專利名稱：抗農(nóng)作物真菌多肽及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組的抗農(nóng)作物真菌多肽的基因、重組質粒、多肽及其制備方法。
背景技術：
真菌感染是農(nóng)作物的常見危害，比如造成稻瘟病的真菌稻梨孢每年給我國的稻米 生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，危害性極大。隨著我國廣大農(nóng)業(yè)地區(qū)加速城鎮(zhèn)化，生態(tài) 環(huán)境污染和惡化日益加劇，農(nóng)作物病害發(fā)病率直線上升，農(nóng)作物病害的生態(tài)防治已 成為我們必需面對和解決的重大問題。
現(xiàn)用抗菌農(nóng)藥對農(nóng)作物感染真菌療效不理想；真菌屬真核細胞，它和人體細胞的 相似性使得農(nóng)用抗真菌藥物如三環(huán)唑類在殺傷真菌細胞的同時也殺傷人體細胞。長 期使用環(huán)唑類等化學藥物誘使真菌對其產(chǎn)生了耐藥性，而農(nóng)民為抑制農(nóng)作物真菌感 染往往不惜超劑量多次重復用藥，這就造成農(nóng)作物真菌耐藥性進一步加重；同時也 造成農(nóng)藥在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量越來越大，因此人類一直在致力于開發(fā)高效且 無污染的抗真菌農(nóng)藥。
近年來真菌基礎研究取得很大的進展，已確定某些真菌如白色念珠菌信息素的氨 基酸序列，是14個氨基酸殘基組成的多肽。它可以在生活介質中自由游動，具有自 動尋找同種真菌細胞胞膜上相應受體的生物學活性。因此可以利用真菌信息素的這
種自動尋找活性來誘導大腸菌素這一類細菌外毒素到達這些真菌的細胞膜上形成離 子通道來殺傷這些真菌，從而構建出一類新型生物農(nóng)藥。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供新型的重組抗農(nóng)作物真菌多肽的基因、重組質粒、多肽， 此種多肽能特異的殺滅農(nóng)作物真菌細胞而不會傷害人體正常細胞，且防治效果大大 好于現(xiàn)用農(nóng)藥。本發(fā)明的再一目的是提供上述重組抗農(nóng)作物真菌多肽的制備方法。
本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽的基因，含有編碼大腸菌素的基因和編碼白色念珠 菌信息素的基因。將編碼白色念珠菌信息素的基因與大腸菌素基因可操作地連接，從 而獲得表達重組抗農(nóng)作物真菌多肽的核苷酸序列。編碼白色念珠菌信息素的基因為
序列表中SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列。大腸菌素可選自能形成離子通道的大腸
菌素E1或la或Ib或A或B或N。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，將上述白色念 珠菌信息素基因與大腸菌素Ia (SEQ ID NO.l)的羧基端基因連接而形成如序列表中 SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個實施例中，將上述白色念珠菌信 息素基因與大腸菌素la (SEQ ID NO.l)的氨基端基因連接而形成如序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列。
本發(fā)明所述重組質粒，是將如上所述的編碼白色念珠菌信息素的核苷酸序列經(jīng) 雙鏈寡聚核苷酸點突變技術插入大腸菌素的羧基端或氨基端形成本發(fā)明的重組質 粒。若選用大腸菌素Ia，則將編碼白色念珠菌信息素的核苷酸序列插入Ia基因的第 626位氨基酸后(羧基端)或第1位氨基酸前(氨基端)而形成本發(fā)明的諸重組質粒。 構建重組質粒的原始商用質粒pET-15b來自于Novagen公司，其中裝載了大腸菌素la 和相應的Immunity蛋白基因,針對白色念珠菌信息素基因設計了數(shù)對引物,其序列見 實施例1。利用雙鏈寡聚核苷酸點突變技術,按照Strategene公司藥箱操作獲得重組 質粒。
本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽的制備方法，將編碼白 色念珠菌信息素的基因可操作地與大腸菌素基因連接獲得編碼重組抗農(nóng)作物真菌多 肽基因的重組質粒，將獲得的重組質粒轉染入大腸桿菌工程菌中而獲得可產(chǎn)生重組 抗農(nóng)作物真菌多肽的工程菌細胞。用Sepharose High Performance柱分離純化即獲得
本發(fā)明所述的抗農(nóng)作物真菌多肽。
本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽可在制備治療或預防農(nóng)作物真菌感染的農(nóng)藥中應 用。可以通過將本發(fā)明所述的多肽添加藥學上可接受的載體或賦形劑或可選的其它 成分而制成適于農(nóng)作物使用的農(nóng)藥組合物。其機理是本發(fā)明所述多肽中可與靶真 菌細胞表面受體結合的白色念珠菌信息素誘導大腸菌素到達靶農(nóng)作物真菌細胞膜附 近，然后大腸菌素通道形成結構域的疏水區(qū)段插入靶真菌細胞膜中，進而大腸菌素 通道形成結構域在靶農(nóng)作物真菌細胞膜上形成離子通道，使靶農(nóng)作物真菌細胞內容物 泄漏而致真菌細胞死亡，從而達到殺死農(nóng)作物真菌細胞的目的。
本發(fā)明所述的抗農(nóng)作物真菌多肽相較于傳統(tǒng)抗真菌農(nóng)藥的優(yōu)點在于，其具有特 異的靶向性，因而在使用過程中不會攻擊動物細胞，其毒性和不良反應遠低于傳統(tǒng) 抗真菌農(nóng)藥。再由于它是在農(nóng)作物真菌細胞膜上直接形成離子通道來殺傷農(nóng)作物真 菌細胞，因此與傳統(tǒng)抗真菌農(nóng)藥相較，農(nóng)作物真菌細胞對其產(chǎn)生耐藥性的概率要低 得多；在抗農(nóng)作物真菌多肽一離子通道造成泄漏而致農(nóng)作物真菌細胞死亡的這一較短時限內，農(nóng)作物真菌細胞較難利用突變基因 一蛋白表達方式來修復抗農(nóng)作物真菌 多肽一離子通道在真菌細胞膜上造成的幾何缺損，所以農(nóng)作物真菌細胞對本發(fā)明的 抗農(nóng)作物真菌多肽產(chǎn)生耐藥性的概率較低。需要特別說明的是，在本發(fā)明的實施例
中，抗農(nóng)作物真菌多肽對真菌稻梨孢和黃曲霉菌等感染的農(nóng)作物的治療效果至少是 現(xiàn)有農(nóng)藥三環(huán)唑治療效果的數(shù)千倍，證明了本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽具有良好 的應用前景。
