專利名稱：可表達(dá)和分泌β－半乳糖苷酶的大腸桿菌－乳酸菌穿梭質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-半乳糖苷酶(乳糖酶)因其能催化乳糖生成半乳糖和葡萄糖而在工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域都具有非常重要的用途。純化的β-半乳糖苷酶在工業(yè)生產(chǎn)上可用于乳品加工生產(chǎn)低乳糖牛奶，在醫(yī)藥領(lǐng)域可用于治療乳糖不耐受癥等。另一方面，一些細(xì)菌如德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌等因能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶而使它們具有特定的實(shí)用價(jià)值。例如乳酸菌等益生菌因能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶而使其可用于制備緩解乳糖不耐癥的益生菌制劑；德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌在發(fā)酵制作酸奶的過程中，將依靠其產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶分解奶中的乳糖。
一些細(xì)菌、酵母菌和霉菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。與酵母菌和霉菌相比，細(xì)菌的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量雖較低，但它們具有酵母菌和霉菌無法比擬的一些優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌很容易培養(yǎng)和保存，遺傳背景清楚，是目前首選的基因工程宿主菌株；乳酸菌具有公認(rèn)的安全性，常用于發(fā)酵酸奶，是人體腸道的正常菌群，對(duì)人體具有許多非常重要的益生作用。因此，提高大腸桿菌和乳酸菌等細(xì)菌的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量將大大提高這類細(xì)菌在工業(yè)酶生產(chǎn)和食品發(fā)酵、醫(yī)療保健領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。
常用的提高菌種產(chǎn)酶量的方法包括誘變篩選育種和基因工程技術(shù)。采用誘變的方法篩選高產(chǎn)酶菌株具有工作量大、菌株易變異、需大量誘導(dǎo)物、酶活提高率小等缺點(diǎn)，而基因工程技術(shù)則具有操作簡(jiǎn)便、蛋白表達(dá)量高、性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在已有研究者采用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株，如陳衛(wèi)等構(gòu)建的表達(dá)嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒，能在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達(dá)耐熱β-半乳糖苷酶，其酶活性分別為1.35U/ml和0.32U/mg(陳衛(wèi)，葛佳佳，張灝，丁霄霖.半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中過量表達(dá)及IPTG誘導(dǎo)條件.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(5)492-495；張灝，夏雨，傅曉燕，陳衛(wèi)，丁霄霖.耐熱β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢桿菌中的整合表達(dá).無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(6)1-4，14)。但這些質(zhì)粒具有以下一些不足①表達(dá)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶為融合蛋白，即表達(dá)的蛋白N端融合有來自于載體的一段多肽，這可能改變蛋白的三維結(jié)構(gòu)，影響蛋白活性基團(tuán)的形成從而使酶活性降低；②表達(dá)的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量不高，這將直接影響其應(yīng)用；③表達(dá)的β-半乳糖苷酶不具有分泌性，不利于工業(yè)制備酶產(chǎn)品，另外，表達(dá)的β-半乳糖苷酶不能分泌也會(huì)影響活菌直接發(fā)揮酶水解作用；④不能在乳酸菌中表達(dá)。乳酸乳球菌等乳酸菌在食品發(fā)酵工業(yè)上已有上千年的應(yīng)用史，近年來，乳酸菌的益生作用也受到了越來越廣泛的重視。由于具有公認(rèn)安全性，來源于乳酸菌的β-半乳糖苷酶可不經(jīng)過精制而直接應(yīng)用。另外，具有高活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌將具有更好的發(fā)酵酸奶的能力，如果作為益生菌，則具有更強(qiáng)的緩解乳糖不耐受的能力，這些都是大腸桿菌和枯草芽孢桿菌不具備的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，此種質(zhì)粒不僅能在大腸桿菌中高效表達(dá)非融合β-半乳糖苷酶，而且能在乳酸乳球菌中高效表達(dá)和分泌非融合β-半乳糖苷酶；本發(fā)明的再一目的是提供上述質(zhì)粒的構(gòu)建方法；本發(fā)明的又一目的是提供上述質(zhì)粒的應(yīng)用。
