公司，AnnexinV和PI購自BD公司。6-8周齡雌性BALB/c(H-2d)小鼠購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心，清潔級飼養(yǎng)。動物詞養(yǎng)及操作符合國家相關(guān)規(guī)定。實施例1基因疫苗TR421-hCGp真核質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及其大量純化1.PCR法獲得ehCGp-hCGp編碼基因引物序列hCG(3畫P1:5'-GGAAGATCTATGGAGATGTTCCAGG國3'(SEQIDNO:8)、和引物序列hCG|3-P2:5'誦CGGGATCCTTGTGGGAGGATCGGGGT國3'(SEQIDNO:9)由上海生工公司合成；TaqDNA多聚酶、dNTP等PCR試劑購自Biostar公司；膠回收試劑盒購自上海華舜生物公司。以pGEM3Z-hCGp質(zhì)粒(美國東卡羅來納大學(xué)RossTM教授饋贈)為模板、hCGp-P1和hCGp-P2為上下游引物進行PCR(美國PerkinElmer公司PE2400型PCR儀)，PCR反應(yīng)條件總體積50|nl，依次加入10X緩沖液5一、25mMMgCl^^k10mMdNTP1一、10mM正反向引物各1一、Taq酶1U、模板1…，三蒸水至50…。反應(yīng)程序為94'C預(yù)變性5分鐘，進入PCR循環(huán)94'C變性45秒、58'C復(fù)性45秒、72'C延長1分鐘，重復(fù)30個循環(huán)，最后延長10分鐘。以1%瓊脂糖凝膠電泳回收hCGp基因(503bp)。2.TR421-hCGp重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定TR421-hCGp重組質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。具體步驟如下A.基因片段和載體的酶切與回收以8a/77〃l和8gf/ll(TaKaRa)對hCG(3基因的PCR回收產(chǎn)物進行雙酶切，以8fif/ll對TR421質(zhì)粒(invitrogen)進行單酶切，方法如下1|ig的質(zhì)粒DNA或PCR回收產(chǎn)物，2U相應(yīng)內(nèi)切酶、2iJ緩沖液，加雙蒸水至20|J，37"C反應(yīng)6小時，65"C終止反應(yīng)，以1%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物。B.酶切載體與酶切基因片段的連接取適量酶切載體和目的片段加入反應(yīng)管，使載體和片段的摩爾數(shù)之比為1:3，然后加1iliIT4DNA連接酶(MBI公司)、1pl緩沖液，補雙蒸水至10|il，混合后置16。C反應(yīng)4。C過夜。C.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細菌取5pl連接產(chǎn)物DNA，加200|JDH5a感受態(tài)，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，冰浴5分鐘，加入800^1LB，37。C120rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘，3000rpm離心3分鐘，棄上清，留約10(^1液體懸浮菌體，涂布卡那青霉素(60|ag/ml)平板上，37。C培養(yǎng)16小時。D.陽性克隆的篩選鑒定菌落PCR:采用TR421載體上、下游引物T7U:5'-TTAATACGACTCACTATAG國3'(SEQIDNO:10)禾卩T7D:5'-TAGAAGGCACAGTCGAGGCTGAT-3(SEQIDNO:11)。將PCR所有試劑按比例混和，用無菌牙簽挑取菌落涂于管底，PCR反應(yīng)條件同上，預(yù)變性時間延長至15分鐘。以ehCGp-P1/ehCG(3-P2為正反向引物進行PCR鑒定hCGf3基因是否插入載體；以T7U/ehCG卩-P2或hCGp-P1/T7D為正反向引物鑒定插入方向。酶切鑒定小量抽提菌落質(zhì)粒DNA，以8amHI和8g川進行雙酶切，進行1。/。瓊脂糖凝膠電泳觀察能否切下503bp左右的產(chǎn)物。DNA測序檢測委托上海申友生物公司采用ABIPRISMTM377DNASequencer測序儀完成。按上述步驟將hCG(3編碼基因克隆于TR421質(zhì)粒，獲得TR421-hCGJ3重組質(zhì)粒。PCR、酶切法、DNA測序證實hCGp基因插入方向正確，讀碼框架準確(圖2)。3.TR421-hCGp重組質(zhì)粒的大量純化按照QIAGENPlasmidMegaKit質(zhì)粒DNA純化試劑盒(基因公司)說明操作，以PBS溶解DNA。