專利名稱：丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片、制備及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片、制備及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
中藥丹參為唇形科鼠尾草屬植物的干燥根部及根莖，作為傳統(tǒng)的中藥，其應(yīng)用至少有1500年的歷史，全國(guó)大部分地區(qū)均產(chǎn)，其性味苦、微溫、具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰、清心除煩的功效，為臨床常用藥，以治療冠心病及缺血性疾病效果更為突出；其化學(xué)成分主要包括脂溶性和水溶性兩部分，丹參酮是其主要脂溶性成分，臨床上廣泛應(yīng)用的丹參各種制劑均以丹參酮或丹參素為其主要成分。
丹參酮是一類化合物，國(guó)內(nèi)外對(duì)此進(jìn)行了大量研究工作，分離得到其活性單體，測(cè)定其結(jié)構(gòu)式，分別命名為丹參酮(tanshinone，Tan)I、1IA，IIB，隱丹參酮，異丹參酮I、IIA，異隱丹參酮，羥基丹參酮A，丹參酸甲酯，二氫丹參酮，丹參新醌甲、乙和丙等。丹參酮的藥理作用主要有1.抗菌作用對(duì)于葡萄球菌、痤瘡丙酸棒狀桿菌、分枝桿菌以及某些真菌有強(qiáng)大的抑制作用，尤其對(duì)革蘭氏陽性球菌有明顯的抑制作用，對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌仍有很好的抑制作用，而且長(zhǎng)期使用不產(chǎn)生耐藥性；2.擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠狀動(dòng)脈血流量；3.減慢心率，增加心肌收縮力，改善缺氧后引起的心肌代謝紊亂及心功能；4.抑制凝血；5.促進(jìn)組織修復(fù)；6.降低血脂；7.保護(hù)紅細(xì)胞和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；8.抗炎作用對(duì)組胺引起的血管通透性增加有明顯抑制作用，抑制中性粒細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)，并能降低血漿PGE2的含量，減輕炎癥的反應(yīng)；9.內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用可作用于體內(nèi)的性腺靶器官，調(diào)節(jié)其激素分泌，維持體內(nèi)激素平衡。
基因芯片技術(shù)是一種高通量、快速、平行核酸序列測(cè)定及定量分析技術(shù)，它將大量特定序列的核酸片段有序地固定在載體上作為探針與標(biāo)記的待測(cè)核酸分子進(jìn)行雜交，然后通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，進(jìn)而判斷樣品中靶分子的組成及含量。該技術(shù)與傳統(tǒng)生物技術(shù)相比是一次重大創(chuàng)新和飛躍，具有十分誘人的前景?；蛐酒呀?jīng)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜研究，通過快速高效地獲取大量基因在mRNA水平的表達(dá)信息，并對(duì)在不同條件下的大量基因表達(dá)情況的平行分析，從而獲得基因的初步功能信息。在基礎(chǔ)研究中還可用于基因鑒別篩選及功能研究、快速DNA序列再測(cè)定、基因突變多態(tài)性的研究和基因表達(dá)測(cè)定等多個(gè)領(lǐng)域。
我國(guó)丹參資源豐富，分布廣泛，品種繁多，根據(jù)丹參的形態(tài)可分為無花丹參、白花丹參、紫花丹參等；主要產(chǎn)地有山西、陜西、山東、甘肅、四川、河南、江蘇等，各個(gè)產(chǎn)地各種品種的丹參均作藥用，而丹參酮的含量各地各品種差別巨大，藥效作用很不一致。丹參藥材的質(zhì)量在中國(guó)藥典2000年版中以丹參酮的含量來控制，因此如何提高作為主要藥理作用的丹參酮的含量是亟待解決的課題。利用基因芯片技術(shù)對(duì)丹參酮相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行研究，進(jìn)而進(jìn)行基因工程改造是最佳方法之一。
但目前市場(chǎng)上尚無丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的檢測(cè)方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片，其特征在于該基因芯片是在玻璃片基質(zhì)上設(shè)置丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)探針。
該檢測(cè)探針的序列為丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)探針編號(hào)序列1號(hào)5′GGACATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTAGAGCGCCGCCA3′2號(hào)5′TACGCCCCAAAGGAACAAACTGATCGACTGGGACATCTTCAGCAGGGATGCCGAGCTCAT3′3號(hào)5′ACCAAGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCT3′4號(hào)5′GCTGCGAGAAGCATATCGTCATGAACACGGATGGCACCAGAGATTATCAAACCGAGACCG3′5號(hào)5′TGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGG3′6號(hào)5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′7號(hào)5′TGTGAATCTTCGCCAGACCGTTCCGCCCCGTCCCGCCGTTAGCCATGCTCACGCGTCCGT3′8號(hào)5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′9號(hào)5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′10號(hào)5′AGATGATGCAATCGGGCGAGTATTTAGCGAGCGGCGGCACGATATGCTTGAACAGCGCGA3′11號(hào)5′TGCTTCCCACATAGCTCACCTCCGCAATAAAGGCCTCCCAACGATCCCAACCTCATTAGG3′12號(hào)5′CGATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCC3′13號(hào)5′AGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGC3′
