專利名稱：一種測定丙酮酸脫氫酶系活性的分光光度法的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及丙酮酸脫氫酶系活性測定的方法。具體是基于用吩嗪二甲酯硫酸鹽作電子傳遞體，噻唑藍作為電子受體，噻唑藍被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物所還原，測定噻唑藍的還原量，確定丙酮酸脫氫酶系活性的分光光度法。
背景技術(shù)：
丙酮酸脫氫酶活性的測定在丙酮酸脫氫酶系的性質(zhì)、基因克隆、分離、純化、鑒定及相關研究中都是必不可少的。對于研究與丙酮酸的代謝異常有關的疾病，以酮酸脫氫酶系為靶標的除草劑和殺菌劑也具有重要的意義。本發(fā)明對丙酮酸脫氫酶系的測活方法進行研究，并建立了一項經(jīng)濟有效的測活方法。
丙酮酸脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)在催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA的能量代謝過程中起著關鍵的作用。丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)是多酶體系，其中包括丙酮酸脫氫酶(E1；EC 1.2.4.1)，二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶(E2；EC 2.3.1.12)和二氫硫辛酸脫氫酶(E3；EC 1.8.1.4)]三種主酶。丙酮酸脫氫酶是一種限速酶，催化丙酮酸脫羧生成羥乙基-TPP(羥乙基-焦磷酸硫胺素)，接下來將在E2的作用下，羥乙基氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；瑫r轉(zhuǎn)移到E2的輔基硫辛酰胺上。
目前已有報道的丙酮酸脫氫酶活性測定方法幾乎都是二十世紀六十年代就發(fā)展起來的。根據(jù)采用的手段主要可分為兩大類分光光度法和放射性同位素法。測定還原型輔酶I(NADH)形成速率的標準分光光度法常被用純化的丙酮酸脫氫酶復合體，這種方法由于易受到丙酮酸脫氫酶復合體反應產(chǎn)物的副反饋抑制而受到限制，且試劑價格昂貴；常用測定丙酮酸脫氫酶活性的分光光度法有鐵氰化鉀法；2，6-二氯吲哚酚(2，6-DCPIP)法。同位素標記法主要用于粗酶液，是基于14C丙酮酸經(jīng)過E1的催化作用轉(zhuǎn)化為的CO2，可以通過測定14C標記的CO2生成量來決定E1酶的活性。因為同位素標記法是采用動態(tài)的測量，所以沒有分光光度的方法便利，同時它還用到一種相對不穩(wěn)定的放射性物質(zhì)，易造成環(huán)境污染。1981年(Hinman L M.& J P.Blass，J.Biol.Chem.，Vol.256，No.13)等人報道了一種在粗的均質(zhì)液中測定丙酮酸脫氫酶復合體活性的分光光度計法方法，此方法一直被用于測定粗的勻質(zhì)液和線粒體的制備后酶活的測定。
通過本發(fā)明人的系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)鐵氰化鉀法的靈敏度極低，在反應起始后30分鐘內(nèi)基本沒有觀察到吸光度的變化；2，6-二氯吲哚酚法又易受到疏基保護劑(β-疏基乙醇和二硫蘇糖醇等，為了使提取的酶保持原有的活性，一般在提取酶的過程中都要加入疏基保護劑)的影響，當巰基保護劑β-疏基乙醇濃度很低(50微摩爾/升)時，丙酮酸脫氫酶復合體就能與β-疏基乙醇發(fā)生激烈的反應；而在同樣的條件下用噻唑藍與β-疏基乙醇不發(fā)生反應。1981年Hinman.等人所報到測定丙酮酸脫氫酶復合體活性的方法，原理是測定碘硝基四唑紫與丙酮酸脫氫酶復合體共同作用后的產(chǎn)物還原型輔酶I發(fā)生反應引起的光吸收的變化。經(jīng)過人們的研究發(fā)現(xiàn)碘硝基四唑紫不僅能與NADH反應，它同時也能與丙酮酸脫氫酶復合體中第一個酶丙酮酸脫氫酶的產(chǎn)物直接發(fā)生作用，所以這種方法測定丙酮酸脫氫酶復合體的可靠性值得進一步考慮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的丙酮酸脫氫酶活性測定方法，這種方法具有經(jīng)濟、靈敏度高、穩(wěn)定性好、受到的干擾小的特點。