以紫外分光光度計測定DNA溶液的OD260/OD280比值，接近1.9時認為達到純度，以00260=0.1時DNA的含量為50pg/ml計算DNA的濃度，將質(zhì)粒DNA調(diào)整為1|tig/|J，-2(TC凍存。實施例2TR421-hCG(3基因免疫小鼠質(zhì)粒DNA免疫前24小時，用0.75%戊巴比妥鈉120-18(^1腹腔注射麻醉小鼠(50iig/g體重)，消毒腿部皮毛，在脛骨前肌肉中注射100pl0.25%丁哌卡因(Sigma公司)，促進局部肌肉壞死再生。24小時后麻醉小鼠在同一部位注射質(zhì)粒DNA(100pg/100i^l)-PBS溶液，于第14、第28天按同樣方法經(jīng)肌肉免疫小鼠，眼眶后眥靜脈采血，血清于-20。C凍存。第42天經(jīng)小鼠尾靜脈注射hCGp純蛋白20pg，5天后處死小鼠取脾臟用于細胞融合。實施例3TR421-hCG(3基因免疫誘導(dǎo)特異性血清抗體三次基因免疫后在小鼠血清誘導(dǎo)的抗hCG(3抗體采用常規(guī)，ELISA方法檢測以10ug/mlhCGp蛋白溶解于包被液中(0.1MNa2C03,pH9.6、0.1%BSA)4。C包被96孔酶標板；以5%milk-PBS封閉；依次加1:100稀釋血清、HRP-羊抗小鼠lgG、OPD，顯色中止，測OD490nm。結(jié)果如圖3所示，三次基因免疫后在小鼠誘導(dǎo)了高滴度的血清抗hCGpIgG抗體，抗體效價高于105。加強免疫后抗體的水平持續(xù)增高，各免疫小鼠的抗體上升水平趨向一致，提示TR421-hCG卩基因免疫小鼠可誘生高效價的特異性抗體。實施例4抗hCG(3單克隆抗體的制備1.細胞融合1)飼養(yǎng)細胞的制備取未免疫過的BALB/C小鼠摘眼球放血，置于EP管中，留取血清作陰性對照。脫頸推處死小鼠，超凈臺內(nèi)剪開小鼠腹腔，吸取少許無血清1640培養(yǎng)基注入小鼠腹腔內(nèi)，吹打2-3次，吸出腹腔內(nèi)細胞懸液(主要為巨噬細胞)，1500rpm離心5分鐘，棄上清加入HAT培養(yǎng)基，制成飼養(yǎng)細胞懸液置C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日供細胞融合用。2)SP2/0淋巴瘤細胞的準備融合前兩周用8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)對SP2/0細胞作選擇培養(yǎng)。融合當(dāng)天收集處于指數(shù)生長期的、活率大于95%的SP2/0細胞，用無血清RPMI-1640洗細胞一次，取5Xl(fSP2/0細胞備用。3)小鼠脾細胞制備選取血清抗體效價最高小鼠，脫頸處死，無菌取脾，用200目尼龍指套制成單細胞懸液，無血清1640懸浮，取2X108細胞備用。4)細胞融合采用常規(guī)方法進行細胞融合將小鼠脾細胞和SP2/0按4:15:1的比例混合，無血清1640洗滌2~3次，離心棄上清；輕彈使沉淀細胞疏松，37"C下將預(yù)熱的lml50%PEG于1分鐘內(nèi)逐滴加入細胞沉淀中，邊加邊緩慢均勻地旋轉(zhuǎn)離心管，使液滴沿管壁加入，靜置融合90秒，然后于2分鐘內(nèi)加完lml無血清1640，再于1分鐘內(nèi)加完lml無血清1640，再于30秒鐘內(nèi)加lml無血清1640，逐滴加入無血清164030-40ml，低速離心5分鐘，棄上清，沉淀細胞用含20。/。小牛血清HAT培養(yǎng)液重懸，滴加于預(yù)先鋪有詞養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔10(^1。置37°(:,5%0)2孵箱培養(yǎng)。融合后的細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后換用HT培養(yǎng)基，再過兩周后逐步換成含20。/。胎牛血-RPMI1640完全培養(yǎng)液。2.陽性雜交瘤細胞篩選待雜交瘤細胞長至孔底1/3面積時，取培養(yǎng)上清液，用ELISA法進行陽性克隆檢測。標本0D值大于陰性對照值2.1倍判為陽性。記錄好陽性培養(yǎng)L，1-2日后對陽性孔進行復(fù)測，保留陽性孔，及時進行亞克隆。3.雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)克隆前一天按照前述方法制備1X105/ml小鼠腹腔巨噬細胞，每孔加入lOOnl。挑取陽性孔的細胞計數(shù)并以有限稀釋法克隆取50個活細胞懸浮于10ml培養(yǎng)液中(5/ml)，按每孔100iil接種于96孔板中，置37t:，5%C02孵箱中培養(yǎng)，于第五天補加一次培養(yǎng)液，之后每三天換液一次。待克隆長大后再次行抗體檢測，連續(xù)進行克隆化直至所檢測的克隆陽性率達100%，挑取陽性反應(yīng)最強克隆擴大培養(yǎng)并凍存。