本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，其所含基因由編碼β-半乳糖苷酶的基因(見序列表中SEQ ID NO.2)及該基因上游含SD位點(diǎn)的調(diào)控序列(見序列表中SEQ ID NO.1)組成，為序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。其載體為pMG36e(Van de GM，Van der VJM，Kok，J，et al.Construction of a lactococcalexpression vectorexpression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.lactis.Appl Environ Microbiol，1989，55(1)224～228.)及其他一些大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，上述重組質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化乳酸乳球菌，在大腸桿菌中高效表達(dá)非融合β-半乳糖苷酶，在乳酸乳球菌中高效表達(dá)和分泌非融合β-半乳糖苷酶，因此可在β-半乳糖苷酶制備和構(gòu)建可表達(dá)β-半乳糖苷酶的乳酸菌株中應(yīng)用。
本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，其構(gòu)建方法包括以下步驟(1)以德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到含上游調(diào)控序列的β-半乳糖苷酶基因；(2)將上述擴(kuò)增得到的β-半乳糖苷酶基因用Pst I、Xba I雙酶切后與用同種酶雙酶切并去磷酸化的載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；(3)篩選陽性大腸桿菌，提取陽性大腸桿菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序。
本發(fā)明具有以下有益效果(1)表達(dá)的β-半乳糖苷酶為非融合蛋白。本發(fā)明采用非融合表達(dá)技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，在擴(kuò)增的德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因閱讀框(SEQ ID NO.2)上游加入一段含SD位點(diǎn)的調(diào)控序列(SEQ ID NO.1)，實(shí)現(xiàn)了載體小肽和目的蛋白的分離。實(shí)施例5表明，本發(fā)明所述重組質(zhì)粒確能在大腸桿菌和乳酸乳球菌中表達(dá)非融合的β-半乳糖苷酶。
(2)可在大腸桿菌和乳酸乳球菌中穿梭表達(dá)。實(shí)施例3和實(shí)施例4表明，本發(fā)明所述重組質(zhì)粒能在大腸桿菌和乳酸乳球菌中表達(dá)具有活性的β-半乳糖苷酶。由于能應(yīng)用于乳酸乳球菌等乳酸菌，因而本發(fā)明構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒具有更直接和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
(3)表達(dá)的β-半乳糖苷酶酶活性高。實(shí)施例6表明，攜帶本發(fā)明所述質(zhì)粒的大腸桿菌和乳酸乳球菌均能表達(dá)高活性的β-半乳糖苷酶，酶活性與基因初始菌相比均有成倍增加。攜帶本發(fā)明所述質(zhì)粒的大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性可達(dá)到4.755U/ml，為基因初始菌的11.86倍；攜帶本發(fā)明所述質(zhì)粒的乳酸乳球菌β-半乳糖苷酶活性可達(dá)到1.578U/ml，為基因初始菌株的3.94倍；高于陳衛(wèi)等構(gòu)建的表達(dá)嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶的大腸桿菌T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的β-半乳糖苷酶活性(陳衛(wèi)，葛佳佳，張灝，丁霄霖.半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中過量表達(dá)及IPTG誘導(dǎo)條件.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(5)492-495)。
(4)在乳酸乳球菌中表達(dá)的β-半乳糖苷酶具有分泌性。細(xì)菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶，不具有分泌性。與胞外酶相比，工業(yè)制備胞內(nèi)酶產(chǎn)品難度較大，細(xì)菌胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶活性也較難發(fā)揮。實(shí)施例7表明，本發(fā)明所述質(zhì)粒在乳酸乳球菌中表達(dá)的β-半乳糖苷酶能部分分泌到胞外，其分泌率最高可達(dá)27.1％，顯著高于基因初始菌(3％)。這將大大降低酶產(chǎn)品制備的難度，有利于細(xì)菌發(fā)揮其β-半乳糖苷酶活性。


圖1為本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)的一種結(jié)構(gòu)圖譜；圖2為構(gòu)建本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)的技術(shù)路線圖。
圖3為提取的德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在＞10kb處有一明顯的DNA條帶，表明德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA提取成功，圖中泳道1，2為德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA，泳道3為DNA markerVI。
圖4為PCR擴(kuò)增德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因片段(SEQ ID NO.3)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在約3.0kb處有一條特異條帶，表明擴(kuò)增成功，圖中泳道1，2為德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因片段PCR反應(yīng)液，泳道3為DNA 500bpladder。