本發(fā)明提供的丙酮酸脫氫酶活性的測定方法具體描述如下利用分光光度計，存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，用吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)作電子傳遞體，噻唑藍(MTT)作為電子受體，噻唑藍被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物羥乙基-焦磷酸硫胺素所還原，測定丙酮酸脫氫酶E1的催化產(chǎn)物對噻唑藍的還原量，確定酶的活性。噻唑藍被丙酮酸脫氫酶(E1)的催化產(chǎn)物還原后，噻唑藍最大吸收峰從波長400-430納米變?yōu)?40-640納米，通過測定波長540-640納米光吸收的增加量，用噻唑藍濃度與吸光度之間的關系曲線--標準曲線，確定噻唑藍的還原量，定義酶的活性。當石英比色池為1厘米時，還原的噻唑藍的濃度與吸光度之間的關系見標準曲線(圖1)。
反應混合物中包含磷酸鉀鹽緩沖液，氯化鎂(MgCl2)，焦磷酸硫胺素(TPP)，噻唑藍，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)和作為反應底物的丙酮酸鈉。酶活性單位用實驗決定的還原的噻唑藍的量來計算。酶的活性單位定義為每毫克蛋白每分鐘還原1納摩爾噻唑藍為1單位。
上述測定噻唑藍在波長540-640納米吸光度的增加量的溫度為室溫10～30℃。
本發(fā)明首次利用噻唑藍作為丙酮酸脫氫酶系中丙酮酸脫氫酶(E1)電子受體。與文獻報導方法相比存在以下優(yōu)點經(jīng)濟、穩(wěn)定性高、靈敏度高，受到的干擾少。與傳統(tǒng)的標準測定NADH(還原型輔酶I)方法相比，所用試劑價格便宜。其它試劑價格相當，但標準測定NADH方法中，100毫克CoA要1950元，而100毫克MTT只需要27元。如前背景技術(shù)所述2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法盡管試劑價格也不高，但是鐵氰化鉀法靈敏度極差，2，6-二氯吲哚酚法又易受到巰基保護劑的影響。而本發(fā)明的方法實驗的重復性好，經(jīng)過多次獨立重復實驗，數(shù)據(jù)之間的標準誤差很小。靈敏度比2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法高。


圖1標準曲線還原噻唑藍的濃度與吸光度之間的關系曲線圖2為MTT法(噻唑藍法)和DCPIP法(2，6-二氯吲哚酚法)測定豬心丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶的活性的比較曲線圖3為MTT法和DCPIP法測定乳酸菌丙酮酸脫氫酶的活性的比較曲線圖4MTT法測定農(nóng)藥對乳酸菌丙酮酸脫氫酶是否抑制的反應時間與吸光度的關系曲線具體實施方式
實驗原理見下式
實施例1MTT法和DCPIP法測定乳酸菌丙酮酸脫氫的酶和豬心丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶的活性的比較第一步酶的預處理----乳酸菌丙酮酸脫氫酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液溶解并稀釋到1毫克蛋白/毫升。豬心丙酮酸脫氫酶復合體用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液稀釋到1毫克蛋白/毫升。分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 第二步MTT法反應混合物的配制反應混合物中包含50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液，1毫摩爾/升MgCl2，0.2毫摩爾/升焦磷酸硫胺素，0.5毫摩爾/升MTT，6.5毫摩爾/升吩嗪二甲酯硫酸鹽和2.0毫摩爾/升丙酮酸鈉作反應的底物。DCPIP法參照Nemeria等(2001，J.Biol.Chem.，Vol.276，No.49)所用反應體系有所修改(為了使兩種方法具有可比性，輔助因子和底物濃度均相同)。
第三步室溫條件下，加入酶液反應起始，進行時間掃描10分鐘。DCPIP法測定波長600納米，MTT法測定波長540-640納米的吸光度。樣品為完全的反應體系，對照為完全的反應體系不加焦磷酸硫胺素。吸光度用HITACHI U-1800紫外可見分光光度計進行。