4.陽性雜交瘤細胞的擴大培養(yǎng)及冷凍保存將陽性單克隆雜交瘤細胞依次轉(zhuǎn)入24孔、6孔培養(yǎng)板，與完全1640培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)；待細胞長滿孔底時，取出1500rpm離心IO分鐘，棄上清；用凍存液稀釋(含10%DMSO的完全培養(yǎng)液)，分裝至凍存管中(lml/管)；4。C放置30分鐘；-20°(3放置2個小時；-70°(:放置1小時；轉(zhuǎn)至液氮中凍存，第一、二、三代篩選的克隆分別按上述方法凍存于液氮中。結(jié)果顯示在8塊96孔板中，共有340孔可見明顯雜交瘤細胞生長，融合率為45%。對己融合的雜交瘤細胞用ELISA檢測其抗hCGp抗體分泌，對陽性孔進行有限稀釋法克隆和上清篩選，經(jīng)過三次亞克隆，共獲得9株分泌特異性抗hCGp單抗的雜交瘤細胞。將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，持續(xù)穩(wěn)定分泌抗體。通過檢測9株雜交瘤細胞的培養(yǎng)上對HeLa細胞增殖的影響，如圖4顯示YN2雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與HeLa細胞共孵育48小時后，抗體處理組活細胞數(shù)占未處理組細胞數(shù)的81.67±7.63%，提示YN2能夠抑制體外培養(yǎng)的HeLa細胞的增殖。實施例5YN2單克隆抗體的制備和純化采用小鼠腹水法制備高效價高純度的丫N2單克隆抗體，取8-10周齡的雌性BALB/c小鼠，腹腔注入液體石蠟0.5ml/只，一周后腹腔注射雜交瘤細胞1X106/只，同時另一側(cè)腹腔再次注入液體石蠟和IFA的，一般在7-10天后收獲腹水，腹水產(chǎn)生陽性率為80%，收獲量平均5ml/只，腹水抗體效價達1:106。離心取腹水上清按50。/。飽和度加入等體積的飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后置40。C4-6小時，離心棄上清。取沉淀加0.01mol/LPBS(PH7.4)復(fù)溶。透析去除(NH4)2S04，按照Pharmacia公司提供的ProteinG親和層析進行單抗純化，步驟如下柱子再生與平衡先用5CV甘氨酸-鹽酸(20mmol/L，pH2.7)再生層析柱，再用5CV平衡緩沖的磷酸鹽緩沖液(PB20mmol/l,pH7.0)平衡層析柱，流速1.0ml/min;上樣將預(yù)處理好的腹水上樣，流速1.0ml/min;再平衡用平衡緩沖液沖洗層析柱，使其在280nm處紫外吸收接近基線，流速1.0ml/min;洗脫用甘氨酸-鹽酸(20mmol/L,pH2.7)洗脫液洗脫，流速1.0ml/min，接收蛋白洗脫峰,立即用lmol/LTris-HCl(pH9.0)調(diào)節(jié)至中性。PBS(PH7.0)透析后用紫外分光光度計測定抗體蛋白的含量，其濃度的計算公式為:抗體蛋白含量(mg/ml)K)D280X1.55-OD260X0.76。用SDS-PAGE鑒定單克隆抗體純度分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，分別在還原狀態(tài)和非還原狀態(tài)下處理樣品，上樣量15ml,電泳采用恒壓方式，濃縮膠150V,分離膠120V。電泳后以考馬斯亮藍R250染色，然后經(jīng)凝膠成像儀掃描鑒定純度，結(jié)果顯示腹水經(jīng)ProteinG親和層析柱純化，用SDS-PAGE電泳鑒定純度達到90%以上(圖5A)。WesternBlot檢測證實該單抗YN2可與純的hCG(3蛋白發(fā)生特異性結(jié)合(圖5B)。此夕卜，YN2雜交瘤細胞染色體分析表明染色體數(shù)目90條以上(圖5C)。實施例6流式細胞術(shù)證實YN2可與腫瘤細胞表面hCGp有效結(jié)合收獲對數(shù)生長期的SP2/0細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、HL-60細胞、7721細胞、K562細胞、SKOV3細胞、PC-3細胞，ECV-304細胞，PBS洗3次，棄上清，使每管細胞總數(shù)為5X105，加入100jil雜交瘤培養(yǎng)上清，輕混細胞置4t:冰箱30min,PBS洗1次，加50|ilFITC標記羊抗小鼠IgG多抗置4'C冰箱0.5h，PBS洗3次，用流式細胞檢測儀檢測，結(jié)果如圖6A、圖6B、圖6C、圖6D、圖6E、圖6F、圖6G、圖6H、圖61所示YN2可與多種不同腫瘤細胞表面hCGp有效結(jié)合。