14號(hào)5′CGAAAATGGCTCGACCCTCGCTCCATGTATAAGCTTCCTCAGCCGTACACTCAGACTGTG3′15號(hào)5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′16號(hào)5′CTGGATGCCGAGGATCAGCGAGCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTG3′17號(hào)5′CAAGCGCTATGAGCTCTGCAATACCAGTGCCAGCCTCTCCAGCTCCAAGGAATAAGAATC3′18號(hào)5′AGGACCAGCAGCAAGAATTTCATCAGTCAGCTTGTCGTCCTTGCCAATCTTGTGAGCCAC3′19號(hào)5′AGTAAACAGCTCGGAGGGGTCGGGTGCGGGGATCTCCTTAGCTTTAGCAATGGCTTCATC3′20號(hào)5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′21號(hào)5′TGCTCTCATCAAGGTATTCGCGGTATCAAGGTTCTGAGTGAACACTCCTGCAGCAAGACC3′22號(hào)5′TCTCTGAAATCTGCCCAAGAGCCCTGTTATGGTCCAATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAG3′23號(hào)5′CCGAATACCTCCGTCTTCACGTAGCTCGCCTTCAGCAGTTCCCCGGAATGTATGGCATCG3′24號(hào)5′AGGACCTTGCTCTATGCCTGCCTTGAACGGATCCCCAACAGTACGCTTCAGGGCCCGTGC3′25號(hào)5′TTCTCATCCTTGCTATACTTCTGCGCGAAGGCCAATCCACACCCCAACGGGATCTGAGCG3′26號(hào)5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′27號(hào)5′GCCGTACCGCGTCGCGTTTGCTCGTCTGATCACCTCGTCGATGTCCTTGAACTTCAAGAT3′28號(hào)5′TGCCGAGGATCAGCGAGCCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTGCCTC3′29號(hào)5′GATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCT3′30號(hào)5′GGGAAGCATGGTGTCTCCGGGAAGATCACAGACAGCAATACCCTCTCCTGTAAGATGAGC3′31號(hào)5′CCTTTGCCCCACCCCTCGAGTACGGAGTTATCTTCAAGGAGATCATCAGCAACAGCAAGG3′32號(hào)5′ACTTGCCTTCTCTCTACCGGAGTAGCTAGGAGCCTAGTCTCGTGATGTCCCTGCTCGACC3′33號(hào)5′TCCGGTGGTGAGGGTGCAGCTTCTTGAACAAGGCGAGCGCTTGGATAGCCGATGAAGTGC3′34號(hào)5′CCGACTGCGACGCCAGCTGAGTCCCGCCTCCCACTGTCCCTACCTCAATGCAAGGCATCG3′陰性對(duì)照探針編號(hào)序列35號(hào) 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’36號(hào) 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’37號(hào) 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’空白對(duì)照點(diǎn)編號(hào)序列38號(hào)39號(hào)40號(hào)而且，所述的陰性對(duì)照探針中，35號(hào)為大鼠糖皮質(zhì)激素受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為M14053；36號(hào)為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號(hào)為X04273；37號(hào)為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為X55019；所述的空白對(duì)照點(diǎn)僅含2×SSC溶液。
一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的制備方法的步驟如下(1)設(shè)計(jì)丹參酮特異性探針在基因數(shù)據(jù)庫(kù)查找與丹參相關(guān)基因和表達(dá)序列標(biāo)簽，應(yīng)用京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的比對(duì)功能一一確認(rèn)與丹參酮代謝相關(guān)基因作為制備芯片所用基因，然后應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)丹參酮特異性探針；(2).合成探針應(yīng)用DNA合成儀合成丹參酮特異性探針；(3).片基的處理采用載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡20～30小時(shí)，然后蒸餾水沖洗、飽和NaOH/乙醇浸泡、蒸餾水沖洗后甩干、多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用；(4).點(diǎn)樣用2×SSC溶液溶解丹參酮特異性及陰性對(duì)照探針，使用點(diǎn)樣儀在玻片上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣，在三個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)只點(diǎn)2×SSC溶液；(5).將點(diǎn)好的玻片在長(zhǎng)波紫外燈下交聯(lián)3～5分鐘，使制備成的探針固定在玻片上。