本發(fā)明所述方法可得到理想純度的抗農(nóng)作物真菌多肽(大于95%)并最大程 度的保存了它的生物活性，而一般CM柱分離純化的抗農(nóng)作物真菌多肽純度較低 (約80—90%)。


圖1是含有白色念珠菌信息素基因和大腸菌素Ia基因的重組質粒 pCHCEBCHl的結構示意圖。
圖2是含有白色念珠菌信息素基因和大腸菌素Ia基因的重組質粒 pCHCEBCH2的結構示意圖。
圖3是本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽對生長于固體培養(yǎng)基的真菌稻梨孢 的抑制試驗結果，表明抗農(nóng)作物真菌多肽對真菌稻梨孢的生長抑制效應比三環(huán) 唑強數(shù)千倍；圖中A三環(huán)唑5 mg/ml， B三環(huán)哇50pg/ml， C抗農(nóng)作物真菌多 肽2, 5嗎/ml， D抗農(nóng)作物真菌多肽l， 5昭/ml。
圖4是本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽對生長于固體培養(yǎng)基的真菌稻梨孢 的抑制試驗結果，表明抗農(nóng)作物真菌多肽對真菌稻梨孢的生長抑制效應比三環(huán) 唑強數(shù)千倍；圖中A三環(huán)唑5mg/ml， B三環(huán)唑500嗎/ml， C三環(huán)唑50pg/ml, D抗農(nóng)作物真菌多肽l， 5pg/ml。
圖5為本發(fā)明所述抗農(nóng)作物真菌多肽對生長于固體培養(yǎng)基的黃曲霉菌的抑 制試驗結果，表明抗農(nóng)作物真菌多肽對黃曲霉菌的生長抑制效應比三環(huán)唑強數(shù) 千倍；圖中A三環(huán)唑5mg/ml， B三環(huán)唑500pg/ml， C三環(huán)唑50昭/ml， D抗 農(nóng)作物真菌多肽l， 5pg/ml。
圖6為本發(fā)明抗農(nóng)作物真菌多肽在田間實驗的情況；A農(nóng)田劃分用藥區(qū)域 情況，其中，中間區(qū)域Control為空白對照區(qū)域，右邊Ph-CA區(qū)域為本發(fā)明所 述抗農(nóng)作物真菌多肽l使用區(qū)域，左邊Tricyc區(qū)域是三環(huán)唑使用區(qū)域；B田間 調查情況；C噴灑農(nóng)藥情況。
具體實施例方式
實施例1表達抗農(nóng)作物真菌多肽的質粒的構建和重組抗農(nóng)作物真菌多肽 的制備
原始質粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pET-15b商用質粒 (質粒大小6.3kb,購自Novagen公司，上述基因由本實驗室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚 核苷酸點突變技術(QuickChangeTM Kit, Strategene公司)將編碼白色念珠菌信息 素的基因(序列表中SEQIDN0.2所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的 1626位點后，制備出了抗農(nóng)作物真菌多肽的一種重組質粒pCHCCACHl (如圖 l所示)。重組質粒轉染入五.co/z'BL21 (DE3)ply S工程菌里制備多肽，獲得序 列表中SEQIDN0.5所述的抗農(nóng)作物真菌多肽，在繼后的實施例中稱為"抗農(nóng) 作物真菌多肽l"，其分子量為70,000。
突變程序按 Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (catalog#200518)藥箱手冊進行
1、 準備點突變反應物 5ul 10 x buffer
2 ul (10 ng)野生型大腸菌素Ia質粒 lul(125ng)設計的5'-3'寡聚核苷酸引物 lul(125ng)設計的3'-5'寡聚核苷酸引物 1 ul dNTP 雙蒸水50 ul 1 ul pfii
(除質粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)
2、 進行PCR擴增，擴增條件變性95。C, 35秒，退火53°C， 70秒，延伸 68'C，17分共20個循環(huán)；
3、 加入Dpnl內切酶l ul消化母體DNA鏈后(37TU小時)，取l ul反應 物與HMS174感受態(tài)細胞50 ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42°C， 45秒,再置入冰中 2分鐘；
4、 加入NZY培基0.5 ml后220rpm， 37"C搖菌1小時后，取50-100 ul反 應物鋪板(LB培基加1%瓊脂加50 ug/ml氨芐青霉素,37'C過夜)；
5、 18小時后挑菌,循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質粒藥箱提取質
粒均可，測序確定突變成功；
6、 將質粒50 ng與制備的五.co/Z BL21 (DE3) ply工程菌感受態(tài)細胞50 ul冰 孵30分,42°C， 90秒熱沖擊,取50-100 ul反應物加入LB培基0.5 ml, 220 rpm， 37'C搖菌1小時后鋪板(LB培基加1%瓊脂加50 ug/ml氨芐青霉素)37'C孵 育,18小時后挑取菌落；
7、 大量增菌,8-16升LB培基，250rpm， 37°C，6-8小時;離心沉淀菌體，4°C, 6000g, 2b分鐘，取4°C, 20 mM PBS， 0.15 MNaCl, 2mM EDTA， pH 8.0) 50-80ml 懸浮菌體，加入0.2 M PMSF 250微升后行超聲破碎(4'C， 400W， 2分鐘)，高速離 心沉淀破碎菌體(4'C, 75000g， 1.5小時)，取上清裝入分子量15,000的透析袋于 4'C， 20 mM PBS, 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole 10升透析過夜后，將上清上樣 于HisTrap柱(Amersham Biosciences),經(jīng)20 mM PBS， 1 M imidazole, pH 8.0， 4 °C)洗脫后即可得到重組抗農(nóng)作物真菌多肽，經(jīng)20 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA， pH 8.0透析后備用。
下面列出為制備pCHCCACHl質粒的白色念珠菌信息素基因所設計的
具體雙鏈寡聚核苷酸序列
pCHCCACHl
1、 5，-3'