圖5為質(zhì)粒載體pMG36e雙酶切和去磷酸化的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在約3.6kb處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，圖中泳道1為雙酶切并去磷酸化的pMG36e質(zhì)粒，泳道2為pMG36e質(zhì)粒Pst I、Xba I雙酶切后純化產(chǎn)物，泳道3，4為pMG36e質(zhì)粒PstI、Xba I雙酶切反應(yīng)液，泳道5為500bp DNA ladder。
圖6為本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的平板篩選結(jié)果，陽性大腸桿菌生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落，表明本發(fā)明所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌成功，陽性大腸桿菌具有β-半乳糖苷酶活性，圖中箭頭所指即為陽性大腸桿菌。
圖7為本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)及其Pst I、Xba I雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在約3.0kb和3.6kb處出現(xiàn)兩條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，表明擴(kuò)增的β-半乳糖苷酶基因片段已插入載體pMG36e，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，圖中泳道1為DNA marker VI，泳道2為重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ，泳道3為pMG36e-lacZ Pst I、Xba I雙酶切反應(yīng)液，泳道4為500bp DNAladder。
圖8為本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)的測(cè)序圖。
圖9為本發(fā)明所述質(zhì)粒pMG36e-lacZ中插入的β-半乳糖苷酶基因片段序列與L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene(Genbank序列號(hào)GI149546)比對(duì)結(jié)果，pMG36e-lacZ中插入的外源基因序列與Genbank中德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因標(biāo)準(zhǔn)序列相比，符合率為99.5％(按1個(gè)反應(yīng)保真長(zhǎng)度為800bp計(jì))，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，圖中第1條DNA是pMG36e-lacZ中插入的β-半乳糖苷酶基因片段序列，第2條DNA是L.delbrueckii bulgaricus beta-galactosidase gene，( )內(nèi)數(shù)字為第1條DNA堿基數(shù)，[ ]內(nèi)數(shù)字為第2條DNA堿基數(shù)。
圖10為從攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli DH5α/pMG36e-lacZ中提取的重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，圖中泳道1為500bp DNA ladder，泳道2為重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ。
圖11為本發(fā)明所述可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒(pMG36e-lacZ)轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的平板篩選結(jié)果，陽性乳酸乳球菌生長(zhǎng)為藍(lán)色函落，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌成功，陽性乳酸乳球菌具有β-半乳糖苷酶活性，圖中箭頭所指即為陽性乳酸乳球菌。
圖12為PCR擴(kuò)增本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ中的β-半乳糖苷酶基因片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度約為3.0kb的特異條帶，與預(yù)期相符，表明pMG36e-lacZ已成功電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌，圖中泳道1為PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為DNAmarkerIII。
圖13為攜帶本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ的大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性測(cè)定結(jié)果，β-半乳糖苷酶能催化底物ONPG水解產(chǎn)生亮黃色的產(chǎn)物——ONP，使反應(yīng)液顏色變?yōu)榱咙S色，在相同條件下反應(yīng)液顏色越深表明酶活性越大，結(jié)果表明攜帶本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的大腸桿菌超聲破壁液中含有β-半乳糖苷酶，E.coli DH5α超聲破壁液中不含β-半乳糖苷酶，圖中1，2為攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α，3為大腸桿菌DH5α，4為空白對(duì)照。
圖14為攜帶本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ的乳酸乳球菌β-半乳糖苷酶活性測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明攜帶本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌超聲破壁液中含有β-半乳糖苷酶，L.lactis超聲破壁液中不含β-半乳糖苷酶，圖中1為攜帶重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌，2為L(zhǎng).lactis，3為空白對(duì)照。