實施例7YN2單克隆抗體發(fā)揮體內(nèi)外抗腫瘤作用1.YN2可在體外有效抑制腫瘤細胞增殖活性獲取對數(shù)生長期的天然高表達hCGp的人HeLa細胞，按1X104/100^1/孔加入96孔細胞板，加入lOOpl單克隆抗體溶液，置37X:、C02條件培養(yǎng)44h，觀察腫瘤細胞形態(tài)變化，然后每孔加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2h后，在450nm測定吸光度，以單純加入培養(yǎng)液的對照孔OD值為100%，根據(jù)處理組細胞培養(yǎng)孔的OD值，計算YN2抗體孵育后細胞的相對增殖活性。結(jié)果如圖7證實，YN2與HeLa細胞共孵育后顯示明顯的細胞毒作用，并且呈劑量依賴性，當(dāng)YN2達100iug/ml時，HeLa細胞生長抑制率達58Q/0。2.YN2可在體內(nèi)有效抑制腫瘤在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生長收集HeLa細胞，按5X106/100ki1注射于裸鼠肩胛部皮下，定期觀察腫瘤大小和生存率。每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤的體積。腫瘤的體積以如下公式計算1/2XlXw2，其中l(wèi)是腫瘤的長徑(mm)，w代表腫瘤與長徑垂直的短徑(mm)。在接種后第3天，將成瘤裸鼠隨機分組，8只/組，共三組，分別為PBS處理組、抗HBVM蛋白(無關(guān))單克隆抗體(同型對照)組和YN2單克隆抗體處理組，腹腔注射抗體500pg/只/次,每星期3次，進行抗體干預(yù)。記錄小鼠的生存率。結(jié)果如圖8顯示通過YN2抗體對裸鼠HeLa腫瘤的干預(yù)，荷瘤后第28天，YN2處理組腫瘤平均體積為1.76cm3，與對照抗體組3.41cm3、PBS組3.63cm3相比，顯著減小(p<0.01)。荷瘤小鼠生存周期表明PBS、對照抗體處理小鼠的平均生存期分別為30和37天，而YN2處理組的小鼠直至第48天，仍有100Q/。的存活率，小鼠平均生存期為77天。證明YN2單克隆抗體可以抑制體內(nèi)HeLa腫瘤細胞的生長，有效延長荷瘤動物存活。實施例8YN2單克隆抗體可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡1.Hoechst33258染色檢測細胞核崩解在6孔板內(nèi)鋪清潔無菌蓋玻片，將處于對數(shù)生長期腫瘤細胞消化后均勻鋪在板內(nèi)，24小時后，細胞在玻片上生長至80%后，加入6H1單克隆抗體及對照抗體作用24-48小時，細胞出現(xiàn)明顯凋亡跡象后，棄去培養(yǎng)液，加入PBS洗滌，以3.7%多聚甲醛lml固定細胞爬片30min，PBS洗滌一次，滴加100plHoechst33258染液，37'C孵箱染色5min，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖9所示YN2單克隆抗體處理后，Hoechst33258染色從形態(tài)學(xué)上提示細胞核出現(xiàn)固縮，細胞核亮度增加，并出現(xiàn)核碎裂、分離，證實YN2單克隆抗體可以誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡。2.DNA片段化檢測收集經(jīng)不同濃度抗體作用的HeLa細胞(5X106)，以PBS洗1次，抽取細胞總DNA:加含蛋白酶K和RNase的細胞裂解液500111，混勻后于50'C水浴5h;力口0.5ml酚氯仿異戊醇抽提；離心后上清移至另一離心管，力口0.5ml氯仿異戊醇抽提；離心后上清移至另一離心管，加10W的3mol/L乙酸鈉和lml預(yù)冷無水乙醇，混勻后置液氮5min,沉淀DNA，離心去上清，經(jīng)70%乙醇洗滌后置室溫干燥10min，加30TE緩沖液溶解DNA。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后用EB染色。以凝膠圖像分析儀拍攝照片。結(jié)果如圖IO,與正常對照組細胞基因組DNA相比，YN2單克隆抗體處理后的細胞的染色體DNA發(fā)生了典型的100bp為基礎(chǔ)的片段化現(xiàn)象，證實發(fā)生了細胞調(diào)亡。3.流式細胞儀測定細胞凋亡采用AnnexinV-FITC/PI雙色標記法，HeLa細胞以不同濃度抗體作用，調(diào)為10"ml。PBS洗滌2次，棄上清，細胞重懸于100W的標記緩沖液中，每管分別加入AnnexinV-FITC溶液和PI溶液，混勻后于室溫下避光孵育15min。最后補PBS400|al，以流式細胞儀檢測細胞凋亡。每個樣品檢測l萬個細胞，用cdlquest軟件進行細胞凋亡分析。