gcg aat aag ttc tgg ggt att GGG TTT CGT CTC ACA AAC TTC taa ata aaa tat aag aca ggc 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GAA GTT TGT GAG ACG AAA CCC aat acc cca gaa ctt att cgc
2、 5，-3'
att ggg ttt cgt etc aca aac ttc GGA TAC TTT GAG CCC GGC AAA taa ata aaa tat
aag aca ggc
3，-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta TTT GCC GGG CTC AAA GTA TCC gaa gtt tgt gag acg aaa ccc aat
實施例2表達抗農(nóng)作物真菌多肽的質粒的構建和重組抗農(nóng)作物真菌多肽 的制備
原始質粒為裝載了大腸菌素Ia和Imimmity蛋白基因的pET-15b商用質粒 (質粒大小6.3kb,購自Novagen公司，上述基因由本實驗室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚 核苷酸點突變技術(QuickChangeTM Kit, Stmtegene公司)將編碼白色念珠菌信息 素的基因(序列表中SEQ ID N0.2所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia的SI 位點前，制備出了抗農(nóng)作物真菌多肽的又一種重組質粒pCHCCACH2 (如圖2 所示)。重組質粒轉染入五.co/z' BL21 (DE3) ply S工程菌里制備多肽，獲得序列 表中SEQIDN0.7所述的抗農(nóng)作物真菌多肽，在繼后的實施例中稱為"抗農(nóng)作 物真菌多肽2"，其分子量為70,000。
突變程序按 Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit Ccatalog#200518)藥箱手冊進行
1、 準備點突變反應物 5ul 10 x buffer
2ul(10ng)野生型大腸菌素Ia質粒
1 ul(125ng)設計的5'-3'寡聚核苷酸引物
lul(125ng)設計的3'-5'寡聚核苷酸引物
1 ul dNTP
雙蒸水50 ul
1 ul pfu
(除質粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)
2、 進行PCR擴增，擴增條件變性95'C, 35秒，退火53°C, 70秒，延伸 68°C， 17分共20個循環(huán)；
3、 加入Dpnl內切酶l ul消化母體DNA鏈后(37'C,1小時)，取1 ul反應 物與HMS174感受態(tài)細胞50 ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42°C, 45秒,再置入冰中 2分鐘；
4、 加入NZY培基0.5 ml后220rpm, 37'C搖菌1小時后，取50-100 ul反 應物鋪板(LB培基加1%瓊脂加50 ug/ml氨芐青霉素，37"C過夜)；
5、 18小時后挑菌，循Qiagene,Gibco等公司的各種商用提取質粒藥箱提取質 粒均可，測序確定突變成功；
6、 將質粒50 ng與制備的￡.co// BL21 (DE3) ply工程菌感受態(tài)細胞50 ui冰 孵30分，42°C， 90秒熱沖擊，取50-100 ul反應物加入LB培基0.5 ml, 220 rpm, 37'C搖菌1小時后鋪板(LB培基加1%瓊脂加50 ug/ml氨芐青霉素)37'C孵 育，18小時后挑取菌落；
7、 大量增菌,8-16升LB培基，250rpm, 37°C,6-8小時;離心沉淀菌體，4°C, 6000g， 20分鐘，取4°C, 20 mM PBS， 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole, 2mM EDTA， pH 8.0) 50-80ml懸浮菌體，加入0.2 M PMSF 250微升后行超聲破碎(4。C, 400W, 2 分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4。C, 75000g， 1.5小時)，取上清裝入分子量 15,000的透析袋于4°C， 20 mM PBS， 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole 10升透析 過夜后，將上清上樣于HisTrap柱(Amersham Biosciences),經(jīng)20 mM PBS， 1 M imidazole, pH 8.0， 4°C)洗脫后即可得到重組抗農(nóng)作物真菌多肽，經(jīng)20 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA， pH 8.0透析后備用。
制備pCHCCACH2質粒的白色念珠菌信息素基因的雙鏈寡聚核苷酸序列 按實施例1的方法設計。
實施例3 抗農(nóng)作物真菌多肽對農(nóng)作物真菌的體外抑制試驗
試驗1:真菌為四川雅安市雨城區(qū)農(nóng)業(yè)局植保站自田間分離的真菌稻梨孢
菌株(P_yn'cw/a"a w^ae)，取菌液5微升(108 CFU/ml級菌量)均勻涂布于沙 博氏固體培基(杭州微生物試劑廠)表面，再放置吸取50^x1各處理液的塑料 小杯于培基表面，各處理液分別為三環(huán)唑濃度5mg/ml，三環(huán)唑濃度50叱/ml， 抗農(nóng)作物真菌多肽2濃度5pg/ml,抗農(nóng)作物真菌多肽1濃度5pg/ml。將培基置 于35°C培養(yǎng)兩日，結果如圖3所示。結果顯示，只有裝三環(huán)唑濃度5mg/ml 的處理液和抗農(nóng)作物真菌多肽1濃度5ng/ml的處理液小杯周圍出現(xiàn)了完整的溶 菌環(huán)。該試驗表明，真菌稻梨孢的生長只能被抗農(nóng)作物真菌多肽1和大劑量的 三環(huán)唑抑制。
試驗2:真菌為從中國農(nóng)科院農(nóng)業(yè)微生物中心購買的真菌稻梨孢菌株，菌 液5微升(1(^CFU/ml級菌量)均勻涂布于沙博氏固體培基(杭州微生物試劑 廠)表面，再放置吸取50 pl各處理液的塑料小杯于培基表面，各處理液分別 為三環(huán)唑濃度5mg/ml，三環(huán)唑濃度500ng/ml，三環(huán)唑濃度50嗎/ml，抗農(nóng)作物 真菌多肽1濃度5嗎/ml。將培基置于35°C培養(yǎng)兩日，結果如圖4所示。結果
顯示，抗農(nóng)作物真菌多肽1小杯周圍出現(xiàn)的溶菌環(huán)大于三環(huán)唑濃度5mg/ml小 杯周圍的溶菌環(huán)，該試驗表明，抗農(nóng)作物真菌多肽1抑制真菌稻梨孢生長的效 力強過三環(huán)唑至少數(shù)千倍。