圖15為表達(dá)非融合β-半乳糖苷酶的本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ的翻譯偶聯(lián)調(diào)控片段各元件組成，ATG為載體來源起始密碼，A[TG為非融合蛋白來源起始密碼，[TGA]示載體來源小肽的終止密碼；載體來源小肽密碼子以阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)出，非融合蛋白密碼子以帶括弧的阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)出，加有雙底線的序列為SEQ ID NO.1中的SD序列，加有波浪線的序列為Xba I酶切位點(diǎn)。
圖16為攜帶本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ的乳酸乳球菌粗酶液和上清液β-半乳糖苷酶活性測(cè)定結(jié)果，結(jié)果可見粗酶液和上清液中均有明顯的β-半乳糖苷酶活性，圖中1為粗酶液酶促反應(yīng)結(jié)果，2為上清液酶促反應(yīng)結(jié)果，3為空白對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明下述實(shí)施例中德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株可購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，或分離自活菌發(fā)酵酸奶，分離方法見《酸奶中保加利亞乳桿菌分離條件的優(yōu)化》(汪川，張朝武，余倩.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13(2)73-74，80)。大腸桿菌DH5α購買于天根生化科技(北京)有限公司。乳酸乳球菌菌種可購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。所用各種分子生物學(xué)工具酶和試劑盒購買于天根生化科技(北京)有限公司和寶生物工程(大連)有限公司。引物合成和基因測(cè)序由Invitrogen上海公司完成。
實(shí)施例1可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例及后續(xù)各實(shí)施例中，將可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒命名為pMG36e-lacZ。其構(gòu)建方法的步驟如下(1)擴(kuò)增德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因片段(SEQ ID NO.3)將德氏乳桿菌保加利亞亞種菌種從-20℃冰箱取出，37℃水浴融化后劃線MRS平板，于37℃培養(yǎng)48h，挑菌落轉(zhuǎn)種5ml MRS肉湯，37℃培養(yǎng)24h，用小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA作為模板，抽提產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢查，陽性結(jié)果在＞10kb處有一明顯的條帶(見圖3)。設(shè)計(jì)合成上下游引物，上游引物lacZf15‘-GCGTCTAGAGAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3’，下游引物lacZr15‘-GCGCTGCAGTTATTTTAGTAAAAGGGGCTGA-3’。按表1加樣，PCR擴(kuò)增德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，在3.0kb處可得到一條特異條帶(見圖4)。制備0.8％瓊脂糖凝膠，將300μl PCR反應(yīng)液全部上樣電泳，在紫外燈下切下含β-半乳糖苷酶基因片段的凝膠，用Gel Extraction Kit回收純化成30μl。
表1 PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因片段 (2)β-半乳糖苷酶基因片段Pst I、Xba I雙酶切及酶切產(chǎn)物純化取無菌1.5ml EP管，按表2加樣，對(duì)純化的基因片段進(jìn)行Pst I、Xba I雙酶切。
表2 β-半乳糖苷酶基因片段Pst I、Xba I雙酶切體系表

瞬時(shí)離心使各成分集中于管底，于37℃水浴反應(yīng)4h。將全部酶切反應(yīng)液用Cycle-Pure kit純化成30μl。
(3)pMG36e質(zhì)粒的提取E.coli DH5α/pMG36e菌種從-20℃冰箱取出，37℃水浴融化后劃線含紅霉素300μg/ml的LB平板(以下簡(jiǎn)稱LB-Ery平板)，于37℃培養(yǎng)24h。挑單菌落接種5ml含紅霉素300μg/ml的LB肉湯(以下簡(jiǎn)稱LB-Ery肉湯)，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)12～16h。吸取1.5ml肉湯于1.5ml EP管中，12000r/min離心1min收集細(xì)菌，用Plasmid Miniprepkit提取pMG36e質(zhì)粒。
(4)質(zhì)粒pMG36e Pst I、Xba I雙酶切及酶切產(chǎn)物純化取無菌1.5ml EP管，按表3加樣，對(duì)提取的pMG36e進(jìn)行Pst I、Xba I雙酶切。瞬時(shí)離心使各成分集中于管底，于37℃水浴反應(yīng)4h。將全部酶切反應(yīng)液用Cycle-Pure kit純化成30μl。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后在約3.6kb處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期相符(見圖5)。
表3 pMG36e Pst I、Xba I雙酶切體系表

(5)雙酶切后的pMG36e去磷酸化取無菌1.5ml EP管，按表4加樣，對(duì)雙酶切后的pMG36e去磷酸化。
表4 雙酶切后的pMG36e去磷酸化反應(yīng)體系表

瞬時(shí)離心使各成分集中于管底，于50℃水浴反應(yīng)30min。將全部反應(yīng)液用Cycle-Purekit純化成30μl。pMG36e雙酶切后去磷酸化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。