對YN2處理的HeLa細胞進行AnnexinV/PI雙染，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示YN2作用48小時后，發(fā)生早期凋亡(AnnexinV+/PI-)的HeLa細胞占12.16%，發(fā)生晚期凋亡(AnnexinV+/PI+)的占6.95%，顯著多于對照組(0.80%,0.71%),壞死細胞(AnnexinV-/PI+)也較對照組有部分增加。說明YN2通過引起腫瘤細胞凋亡介導(dǎo)其抗腫瘤作用。序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體及其制備方法<160>11<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>165<212>PRT<213>人hCG卩蛋白<400〉1MetGluMetPheGinGly15GlyThrTrpAlaSerLys20AsnAlaThrUuAlaVal35ValAsnThrThrlieCys50LeuGinGlyValLeuPro6570AspValArgPheGluSer85AsnProValValSerTyr100CysArgArgSerThrThr115ThrCysAspAspProArg130ProProSerLeuProSer145150ProlieLeuProGin16521LeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuSerMetGly1015GluProLeuArgProArgCysArgProlie2530GluLysGluGlyCysProValCyslieThr4045AlaGlyTyrCysProThrMetThrArgVal5560AlaLeuProGinValValCysAsnTyrArg7580GlyCysProArgGlyVal95SerCysGinCysAlaLeu110ProLysAspHisProLeu125SerSerSerLysAlaPro140ProGlyProSerAspThr155160lieArgLeuPro90AlaValAlaLeu105AspCysGlyGly120PheGinAspSer135ProSerArgLeu<210>2<211>495<212>DNA<213>人hCGp<400>2atgg卿tgttccaggggctgctgctgttgctgctgctgagcatgggcggg織tgggca60tccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccatcaatgccaccctggctgtggagaag120gagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccaccatctgtgccggctactgccccacc180atgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccctgcctcaggtggtgtgcaactaccgc240gatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctgcccgcgcggcgtgaaccccgtggtc300tcctacgccgtggctctcagctgtcaatgtgcactctgccgccgcagcaccactgactgc360gggggtcccaaggaccaccccttgacctgtgatgacccccgcttccaggactcctcttcc420tcaaaggcccctccccccagccttccaagtccatcccgactcccggggccctcggacacc480ccgatcctcccacaa495<210>3<211>滿<212〉PRT<213>抗hCG(3單抗輕鏈可變區(qū)蛋白<400>3AsplieGluMetThrGluSerProAlalieMetSerAlaSerLeuGly151015LysArgValSerCysThrCysThrValSerSerSerValSerSerSer202530TyrLeuHisTrpTyrGinGinLysProGlySerSerproLysLeuTrp354045lieTyrArgThrSerAsnValAlaSerGlyValProAlaArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerSerMetGlu65707580AlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrSerHisGinTyrHisArgSerPro859095ArgThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieAsn<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><213