試驗3:真菌為中國農(nóng)科院農(nóng)業(yè)微生物中心購回的黃曲霉菌菌株
Uwer/gz7/w y amy),菌液5微升(106 CFU/ml級菌量)均勻涂布于沙博氏 固體培基(杭州微生物試劑廠)表面，再放置吸取50pl各處理液的塑料小杯 于培基表面，各處理液分別為濃度5mg/ml，三環(huán)唑濃度500pg/m1,三環(huán)唑濃 度50嗎/ml，抗農(nóng)作物真菌多肽l濃度5pg/ml。將培基置于35°C培養(yǎng)兩日，結 果如圖5所示。結果顯示，抗農(nóng)作物真菌多肽l小杯周圍出現(xiàn)的溶菌環(huán)大于三 環(huán)唑濃度5mg/ml小杯周圍的溶菌環(huán)，該試驗表明，抗農(nóng)作物真菌多肽1抑制 黃曲霉菌生長的效力強過三環(huán)唑至少數(shù)千倍。
實施例4 抗農(nóng)業(yè)真菌多肽對抗稻瘟病的田間保護試驗
1、 實驗材料
(1) 藥物
抗農(nóng)作物真菌多肽1和三環(huán)唑(對照)。
(2) 農(nóng)作物及受試真菌 田間水稻及水稻植株感染的真菌稻梨孢
2、 實驗方法
隨機選擇稻瘟病發(fā)病較重之稻田，按測試標準將稻田劃分成使用抗農(nóng)作物真 菌多肽1 (Ph-CA)、三環(huán)唑(Tricyc)和空白對照(Control)三個區(qū)域，將抗 農(nóng)作物真菌多肽1(液體劑)、三環(huán)唑(粉劑)分別用稻田水按比例稀釋成10嗎/ml 抗農(nóng)作物真菌多肽1和2mg/ml三環(huán)唑的使用濃度，在稻瘟病葉瘟期和莖瘟期 各噴灑一次，10—14天后按稻瘟病檢測標準分別檢査和記錄抗農(nóng)作物真菌多肽 1、三環(huán)唑和空白對照區(qū)域的葉瘟期保護率和莖瘟期損害率。稻谷成熟后在三個 區(qū)域抽樣采集稻穗，稱取千粒重比較防治效果。實地情況如圖6所示。
3、 結果
2005年和2006年兩年的田間實驗結果顯示，在上述使用濃度下，抗農(nóng)作 物真菌多肽1和三環(huán)唑得到了較為相近的防治效果抗農(nóng)作物真菌多肽1葉瘟 期保護率71 %，莖瘟期損害率0.53 %，三環(huán)唑葉瘟期保護率75 %，莖瘟期
損害率1.6% 。
抗農(nóng)作物真菌多肽l的分子量(MW70,000)是三環(huán)唑分子量(MW189)的 370倍，而抗農(nóng)作物真菌多肽1和三環(huán)唑的使用濃度相差200倍，因此，若按 相同藥物分子數(shù)量標化后進行比較，本實施例表明，本發(fā)明所述的抗農(nóng)作物真 菌多肽對抗稻瘟病感染的防治效果應是三環(huán)唑防治效果的74,000倍。
三環(huán)唑區(qū)域(Tricyc)抽樣采集的稻谷千粒重為17.65 mg和20.5 mg，空 白對照區(qū)域(Control)抽樣采集的稻谷千粒重為18.6 mg禾卩20.95 mg,抗農(nóng)作 物真菌多肽1區(qū)域(Ph-CA)采集的稻谷千粒重為24.05 mg和24.2 mg 。按 此數(shù)據(jù)計算，抗農(nóng)作物真菌多肽l區(qū)域抽樣采集的稻谷千粒重比空白對照區(qū)域 抽樣釆集的稻谷千粒重增加了 13.4_29.3%。
由于田間檢查只統(tǒng)計稻瘟病造成的損傷，而稻田里的真菌病害除了稻瘟病 以外，還有其它真菌病害，如黃曲霉菌、黑曲霉菌等真菌病害。千粒重統(tǒng)計的 是抗農(nóng)作物真菌多肽1防治所有真菌病害的綜合累積。
<110〉丘小慶
<120〉抗農(nóng)作物真菌多肽及其制備方法
<160> 7
<170> Patentln Version 3.2
<210> 1 <211>翻
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221 > misc—feature
<222> (1).....(1878) <223>大腸菌素Ia基因
<400> 1
atgtctgaccctgtacgtat tacaaatccc
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gatccgagatttgccggtacgataaaaatc960
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cgg組ccggtggtgacagaggatgtggaa1080
gctg犯tgggataagtt3cggcaaagattg1140
g組ctgcggtaaattcggc薦
gc犯atgacgctctt犯tgccctgttgaag1260
ggcatcaatc卿3g3tELgCggaagagaaa1320
gELCgC犯t"Uatttcacaacagagttcctg菌
gctgagcagttagccagagagatggccggg1440
ga卿ggcattaaaaacgta1500c鵬ctgaca gagtctgtga
t3tgC3ggM
acggctcttg tatggtttac 犯taagttct
agctgtctga astttacaag ggcgtcctct tggcactggt tgatggctgt ggggtatt
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肌agatcgtg aatctgaaca tggstcactg ac3ga^cc3 cttaccggaa ctgattgatg
cagcgattgc gattcagtcg agtttggt犯 tcatagcagg gcgctttagg aatcgcttgt
cgcagccctt 1560
gggactggga 1620
ggctgtccgg 1680
caatgccgca 1740
cattatcggg 1800
ggM333gCg 1860
1878
<210> 2
<211> 42
<212> DNA <213>
<220>
<222> (1)(42)
<223>白色念珠菌信息素基因
<400> 2
gggtttcgtctcacaaacttcggatactttgagcccggca aa
<210> 3
<211> 14
<212> PRT <213>人工序列
<223>白色念珠菌信息素氨基酸序列
<400> 3
Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys 1 5 10
<210> 4 <211>1920 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222> (1).....( 1920)
<223>編碼抗農(nóng)作物真菌多肽l核苷酸序列<400> 4