(6)感受態(tài)大腸桿菌DH5α的制備從-20℃冰箱取出大腸桿菌DH5α菌種，置37℃水浴融化后，吸50～100μl菌種液于5ml LB肉湯，37℃ 220r/min培養(yǎng)12～16h。吸1ml菌液于預(yù)熱的100ml LB肉湯培養(yǎng)瓶中，37℃220r/min培養(yǎng)至A600＝0.35左右，停止培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)移至兩支無菌、預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中(40ml菌液/管)，于冰上放置10min，4℃ 4000r/min離心7min，棄上清。將管倒置1min使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。離心管中加入預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液7ml重懸菌沉淀，4℃ 4000r/min離心7min，棄上清。將管倒置1min使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。離心管中加入預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重懸菌沉淀，于冰上放置30min。4℃ 4000r/min離心7min，棄上清，將管倒置1min使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。離心管中加入預(yù)冷的CaCl2凍存液1.6ml重懸菌沉淀，分裝預(yù)冷EP管(100μl/管)，立即于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> (7)β-半乳糖苷酶基因片段與pMG36e連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α取無菌100μl PCR反應(yīng)管，按表5加樣進(jìn)行連接反應(yīng)。
表5 β-半乳糖苷酶基因片段與pMG36e連接

瞬時(shí)離心使各成分集中于管底，于16℃連接3h，22℃連接1h。
用預(yù)冷槍頭吸5μl連接反應(yīng)液于預(yù)冷100μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，用手指輕彈管底使液體混合均勻，置冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴3min。加入800μl 37℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，于37℃ 160r/min培養(yǎng)1h，12000r/min離心數(shù)s，棄700μl上清。用槍頭輕輕吹散菌沉淀，取150μl菌液于含紅霉素300μg/ml，X-gal 40μg/ml的LB平板(以下簡(jiǎn)稱LB-Ery-X-gal平板)中央，用無菌L形玻棒將菌液涂布整個(gè)平板，于37℃培養(yǎng)48～72h。陽性菌生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落(見圖6)。
(8)陽性克隆的鑒定①提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定陽性克隆接種LB-Ery肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)12～16h。使用Plasmid Miniprepkit，按說明書操作說明，收集2.5ml肉湯中細(xì)菌于1.5ml EP管中，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒用Pst I、Xba I雙酶切，酶切反應(yīng)體系見表6。瞬時(shí)離心使各成分集中于管底，于37℃水浴反應(yīng)4h。0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切片段，結(jié)果在約3.0kb和3.6kb處出現(xiàn)兩條條帶(見圖7)，表明β-半乳糖苷酶基因片段已插入載體，重組質(zhì)粒鑒定合格。
表6 重組質(zhì)粒Pst I、Xba I雙酶切體系表

②重組質(zhì)粒測(cè)序陽性克隆交Invitrogen上海公司，由該公司對(duì)重組質(zhì)粒中插入的β-半乳糖苷酶基因片段進(jìn)行測(cè)序。以上游引物lacZf1為測(cè)序引物，進(jìn)行1個(gè)反應(yīng)，結(jié)果見圖8，圖9。測(cè)序結(jié)果表明，pMG36e-lacZ中插入的外源基因序列與genebank中德氏乳桿菌保加利亞亞種β-半乳糖苷酶基因標(biāo)準(zhǔn)序列相比，符合率分別為99.5％(按1個(gè)反應(yīng)保真長(zhǎng)度為800bp計(jì))。表明β-半乳糖苷酶基因片段已插入載體，重組質(zhì)粒鑒定合格。
(9)重組質(zhì)粒的提取和保存經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定合格的重組質(zhì)粒可保存于-20℃環(huán)境中；攜帶有鑒定合格的重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α(以下簡(jiǎn)稱E.coli DH5α/pMG36e-lacZ)菌種可于-20℃保存或-70℃長(zhǎng)期保存，必要時(shí)可將其復(fù)蘇培養(yǎng)后再從其中提取重組質(zhì)粒(見圖10)。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌(1)電轉(zhuǎn)化用乳酸乳球菌細(xì)胞的制備從-20℃冰箱取出乳酸乳球菌菌種，于37℃水浴融化后，劃線MRS平板30℃培養(yǎng)48h。從平板上挑菌落接種5ml MRS肉湯，30℃培養(yǎng)12～16h，吸取5ml菌液至100ml MRS肉湯，30℃培養(yǎng)至A600為0.5～0.8(約4h)。停止培養(yǎng)前1h，加入氨芐青霉素使其終濃度為20μg/ml。停止培養(yǎng)后吸取菌液于潔凈、無菌、預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，置冰浴10min。