>抗hCGp單抗輕鏈可變區(qū)CDR3基因<400>7caccagtatcatcgttccccscggacg27<210>8<211>25<212>DNA<213>人hCG蛋白的上游引物<400>8ggaagatctatggagatgttccagg25<210>9<211>26<212>DNA<213>人hCG蛋白的下游引物<>9cgggatccttgtgggaggatcggggt26<210>10<211>19<212>DNA<213>TR421載體上游引物t7u<400>10ttaatacgactcactatag19<210>11<211>23<212>DNA<213>TR421載體下游引物T7U<400>11tagaaggcacagtcgaggctgat2權(quán)利要求1.一種抗人絨毛膜促性腺激素β亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體特異性結(jié)合人絨毛膜促性腺激素β亞基蛋白、或者特異性結(jié)合表達人絨毛膜促性腺激素β亞基蛋白的腫瘤細胞。2.如權(quán)利要求1所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的人絨毛膜促性腺激素(3亞基蛋白具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的人絨毛膜促性腺激素p亞基蛋白具有SEQIDNO:2所示的DNA序列。4.如權(quán)利要求1所述的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體的恒定區(qū)基因序列等同于所有BALB/c小鼠來源IgG2a抗體的相應(yīng)序列，與耙抗原特異結(jié)合的所述的抗體可變區(qū)具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體的恒定區(qū)基因序列等同于所有BALB/c小鼠來源IgG2a抗體的相應(yīng)序列，與靶抗原特異結(jié)合的所述的抗體可變區(qū)具有SEQIDNO:4所示的DNA序列。6.如權(quán)利要求5所述的抗人絨毛膜促性腺激素J3亞基的單克隆抗體，其特征在于:與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR1序列包括SEQIDNO:5所示的DNA序列。7.如權(quán)利要求5所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體，其特征在于:與靶抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR2序列包括SEQIDNO:6所示的DNA序列。8.如權(quán)利要求5所述的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體，其特征在于:與耙抗原特異結(jié)合的所述的可變區(qū)中的關(guān)鍵CDR3序列包括SEQIDNO:7所示的DNA序列。9.如權(quán)利要求1所述的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體，其特征在于所述的表達人絨毛膜促性腺激素p亞基蛋白的腫瘤包括HeLa細胞、或者H印G2細胞、或者HL-60細胞、或者7721細胞、或者K562細胞、或者SKOV3細胞、或者PC-3細胞。10.—種制備如權(quán)利要求1所述的的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的制備方法中包括一個獲得編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因DNA的步驟，包括一個構(gòu)建含有編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因的質(zhì)粒的步驟,包括一個利用表達質(zhì)粒免疫小鼠的步驟，包括一個利用獲得的分泌高效價抗hCGp抗體的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合的步驟，包括一個反復(fù)篩選得到分泌抗人絨毛膜促性腺激素I3亞基的單克隆抗體的雜交瘤細胞株的步驟,包括一個利用獲得的雜交瘤細胞株分泌抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的步驟。11.