atgtctgaccctgtacgtattac犯atcccggtgC卿3tcgctggggtatgattcagat60
ggccatg犯attatggccgttgatatttatgta咖cctccacgtgtcgatgtctttcat120
ggtaccccgcctgcatggagg ttccttcgggaacaaaaccatctggggcgg扁cgagtgg180
cccc肌cccgaagtgatatcga認犯gggacaaggaaatcacagcgtac240
tcagcgcgcaaatg卿ataagcgtactga300
cgcctctctgcggcgattgetgc卿gg犯acacactg犯aacactccgt360
gccggaaacgc卿tgccgctgatattacaCg織gg3gttcagactcctgcaggcagag420
ctg卿g犯tacggattccgtactgaaatcgccggatatgacgccctccggctgcataca■
g聊gccggatgctgtttgctgatgctgattctcttcgtateitctccccgggaggccagg540
tcgtt組cgaacaggctgaaaggatgcgcca卿鄉(xiāng)cc600
gctgatatgcttgctgaatacgagcgc聊tggacscccggttgtc卿g660
ctgg犯犯犯atggcggggcagcccttgccgttcttgatgcac犯c鄉(xiāng)cccgtctgctc720
gggcagcagaC￡LCgg￡L3tg￡Lcagggccatttc卿ggcccggaataaactcagttcagtg780
3Cgg犯tCgCtt犯C3CggCCCgt^tgC3tt犯cc卿gctg犯caacagctgscgc犯840
cgcctgacggcaaaacgatagtttcccctgaaa犯ttcccggggcgttca900
"t caacaaatcattctattgttgtgagcggtgatccg卿tttgccggtac960
acaaccagcgcagtcatcgataaccgtgca犯cctg組tatcttctgagccattccggt1020
ctggactata犯CgC犯t3ttctgaatgaccgg犯tccggtggtgac卿g樹gtggaa1080
ggtgaca卿tgctg犯gttgctgaatggggc犯卿ttg1140
cttgatgccacacctctgctgaatctgcggtaaattcggcgagaaataac畫
ctcagtgccag犯caaBtgagca犯tgacgctcttaatgccctgttg卿1260
atatacgtaaccagctttccggcatc組c卿卿tagcg,g卿aa1320
ggcaacgaaag3CgC犯tt3卿gttcctg1380
a犯tcagttttggtgca犯agctgagcagttagccag卿gatggccggg1440
caggctaaaggg犯gaa組acgtaatgttgaagaggcatt犯aaacgteitgaa卿tac1500
cgggctgacattaacaaaaaaMtaatgcaaa卿tcgtgcagcgattgcCgC3gCCCtt1560
gagtctgtgaagctgtctgatatatcgtctgattcagtcggggactggga1620
tatgcagg3aaatttacaagtcttgctgactggatcactgagtttggt犯ggctgtccgg1680
3C卿g犯Ctggcgtcctctttttgttaaatcatagcaggcaatgccgca1740
acggctcttgtggcactggtcttcagtattcttaccgg犯gcgctttaggcattatcggg1800
tatggtttactgatggctgtcaccggtgcgctgattgatgaatcgcttgtgg咖犯gcg腳
犯t犯gttctggggtattgggtttcgtctcac犯acttcggatactttga1920
<210> 5 <211> 639 <212> PRT <213>人工序列
<223>編碼抗農(nóng)作物真菌多肽l氨基酸序列 <400> 5
Ser Asp Pro Val. Arg lie Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr
5 10 15
Asp Ser Asp Gly His Glu lie Met Ala Val Asp lie Tyr Val Asn Pro
20 25 30
Pro Arg Val Asp Val. Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe
35 40 45
Gly Asn Lys Thr lie Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro
50 55 60
Thr Arg Ser Asp lie Glu Lys Arg Asp Lys Glu lie' Thr Ala Tyr Lys 65 70 75 80
Asn Thr Leu Ser Ala Gin Gin Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu
85 90 95
Ala Gly Lys Arg丄eu Ser Ala Ala lie Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu
100 105 110
Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp lie
115 120 125
Thr Arg Gin Glu Phe Arg Leu Leu Gin Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Glu lie Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu 145 150 155 160
Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg lie Ser Pro Arg
165 170 175
Glu Ala Arg Ser Leu lie Glu Gin Ala Glu Lys Arg' Gin Lys Asp Ala
180 185 190
Gin Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
Arg Lys Gly lie Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly
210 215 220
Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gin Gin Ala'Arg Leu Leu Gly 225 230 235 240
Gin Gin Thr Arg Asn Asp Arg Ala lie Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu
245 250 255
Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg
260 265 270
Ala Glu Gin Gin Leu Thr Gin Gin Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr
275 280 285
lie Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser
290 295 300
lie Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr lie Lys lie Thr 305 310 315 320
Thr Ser Ala Val lie Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser
325 330 335
His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn I1& Leu Asn Asp Arg Asn Pro
340 345 350
Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys lie Tyr Asn Ala Glu 355 360 365 Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gin Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn
370 375 380
Lys lie Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu 385 390 395 400
Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gin Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala
405 410 415
Leu Uu Lys Glu Lys Glu Asn lie Arg Asn Gin Leu Ser Gly lie Asn
420 425 430
Gin Lys lie Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gin Asp Glu Leu Lys Ala Thr
435 440 Lys Asp Ala lie Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
450 455 Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gin Leu 465 470 Ala Lys Gly Lys Lys lie Arg Asn Val 485
Glu Lys Tyr Arg Ala Asp lie Asn Lys 500 505 Ala Ala lie Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp
445
Phe Leu Lys Ser Val 460
Ala Arg Glu Met Ala 475
Glu Glu Ala Leu Lys 490
Lys lie Asn Ala Lys
Ser
Gly Gin ■
Thr Tyr 艦
Asp Arg 510
lie Ser
Ser Asn 530 Thr Ser 545
Glu Asn
Asn Ala
Ser Ala
Ala Leu 610 lie Gly 625
515 Leu
Leu
Trp
Ala
Leu 595 Ilu
Phe
Asn Arg Phe Ser 535
Ala Asp Trp lie 550
Arg Pro Leu Phe 565
Thr Ala Lue Val 580
Gly lie lie Gly
Asp Glu Ser Leu 615
520 Arg
Thr
Val
Ala
Tyr 600 Val
Gly
Glu
Lys
Leu 585 Gly
Glu
Leu
Phe
Thr 570 Val
Leu
Lys
Gly Gly Glu Phe Leu Ala
Tyr
Lys 555 Thr
Ser
Met
Asn 620
Ala 540 Ala
lie
lie
Ala 605 Lys
525 Gly
Val
lie
Leu 590 Val
Phe
Lys
Arg
Ala 575 Thr
Thr
Trp
Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly 630 635
Phe
Thr 560 Gly
Gly
Gly
Gly
Lys
<210> 6 <211>1920 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1).....( 1920)
<223>編碼抗農(nóng)作物真菌多肽2核苷酸序列
<400> 6
gggUtcgtctcac咖cttcggatacttt
attac^atcccggtgc聊atxgctgggg
gUgatatttatgt犯accctccacgtgix
ggttccttcgggaacaaaaccatctggggc
cg犯gtgata
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getgc犯ggga^aagatga￡L￡LaCELC￡LCtg
gttc卿ctc
cgtactgaaatcgccggatatgacgccctc
gctgatgctgattctcttcgtatatctccc
g^3MCggC卿郷atgcgc卿acgca
■Ucgagcgcagaaaaggtattctggacacc
gcagcccttgccgttcttgatgC3C肌C3g
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gcccgt犯tgcattaaccagagctg犯c犯
ggc肌^cgatagtttcccctgaaaaattc
gttgtgagcggtg3tCCg3gatttgccggt
gataaccgtgC3犯CCtg犯ttatcttctg
attctgaatgaccggaatccggtggtg織