實驗結(jié)果見圖2、3。從兩種方法測定豬心丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)中丙酮酸脫氫的酶(圖2)可以看出，DCPIP法測定時間依賴性光吸收變化線性較差，MTT法線性較好，可以看到在反應的起始后2-3分鐘DCPIP法光吸收變化較大，考慮到豬心酶液中的巰基保護劑β-疏基乙醇(終濃度是20微摩爾/升)可能對兩種方法造成影響，通過用20微摩爾/升的β-疏基乙醇與MTT和DCPIP分別作用，發(fā)現(xiàn)DCPIP能與β-疏基乙醇發(fā)生激烈的反應，而同樣的條件下，即使存在吩嗪二甲酯硫酸鹽，MTT也不與β-疏基乙醇發(fā)生反應，只有當β-疏基乙醇足夠高，遠遠超出提酶過程中所使用的濃度時，MTT才與β-疏基乙醇有比較明顯的反應。同時從吸光度的變化看，MTT法在測定該酶時比DCPIP法靈敏度高66.28％。
從兩種方法測定乳酸菌丙酮酸脫氫酶的結(jié)果(圖3)看，兩種方法測定乳酸菌丙酮酸脫氫酶時間依賴性光吸收變化線性都比較好，但是在同樣的條件下，從吸光度的變化看，MTT法在測定該酶時比DCPIP法靈敏度高29.71％。從曲線上顯示的標準誤差看兩種方法在測定不含巰基保護劑的酶時重復性都比較好，即穩(wěn)定性高。
結(jié)論MTT法與DCPIP法相比受到巰基保護劑的干擾少，且靈敏度比DCPIP法高。重復性好實施例2抑制劑對丙酮酸脫氫酶活性抑制率的測定第一步酶的預處理----乳酸菌丙酮酸脫氫酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩爾pH7.1磷酸鉀鹽緩沖液溶解并稀釋到濃度1毫克蛋白/毫升。
第二步同實施例1第二步第三步將酶與濃度是100ppm的抑制劑IIM-1(IIM-1是1-(2，4-二取代苯氧乙酰氧基烴基膦酸單鈉鹽類化合物)一起30℃溫浴30-60分鐘第四步室溫條件下，向反應混合物中加入酶或者酶和抑制劑起始反應，測定反應混合液吸光度與時間的關系，結(jié)果見圖4。
圖4中純酶為完全的反應體系加入酶液反應起始；對照為完全的反應體系中不加酶液；酶加抑制劑為完全的反應體系加入酶和抑制劑。
計算結(jié)果5分鐘內(nèi)沒有加抑制劑只加酶的樣品管吸光度變化為0.113；加入酶的同時又加入抑制劑的樣品管吸光度變化為0.84，所以抑制劑對酶活性的抑制率是(0.113-0.84)/0.113＝25.6637％。
本發(fā)明實施可隨著具體測活性質(zhì)不同，進行具體反應體系調(diào)整，如測定動物源的丙酮酸脫氫酶活性，可以選擇pH值在7附近；但如果測定植物源的丙酮酸脫氫酶活性，最好選擇pH值在8附近。假如是篩選以丙酮酸脫氫酶為靶標的抑制劑，測定抑制劑對丙酮酸脫氫酶的抑制性和抑制率，就需要調(diào)整反應體系中的底物濃度。
權(quán)利要求
1.一種丙酮酸脫氫酶活性測定方法，其特征是用吩嗪二甲酯硫酸鹽作中間電子傳遞體，噻唑藍作為電子受體，測定丙酮酸脫氫酶E1的催化產(chǎn)物羥乙基-焦磷酸硫胺素對噻唑藍的還原量，根據(jù)噻唑藍的還原量確定酶的活性，酶的活性單位定義為每毫克蛋白每分鐘還原1納摩爾噻唑藍為1單位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙酮酸脫氫酶活性測定方法，其特征是利用分光光度計，在存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，通過測定噻唑藍在波長540-640納米吸光度的增加量，用噻唑藍濃度與吸光度之間的關系曲線--標準曲線，確定噻唑藍的還原量，定義酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙酮酸脫氫酶活性測定方法，其特征是測定噻唑藍在波長540-640納米吸光度的增加量的溫度為室溫。
全文摘要
一種測定丙酮酸脫氫酶活性的分光光度法。該法利用分光光度計，在存在底物丙酮酸鈉和輔助因子氯化鎂、焦磷酸硫胺素的情況下，用吩嗪二甲酯硫酸鹽作電子傳遞體，噻唑藍作電子受體，噻唑藍被丙酮酸脫氫酶(E1)的產(chǎn)物羥乙基－焦磷酸硫胺素所還原，噻唑藍最大吸收峰從波長400－430納米變?yōu)?40－640納米，通過測定波長540－640納米光吸收的增加量，確定噻唑藍的還原量，定義酶的活性。本法用的試劑比較經(jīng)濟，穩(wěn)定性，靈敏度比2，6－二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法高，同時也克服了2，6－二氯吲哚酚法易受疏基保護劑影響不利于測定丙酮酸脫氫酶復合體中E1活性的缺點，本法既適用于純化丙酮酸脫氫活性測定，也適用于來自線粒體提取后的丙酮酸脫氫酶復合體中丙酮酸脫氫酶活性測定。
文檔編號C12Q1/32GK101017134SQ20071005127
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者袁均林, 何亞輝, 賀紅武, 彭浩, 楊旭, 丁書茂 申請人:華中師范大學