4℃離心4000r/min 7min，棄上清，將管倒置，用無菌濾紙條吸凈殘留液體。加入20ml冰冷甘油緩沖液重懸菌沉淀，于4℃離心4000r/min 7min，棄上清，再用20ml冰冷甘油緩沖液洗1次。加入500μl冰冷甘油緩沖液重懸菌沉淀，分裝預(yù)冷無菌EP管(100μl/管)，立即于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌從-70℃冰箱取出裝有100μl乳酸乳球菌細(xì)菌的EP管放于冰上融化，用預(yù)冷槍頭吸入在冰上預(yù)冷的重組質(zhì)粒10μl，用手指輕彈管底使液體混合均勻，置冰浴5min。用預(yù)冷槍頭將EP管內(nèi)全部液體吸入放冰浴預(yù)冷的轉(zhuǎn)化杯(間距0.1cm)樣品槽中，放冰上5min。取出轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)電擊1次(電擊參數(shù)為2KV，5ms)，立即取出電轉(zhuǎn)杯放冰浴5min。加入700μl于37℃預(yù)溫的MRS蔗糖肉湯于電轉(zhuǎn)杯中，輕輕用槍頭吹出樣品槽內(nèi)菌液并混勻，將電轉(zhuǎn)杯內(nèi)全部液體吸至無菌EP管中，于37℃靜止培養(yǎng)3h。取200μl菌液于含紅霉素5μg/ml，X-gal 40μg/ml的MRS平板(以下簡(jiǎn)稱MRS-Ery-X-gal平板)中央，用無菌L形玻棒將菌液涂布整個(gè)平板，于30℃培養(yǎng)48～72h。陽性菌(L.lactis/pMG36e-lacZ)生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落(見圖11)。
(3)陽性克隆的鑒定從待鑒定的陽性菌中提取重組質(zhì)粒，以其為模板PCR鑒定其中的β-半乳糖苷酶基因片段。
①重組質(zhì)粒的提取待鑒定的陽性菌劃線MRS-Ery-X-gal平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取平板上菌落接種5ml含紅霉素5μg/ml的MRS肉湯(以下簡(jiǎn)稱MRS-Ery肉湯)，30℃ 220r/min培養(yǎng)12～16h。離心(12000r/min 1min/次)收集5ml菌液于1.5ml EP管中，棄上清，加入230μl溶菌酶溶液(25mg/ml)、20μl RNase A(4mg/ml)重懸菌沉淀，于37℃水浴作用1h。然后用Plasmid Miniprep kit提取質(zhì)粒(按操作說明書，從第4步開始)。
②以重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因片段按表7加樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因片段。
表7 PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因片段 PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖12，可見擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度約為3.0kb的特異條帶，與預(yù)期相符，表明pMG36e-lacZ已成功電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌。
實(shí)施例3重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ在大腸桿菌DH5α中的表達(dá)重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后獲得陽性菌E.coli DH5α/pMG36e-lacZ，測(cè)定該菌的β-半乳糖苷酶活性以研究重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ在大腸桿菌中的表達(dá)情況。
E.coli DH5α/pMG36e-lacZ劃線LB-Ery-X-gal平板，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml LB-Ery肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；E.coli DH5α劃線LB平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取平板上單菌落接種15ml LB肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h。分別取菌液10ml于50ml離心管中(10ml菌液/離心管)，4℃離心15000r/min 3min，棄上清，菌沉淀用pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，最后加入10ml磷酸鹽緩沖液重懸。將離心管置于冰上，用超聲波破碎儀破壁，制備粗酶液。超聲破壁條件為輸出功率50W，脈沖持續(xù)時(shí)間6S，間隙2S，脈沖9次。按表8操作測(cè)定粗酶液中β-半乳糖苷酶活性。1個(gè)酶活性單位(U)定義為在37℃下每分鐘分解出1μmolONP所需的酶量。
表8 β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

于25℃靜置15min，以空白調(diào)零，測(cè)定試驗(yàn)管A420。
按下式計(jì)算酶活性(U/ml)U/ml=A420×84.45×t×v]]>t酶促反應(yīng)時(shí)間；v樣品體積用總蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定粗酶液中總蛋白濃度(pro mg/ml)，將結(jié)果換算為酶比活性(U/mg pro)U/mg pro=U/mlpromg/ml]]>酶活測(cè)定結(jié)果見表9，圖13。
表9 E.coli DH5α和E.coli DH5α/pMG36e-lacZ的β-半乳糖苷酶活測(cè)定

注-無法檢出；1#和2#菌株中插入的β-半乳糖苷酶基因片段擴(kuò)增自不同的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株；表中數(shù)據(jù)均為5次測(cè)定的平均值。