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atcacctctgctgaatctgcggtaaattcg
cgctcttaat
aaccagctttccggcatcaa
aaggc犯cgaaagacgc組taatttcaca
aagctgagcagttagcc卿
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aB犯tt犯tgca犯卿tcgtgC3gCg3tt
g已t"ELtCgtCteLgLtCtgeLELc卿ttcagt
agtcttgctgactggatcactgagtttggt
ctttttgttaC3tcatagcei
gtcttcagtattcttaccgg犯gcgcttta
gtcaccggtgcgctgattgatgaatcgctt
gagcccggcaaaatgtctgaccctgtacgt60
tatgattcagatggccatga犯ttatggcc120
gatgtctttcatggtaccccgcctgcatgga 180gg咖cgagtgggttg￡Ltg￡Lttccccaacc240
atcacagcgt9> C 8 S 3 3 C 3 Cgctcagcgcg300
g犯gccgg^aacgcctctctgcggcgatt360
aaaacactccgtgccggaaacgcagatgcc420
ctgcaggcagagctgag卿atacggattc480
cggctgcatacag卿gccggatgctgttt540
cggg郷ccaggtcgtt犯tcgaac鄉(xiāng)ct600
g編卿郷ccgctgatatgCttgCtg33660
cggttgtcag咖tggcggg720
gcccgtctgctcgggcagcagacacggaat780
ctcagttcagtgacggaatcgctt犯cacg840
cagctgacgccacgcctgac900
ccggggcgtttcattctatt960
tcac犯ccagcgcagtcatc1020
agccattccggtctggacta1080
g鄉(xiāng)atgtgg1140
cggcMa_g￡ittgcttgatgccaga犯ta犯薦
gcg卿aataacctcagtgc函
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ac卿gttcctgaaatcagt1440
gagatggccg1500
accgggctg31560
gccgcagcccttgagtctgtgaagctgtct1620
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aaggctgtccctggcgtcct1740
ggcaatgccgc犯cggctcttgtggcactg1800
ggcattatcgggtatggtttactgatggctl腳
gtggaaaaagcg犯恤gttctggggtatt1920
<210> 7
<211> 639
<212> PRT <213〉人工序列
<223>編碼抗農(nóng)作物真菌多肽2氨基酸序列
<400> 7
Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys Ser
1
Asp Pro
Ser Asp
Arg Val
Asn Lys 65
Arg
80
Thr
Gly
Thr
Arg
Arg 160 Arg
Ala
Asn
Lys
Ala 240 Gin
Ser
Glu
Val
Val 320 Ser
Ser
Ser
Leu
Lys
Leu
Gin 145 Thr
Met
Arg
Ala
Gly 225 Ala
Thr
Val
Gin
Ser 305 Val
Ala
Gly
Val
Gly
Asp
50
Thr
Asp
Ser
Arg
Lys 130 Glu
5
Arg lie 20
His Glu 35
Val Phe
lie Trp
lie Glu
Ala Gin 100 Leu Ser 115
Thr Leu
Thr Asn
lie Met
His Gly
Gly Gly 70
Lys Arg 85
Gin Lys Ala Ala Arg Ala
Phe Arg Leu Leu 150
Glu lie Ala Gly Tyr 165
Leu Phe Ala Asp Ala 180
Ser Leu lie Glu Gin 195
Asp Lys Lys Ala Ala 210
lie Leu Asp Thr Arg 230
Ala Val Leu Asp 245
Asn Asp Arg Ala 260
Glu Ser Leu Asn 275
Leu Thr Gin Gin
Leu
Arg
Thr
Gin 290 Pro
Ser
Val
Leu
Pro
Ala
Thr 55 Asn
Asp
Glu
lie
Gly 135 Gin
Asp
Asp
Ala
Gly
Val 40 Pro
Glu
Lys
Asn
Ala 120 Asn
Ala
Ala
Ser
Glu 200 Met
Asp 215
Leu Ser
Ala lie Thr
Lys 295
Glu Lys Phe Pro Gly 310
Gly Asp Pro Arg Phe 325
lie Asp Asn Arg Ala 340
Asp Tyr Lys Arg Asn 355
Gin
Ser
Ala 280 Asn
Arg
Ala
Asn
lie 360
10 Ala
25 Asp
Pro
Trp
Glu
Glu 105 Ala
Ala
Glu
Leu
Leu 185 Lys
Leu
Glu
Gin
Glu 265 Arg
Thr
Ser
Gly
Leu 345 Leu
Glu
lie
Ala
Val
lie
90
Asn
Arg
Asp
Leu
Arg 170 Arg
Arg
Ala
Leu
Ala 250 Ala
Asn
Pro
Ser
Thr 330 Asn
Asn
Ser
Tyr
Trp
Asp
75
Thr
Lys
Glu
Ala
15
Leu Gly Tyr Asp
Val Asn 45
Ser Ser 60
Asp Ser Ala Tyr Arg Thr
30 Pro
Phe
Pro
Lys
Glu 110
Lys Asp Glu
125 Ala Asp lie 140
Glu Tyr Gly
Arg 155
Leu His Thr Glu
lie Gin Glu
Ser Pro Arg 190
Lys Asp Ala
205 Tyr Glu Arg 220
Lys Asn Gly
Glu 235
Arg Leu Leu Gly
Arg Ala Asp
Asn Lys Leu 270
Leu Thr Arg
285 Gly Lys Thr 300
Asn His Ser
Thr 315