如權(quán)利要求10所述的抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的制備方法包括以下步驟-(1)獲得編碼hCGp蛋白的基因DNA;(2)通過酶切位點插入真核表達質(zhì)粒載體中；(3)將表達質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫；(4)免疫后以ELISA方法證實小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價的抗hCG(3抗體后，分離得到小鼠脾細胞，與B淋巴細胞瘤進行融合，篩選永生化的分泌抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的融合雜交瘤細胞株；(5)利用獲得的雜交瘤細胞株分泌的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體。12.如權(quán)利要求11所述的抗人絨毛膜促性腺激素p亞基的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的小鼠為BALB/c小鼠。13.如權(quán)利要求11所述的一種抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的真核表達質(zhì)粒載體為TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。14.一種雜交瘤細胞株，其特征在于采用如下步驟制備，包括一個獲得編碼人絨毛膜促性腺激素P亞基蛋白基因DNA的步驟，包括一個構(gòu)建含有編碼人絨毛膜促性腺激素(3亞基蛋白基因的質(zhì)粒的步驟，包括一個利用表達質(zhì)粒免疫小鼠的步驟，包括一個利用獲得的分泌高效價抗hCGp抗體的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合的步驟，包括一個反復(fù)篩選得到分泌抗人絨毛膜促性腺激素(3亞基的單克隆抗體的雜交瘤細胞株的步驟。15.—種制備如權(quán)利要求14所述的雜交瘤細胞株的方法，其特征在于包括以下步驟(1)獲得編碼hCG(3蛋白的基因DNA;(2)通過酶切位點插入真核表達質(zhì)粒載體中；(3)將表達質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫；(4)免疫后以ELISA方法證實小鼠血清中誘導(dǎo)了高效價的抗hCGp抗體后，分離得到小鼠脾細胞，與B淋巴細胞瘤進行融合，篩選永生化的分泌抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體的融合雜交瘤細胞株。16.如權(quán)利要求15所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于所述的小鼠為BALB/c小鼠。17.如權(quán)利要求15所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于所述的真核表達質(zhì)粒載體為TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。18.—種具有抗腫瘤功能的藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體、或者含有有效量的權(quán)利要求14所述的雜交瘤細胞株、或者含有有效量的權(quán)利要求14所述的雜交瘤細胞株和抗腫瘤藥物的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。19.一種檢測試劑，其特征在于含有有效量的抗人絨毛膜促性腺激素P亞基的單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗人絨毛膜促性腺激素β亞基的單克隆抗體、以及該單克隆抗體的制備方法，本發(fā)明通過以編碼hCGβ的真核表達質(zhì)粒經(jīng)肌肉免疫BALB/c小鼠，將分泌高效價抗hCGβ抗體的小鼠脾細胞與小鼠B細胞淋巴瘤融合、經(jīng)篩選、反復(fù)克隆化，獲得能穩(wěn)定分泌抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過該抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細胞株分泌抗hCGβ的單克隆抗體。本發(fā)明公開的抗hCGβ單克隆抗體可特異性結(jié)合hCGβ蛋白以及腫瘤細胞表達的膜型hCGβ，可在體外和體內(nèi)有效抑制腫瘤生長，可以直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。文檔編號C12N5/18GK101429249SQ20071004806公開日2009年5月13日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者寧于,薇徐,熊思東申請人:復(fù)旦大學(xué)