而且，所述的丹參酮特異性探針設(shè)計(jì)的技術(shù)要求為①.G+C含量為50％～65％；②.探針的Tm值上下波動(dòng)＜5℃；③.單一堿基要保證連續(xù)重復(fù)5次以下；④.探針分子內(nèi)部互補(bǔ)堿基少于5bp；⑤.探針之間的二聚體＜6bp；⑥.每個(gè)探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續(xù)同源的堿基數(shù)≤20個(gè)。
一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的檢測(cè)方法步驟如下(1).總RNA提取采用異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆轉(zhuǎn)錄制備cDNACy3-dUTP標(biāo)記一組cDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記另一組cDNA；(3).在雜交箱中與芯片進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，預(yù)雜交為20～30分鐘，雜交為10～16小時(shí)；(4).共聚焦熒光掃描儀上掃描雜交結(jié)果；(5).應(yīng)用微陣列分析軟件進(jìn)行定量分析；(6).根據(jù)分析結(jié)果確定丹參酮的相關(guān)基因表達(dá)量。
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明適用于對(duì)丹參酮相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得其功能信息。具有如下功用①檢測(cè)丹參酮相關(guān)基因在不同產(chǎn)地和同一產(chǎn)地同一植株不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官的表達(dá)；②研究丹參酮相關(guān)基因在特定條件下如陽光、溫度、各種生理脅迫、病蟲害侵害、激素誘導(dǎo)等作用時(shí)的表達(dá)；③研究丹參酮形成的遺傳機(jī)制；④預(yù)測(cè)丹參酮的生成量。此外，本發(fā)明還可以應(yīng)用于作丹參種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、丹參優(yōu)勢(shì)品種的早期預(yù)測(cè)、丹參育種和其新品種的產(chǎn)生與鑒定、丹參單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢定、新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選等。這些功能為丹參酮的研究和丹參的基因工程改造奠定基礎(chǔ)，對(duì)闡述丹參酮生物合成的基本規(guī)律進(jìn)而通過基因工程手段提高丹參酮的產(chǎn)量具有重要意義。
2.本基因芯片所需基因及EST來自Genbank，使用的是KEGG比對(duì)軟件，Genbank和KEGG是目前世界上最權(quán)威的基因數(shù)據(jù)庫(kù)；應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)探針，又有嚴(yán)格的限制條件，因而科學(xué)性較強(qiáng)；該芯片上的基因是針對(duì)丹參酮選擇的，特異性強(qiáng)，能較好地說明丹參酮相關(guān)基因表達(dá)的情況；所選擇的探針數(shù)量?jī)H有幾十個(gè)，Tm值一致性強(qiáng)；采用不同的熒光標(biāo)記，可直接比較不同情況下的mRNA豐度差異。樣品可采用兩種熒光標(biāo)記，一次實(shí)驗(yàn)可比較兩種以上的樣品。在同一張芯片雜交，克服了分開雜交的缺陷，是完全平行的檢測(cè)，其敏感性較高；利用計(jì)算機(jī)掃描微陣列能提供兩種不同組織mRNA豐度的量化值。本芯片同時(shí)包括了用于質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)校正的陰性對(duì)照和空白對(duì)照，準(zhǔn)確性更強(qiáng)。
3.本發(fā)明所制備的基因芯片具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，主要適用各種丹參丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)。
4.本發(fā)明適用于對(duì)丹參酮相關(guān)基因采用PCR擴(kuò)增方法用于雜交檢測(cè)，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速、科學(xué)，完成全部檢測(cè)操作過程只需幾小時(shí)，而且檢測(cè)的精確度較高；且本基因芯片在常溫下易保存，從而為進(jìn)行大規(guī)模樣品的集中檢測(cè)提供了極大的方便。
5.本發(fā)明所涉及的基因芯片操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好；該基因芯片制備簡(jiǎn)單，成本低廉；使用該基因芯片檢測(cè)丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、科學(xué)，檢測(cè)精確度較高，為醫(yī)藥制造廠家科學(xué)準(zhǔn)確地控制丹參質(zhì)量提供了支持，為患者的治療提供了保障。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
該丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片是在基質(zhì)上設(shè)置檢測(cè)丹參酮的探針，該基因芯片所使用的基質(zhì)是玻片。
該探針的序列為丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)探針編號(hào)序列1號(hào)5′GGACATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTAGAGCGCCGCCA3′2號(hào)5′TACGCCCCAAAGGAACAAACTGATCGACTGGGACATCTTCAGCAGGGATGCCGAGCTCAT3′