lie Lys lie Thr
Pro
Gly
Thr
Asn 95 Ala
Asn
Thr
Phe
Ser 175 Glu
Gin
Arg
Gly
Gin 255 Ser
Ala
lie
lie
Thr 335
Tyr Leu Leu Ser His 350
Asp Arg Asn Pro Val 365Val Thr Glu 370
Ala Glu Trp
385 lie Thr Ser 400
Ala Arg Thr
Leu Lys Glu
Lys lie Ala 450
Lys Asp Ala 465
Lys Tyr Gly
480 Ala Lys Gly 495
Glu Lys Tyr
Ala Ala lie
Ser Asn Leu 545
Thr Ser Leu
560 Glu Asn Trp 575
Asn Ala Ala
Ser Ala Leu
Ma Leu Ilu 625
Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys 375
Asp Lys Leu Arg Gin Arg Leu 390
Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser 405
Asn Glu Gin
420 Lys Glu Asn 435
Glu Glu Lys
lie Asn Phe Ala Lys Ala
Lys Lys lie 500
Arg Ala Asp
515 Ala Ala Ala
Lys His Ala Asn 425
lie Arg Asn Gin 440
Arg Lys Gin Asp 455
Thr Thr Glu Phe 470
Glu Gin Leu Ala 485
Arg Asn Val Glu
lie
Leu
Ala 410 Asp
Leu
Glu
Leu
Arg
Glu 505 lie
Tyr
Asp 395 Arg
Ala
Ser
Leu
Lys
Glu 490 Ala
Asn Lys Leu Leu Gly Tyr
Asn Ala Glu Val 380
Ala Arg Asn Lys
Asn Asn Leu Ser 415
Leu Asn Ala Leu 430
Gly lie Asn Gin 445
Lys Ala Thr 460
Ser Val Ser Glu 475
Met Ala Gly Gin
Leu Lys Thr Tyr 510
Ala Lys Asp Arg 525
Ser Asp lie Ser 540 Ala Gly
lie Asn Lys Lys 520
Leu Glu Ser Val 530 535
Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe
550 555 Ala Asp Trp lie Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr
565 570 Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr lie lie Ala Gly 580 585 590
Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser lie Leu Thr Gly
595 600 605
Gly lie lie Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly 610 615 620
Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly lie 630 63權利要求
1、編碼抗農(nóng)作物真菌多肽的基因，其特征在所述基因由編碼白色念珠菌信息素的基因與編碼大腸菌素的基因連接而成，編碼大腸菌素的基因選自能形成離子通道的大腸菌素E1或Ia或Ib或A或B或N。
2、 根據(jù)權利要求1所述的抗農(nóng)作物真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中 SEQIDN0.4所述的核苷酸序列。
3、 根據(jù)權利要求1所述的抗農(nóng)作物真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中 SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列。
4、 抗農(nóng)作物真菌多肽的重組質粒，其特征在于它含有權利要求1或2或3所述的 基因。
5、 抗農(nóng)作物真菌多肽，其特征在于它由權利要求4所述的重組質粒表達而成。
6、 根據(jù)權利要求5所述的抗農(nóng)作物真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID N0.5所述的氨基酸序列，其分子量為70,000。
7、 根據(jù)權利要求5所述的抗農(nóng)作物真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID N0.7所述的氨基酸序列，其分子量為70，000。
8、 權利要求5或6或7所述抗農(nóng)作物真菌多肽在制備治療或預防農(nóng)作物真菌感染 的農(nóng)藥中的應用。
9、 權利要求5或6或7所述抗農(nóng)作物真菌多肽的制備方法，其特征在于包括以下 步驟將白色念珠菌信息素的基因與編碼大腸菌素E1或Ia或Ib或A或B或N的基因 連接獲得編碼重組抗農(nóng)作物真菌多肽的基因，將獲得的基因導入到表達系統(tǒng)中進行表 達，分離表達的多肽而獲得抗農(nóng)作物真菌多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型抗農(nóng)作物真菌多肽及其制備方法，該重組抗農(nóng)作物真菌多肽由編碼白色念珠菌信息素的基因與編碼大腸菌素的基因連接而成。本發(fā)明所述新型抗農(nóng)作物真菌多肽相較于現(xiàn)用抗農(nóng)作物真菌藥物的優(yōu)點在于，其直接在真菌細胞膜上形成離子通道來殺傷真菌，因此殺傷效率強于現(xiàn)用抗農(nóng)作物真菌藥物數(shù)千倍；由于真菌難以通過突變-表達方式來修補該多肽在其胞膜上造成的幾何損傷，因此該多肽不會誘導真菌產(chǎn)生傳統(tǒng)的耐藥性；由于該多肽是一種生物制劑，對真菌是靶向性殺傷，因此它無現(xiàn)用抗農(nóng)作物真菌化學藥物的毒副作用。
文檔編號C12N15/31GK101200727SQ20071005092
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權日2007年12月21日
發(fā)明者丘小慶 申請人:丘小慶