酶活測(cè)定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，可在其中表達(dá)產(chǎn)生具有活性的β-半乳糖苷酶。
實(shí)施例4重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ在乳酸乳球菌中的表達(dá)重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌后獲得陽性菌L.lactis/pMG36e-lacZ，測(cè)定該菌的β-半乳糖苷酶活性以研究重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ在乳酸乳球菌中的表達(dá)情況。
L.lactis/pMG36e-lacZ劃線MRS-Ery-X-gal平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml MRS-Ery肉湯，30℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；L.lactis劃線MRS平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取平板上菌落接種15ml MRS肉湯，30℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h。按實(shí)施例3中方法測(cè)定和計(jì)算粗酶液中β-半乳糖苷酶活性，不同之處僅為制備粗酶液時(shí)的超聲破壁條件改為輸出功率50W，脈沖持續(xù)時(shí)間6S，間隙2S，脈沖13次。
酶活測(cè)定結(jié)果見表10，圖14。
表10 L.lactis和L.lactis/pMG36e-lacZ的β-半乳糖苷酶活測(cè)定

注-無法檢出；1#和2#菌株中插入的β-半乳糖苷酶基因片段擴(kuò)增自不同的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株；表中數(shù)據(jù)均為5次測(cè)定的平均值。
酶活測(cè)定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pMG36e-lacZ轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌后，可在其中表達(dá)產(chǎn)生具有活性的β-半乳糖苷酶。
實(shí)施例5重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白非融合性分析本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新為采用非融合表達(dá)技術(shù)，在擴(kuò)增β-半乳糖苷酶基因片段時(shí)，將其上游的一段長(zhǎng)18bp的序列(SEQ ID NO.1)一起擴(kuò)增出來，SEQ ID NO.1含有SD序列，可實(shí)現(xiàn)在融合表達(dá)載體上進(jìn)行非融合蛋白表達(dá)。采用的上下游引物序列如下上游引物lacZf15‘-GCGTCTAGAGAAGGGAAGAATTAGAAAATGA-3’，下游引物lacZr15‘-GCGCTGCAGTTATTTTAGTAAAAGGGGCTGA-3’。
利用該引物擴(kuò)增所得的基因插入pMG36e后的翻譯偶聯(lián)調(diào)控片段各元件組成見圖15。從圖中可見，如果SEQ ID NO.1中的SD序列不能被宿主菌識(shí)別，那么蛋白的表達(dá)將是融合表達(dá)，即從載體來源起始密碼ATG開始進(jìn)行翻譯，此時(shí)β-半乳糖苷酶蛋白的三聯(lián)密碼將出現(xiàn)移位，即β-半乳糖苷酶蛋白的起始密碼將發(fā)生錯(cuò)位，結(jié)果將導(dǎo)致翻譯出完全錯(cuò)誤的蛋白。只有在進(jìn)行非融合表達(dá)即從β-半乳糖苷酶蛋白起始密碼ATG進(jìn)行翻譯才可能得到具有酶活性的蛋白。實(shí)施例3和4中酶活測(cè)定結(jié)果可證實(shí)，本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒確能表達(dá)非融合的β-半乳糖苷酶。
實(shí)施例6陽性菌與基因初始菌的β-半乳糖苷酶活性比較E.coli DH5α/pMG36e-lacZ劃線LB-Ery-X-gal平板，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml LB-Ery肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；L.lactis/pMG36e-lacZ劃線MRS-Ery-X-gal平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml MRS-Ery肉湯，30℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；德氏乳桿菌保加利亞亞種劃線MRS平板，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上單菌落接種15ml MRS肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h。按實(shí)施例3和實(shí)施例4方法測(cè)定和計(jì)算各菌β-半乳糖苷酶活性，其中保加利亞乳桿菌粗酶液制備中采用的超聲破壁條件同實(shí)施例4。結(jié)果見表11。
表11 陽性轉(zhuǎn)化菌及基因初始菌的β-半乳糖苷酶活測(cè)定

注表中數(shù)據(jù)均為5次測(cè)定的平均值。
從表中可見，攜帶pMG36e-lacZ質(zhì)粒的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活性為基因初始菌的11.86倍，酶比活性為基因初始菌的1.38倍；攜帶pMG36e-lacZ質(zhì)粒的乳酸乳球菌的β-半乳糖苷酶活性為基因初始菌株的3.94倍，酶比活性為基因初始菌的2.75倍，表明pMG36e-lacZ質(zhì)?？稍诖竽c桿菌和乳酸乳球菌中高效表達(dá)β-半乳糖苷酶。
實(shí)施例7陽性菌與基因初始菌的β-半乳糖苷酶分泌率比較E.coli DH5α/pMG36e-lacZ劃線LB-Ery-X-gal平板，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml LB-Ery肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；L.lactis/pMG36e-lacZ劃線MRS-Ery-X-gal平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取平板上藍(lán)色菌落接種15ml MRS-Ery肉湯，30℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h；德氏乳桿菌保加利亞亞種劃線MRS平板，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上單菌落接種15ml MRS肉湯，37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)24h。分別取菌液10ml于50ml離心管中(10ml菌液/離心管)，4℃離心15000r/min 3min，分別收集菌沉淀和上清于潔凈試管中。按實(shí)施例3，實(shí)施例4和實(shí)施例6中方法測(cè)定和計(jì)算粗酶液中β-半乳糖苷酶活性，同時(shí)按表8操作測(cè)定上清液中β-半乳糖苷酶活性。按下式計(jì)算酶分泌率

結(jié)果見表12，圖16。
表12 陽性轉(zhuǎn)化菌及基因初始菌的β-半乳糖苷酶分泌率測(cè)定

注-無法檢出；表中數(shù)據(jù)均為5次測(cè)定的平均值。
結(jié)果表明，本發(fā)明所述的pMG36e-lacZ質(zhì)粒在乳酸乳球菌中表達(dá)的β-半乳糖苷酶能部分分泌到胞外，其分泌率最高可達(dá)27.1％，顯著高于基因初始菌(3％)。
SEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)<120>可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用<160>3<170>PatentIn Version 3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)<400>1gaagggaaga attagaaa 18<210>2<211>3024<212>DNA<213>德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)<400>2atgagcaata agttagtaaa agaaaaaaga gttgaccagg cagacctggc ctggctgact 60gacccggaag tttacgaagt caatacaatt cccccgcact ccgaccatga gtccttccaa 120agccaggaag aactggagga gggcaagtcc agtttagtgc agtccctgga cggggactgg 180ctgattgact acgctgaaaa cggccaggga ccagtcaact tctatgcaga agactttgac 240gatagcaatt ttaagtcagt caaagtaccc ggcaacctgg aactgcaagg ctttggccag 300
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1.一種可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，其特征在于所含基因由編碼β-半乳糖苷酶的基因及該基因上游含SD位點(diǎn)的調(diào)控序列組成，為序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒，其特征在于以質(zhì)粒pMG36e為載體。
3.一種權(quán)利要求1所述的可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)以德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到含上游調(diào)控序列的β-半乳糖苷酶基因；(2)將上述擴(kuò)增得到的β-半乳糖苷酶基因用Pst I、Xba I雙酶切后與用同種酶雙酶切并去磷酸化的載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；(3)篩選陽性大腸桿菌，提取陽性大腸桿菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建質(zhì)粒選用的載體為pMG36e。
5.權(quán)利要求1所述的可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒在制備β-半乳糖苷酶中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的可表達(dá)和分泌β-半乳糖苷酶的大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒在構(gòu)建可表達(dá)β-半乳糖苷酶的乳酸菌株中的應(yīng)用。
全文摘要
一種可表達(dá)和分泌β－半乳糖苷酶的大腸桿菌－乳酸菌穿梭質(zhì)粒，所含基因由編碼β－半乳糖苷酶的基因及該基因上游含SD位點(diǎn)的調(diào)控序列組成。實(shí)驗(yàn)證明，上述重組質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化乳酸乳球菌，在大腸桿菌和乳酸乳球菌中高效表達(dá)非融合β－半乳糖苷酶，在β－半乳糖苷酶制備和構(gòu)建可表達(dá)β－半乳糖苷酶的乳酸菌株中應(yīng)用。構(gòu)建方法包括以下步驟以德氏乳桿菌保加利亞亞種基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到含上游調(diào)控序列的β－半乳糖苷酶基因；將上述擴(kuò)增得到的β－半乳糖苷酶基因雙酶切后與用同種酶雙酶切并去磷酸化的載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；篩選陽性大腸桿菌，提取陽性大腸桿菌中重組質(zhì)粒酶切鑒定并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序。
文檔編號(hào)C12N15/56GK101033471SQ200710048430
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者汪川, 張朝武, 劉衡川, 余倩, 許欣, 裴曉方, 王國慶, 林怡伶 申請(qǐng)人:四川大學(xué)