3號(hào)5′ACCAAGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCT3′4號(hào)5′GCTGCGAGAAGCATATCGTCATGAACACGGATGGCACCAGAGATTATCAAACCGAGACCG3′5號(hào)5′TGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGG3′6號(hào)5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′7號(hào)5′TGTGAATCTTCGCCAGACCGTTCCGCCCCGTCCCGCCGTTAGCCATGCTCACGCGTCCGT3′8號(hào)5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′9號(hào)5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′10號(hào)5′AGATGATGCAATCGGGCGAGTATTTAGCGAGCGGCGGCACGATATGCTTGAACAGCGCGA3′11號(hào)5′TGCTTCCCACATAGCTCACCTCCGCAATAAAGGCCTCCCAACGATCCCAACCTCATTAGG3′12號(hào)5′CGATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCC3′13號(hào)5′AGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGC3′14號(hào)5′CGAAAATGGCTCGACCCTCGCTCCATGTATAAGCTTCCTCAGCCGTACACTCAGACTGTG3′15號(hào)5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′16號(hào)5′CTGGATGCCGAGGATCAGCGAGCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTG3′17號(hào)5′CAAGCGCTATGAGCTCTGCAATACCAGTGCCAGCCTCTCCAGCTCCAAGGAATAAGAATC3′18號(hào)5′AGGACCAGCAGCAAGAATTTCATCAGTCAGCTTGTCGTCCTTGCCAATCTTGTGAGCCAC3′19號(hào)5′AGTAAACAGCTCGGAGGGGTCGGGTGCGGGGATCTCCTTAGCTTTAGCAATGGCTTCATC3′20號(hào)5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′21號(hào)5′TGCTCTCATCAAGGTATTCGCGGTATCAAGGTTCTGAGTGAACACTCCTGCAGCAAGACC3′22號(hào)5′TCTCTGAAATCTGCCCAAGAGCCCTGTTATGGTCCAATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAG3′23號(hào)5′CCGAATACCTCCGTCTTCACGTAGCTCGCCTTCAGCAGTTCCCCGGAATGTATGGCATCG3′24號(hào)5′AGGACCTTGCTCTATGCCTGCCTTGAACGGATCCCCAACAGTACGCTTCAGGGCCCGTGC3′25號(hào)5′TTCTCATCCTTGCTATACTTCTGCGCGAAGGCCAATCCACACCCCAACGGGATCTGAGCG3′26號(hào)5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′27號(hào)5′GCCGTACCGCGTCGCGTTTGCTCGTCTGATCACCTCGTCGATGTCCTTGAACTTCAAGAT3′28號(hào)5′TGCCGAGGATCAGCGAGCCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTGCCTC3′29號(hào)5′GATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCT3′30號(hào)5′GGGAAGCATGGTGTCTCCGGGAAGATCACAGACAGCAATACCCTCTCCTGTAAGATGAGC3′31號(hào)5′CCTTTGCCCCACCCCTCGAGTACGGAGTTATCTTCAAGGAGATCATCAGCAACAGCAAGG3′32號(hào)5′ACTTGCCTTCTCTCTACCGGAGTAGCTAGGAGCCTAGTCTCGTGATGTCCCTGCTCGACC3′33號(hào)5′TCCGGTGGTGAGGGTGCAGCTTCTTGAACAAGGCGAGCGCTTGGATAGCCGATGAAGTGC3′34號(hào)5′CCGACTGCGACGCCAGCTGAGTCCCGCCTCCCACTGTCCCTACCTCAATGCAAGGCATCG3′陰性對(duì)照探針編號(hào)序列35號(hào) 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’36號(hào) 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’37號(hào) 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’空白對(duì)照點(diǎn)編號(hào)序列38號(hào)39號(hào)40號(hào)本芯片共有34個(gè)丹參酮相關(guān)基因的探針，3個(gè)陰性對(duì)照探針(35號(hào)為大鼠糖皮質(zhì)激素受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為M14053；36號(hào)為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號(hào)為X04273；37號(hào)為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為X55019)。三個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)僅含2×SSC溶液，不含任何基因探針。
丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的制備方法包括如下步驟1.設(shè)計(jì)丹參酮特異性探針在NCBI(The National Center for BiotechnologyInformation，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)的Genbank(基因數(shù)據(jù)庫(kù))查找與丹參相關(guān)基因和EST(Expressed Sequence Tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)，然后應(yīng)用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，京都基因與基因組)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的比對(duì)功能一一確認(rèn)與丹參酮代謝相關(guān)基因并加以確定，作為制備芯片所用基因。在確定了所用基因之后，應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)探針。為減少非特異性雜交，保證芯片雜交的敏感度和精確度，探針設(shè)計(jì)遵循以下6條基本原則①G+C含量為50％～65％②探針的Tm值上下波動(dòng)小于5℃③避免單一堿基連續(xù)重復(fù)5次以上；④探針分子內(nèi)部互補(bǔ)堿基少于5bp⑤探針之間的二聚體小于6bp⑥每個(gè)探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續(xù)同源的堿基數(shù)≤20個(gè)。對(duì)備選探針進(jìn)行篩選時(shí)，各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍，以保證同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。
2.合成探針應(yīng)用DNA合成儀合成上述丹參酮特異性探針。
3.片基的處理市售載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡24小時(shí)，蒸餾水沖洗，飽和NaOH/乙醇浸泡，蒸餾水沖洗后甩干，多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用。
4.點(diǎn)樣用2×SSC溶液溶解丹參酮特異性及陰性對(duì)照探針，使用點(diǎn)樣儀在玻片上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣，三個(gè)空白對(duì)照只點(diǎn)2×SSC溶液。
5.將點(diǎn)好的玻片在長(zhǎng)波紫外燈下交聯(lián)3-5分鐘，使制備成的探針固定在玻片上。
丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片檢測(cè)方法的步驟如下1.總RNA提取采用異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法。
2.逆轉(zhuǎn)錄制備cDNACy3-dUTP標(biāo)記一組cDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記另一組cDNA。
3.在雜交箱中與芯片進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，預(yù)雜交為20～30分鐘，雜交時(shí)間為12小時(shí)或過夜。
4.共聚焦熒光掃描儀(Scan Array Express)上掃描雜交結(jié)果。
5.應(yīng)用微陣列分析軟件進(jìn)行定量分析。
6.根據(jù)分析結(jié)果確定丹參酮的相關(guān)基因表達(dá)量。
采用該基因芯片檢測(cè)丹參酮含量的檢測(cè)方法包括如下步驟(1).準(zhǔn)備工作預(yù)熱恒溫水浴箱、預(yù)冷低溫高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)紫外線消毒滅菌、預(yù)冷。
(2).取丹參樣品約50mg，液氮下研磨。
(3).將上面已經(jīng)研磨成面的樣本倒入eppendorf管中。
(4).加入異硫氰酸胍提取液或Trizol1ml，放置10分鐘；用吸頭反復(fù)吹打數(shù)次，使混合均勻。
(5).加入氯仿200ul，混勻，室溫放置15分鐘；然后，4℃，12000g，離心15分鐘；吸取上層水相至另一eppendorf管中。
(6).加入異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置10分鐘；4℃，12000g，離心10分鐘；棄上清，RNA沉淀于管底。
(7).加入75％乙醇1ml，溫和震蕩懸浮沉淀；4℃，8000g，離心5分鐘，棄上清，用吸水紙吸干多余乙醇，涼干15-20分鐘。
(8).加入經(jīng)過DEPC處理的去離子水50ul，60℃，10分鐘，取出檢測(cè)其完整性及純度。
DnaseI消化總RNA中殘留的DNA(1).取20μg總RNA，加入5×Dnase緩沖液4μl，Dnase I(1U/μl)5μl，加DEPC水至總體積為20μl，37℃溫浴10min。
(2).反應(yīng)結(jié)束，加入180μlDEPC水，200μl水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(50∶49∶1)抽提一次。
(3).取上清液加入3M的醋酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3M，并加2.5倍的無水乙醇，-80℃1h。
(4).12000rpm，4℃離心15min，棄上清。
(5).沉淀物用75％的乙醇洗兩次，空氣干燥后加入20μl DEPC處理水，調(diào)RNA濃度為1μg/μl，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (6).探針標(biāo)記使用Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn)的Cy3dUTP/Cy5dUTP標(biāo)記試劑；(7).在雜交箱中與芯片進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，預(yù)雜交為20～30分鐘，雜交為10小時(shí)或過夜。
(8).共聚焦熒光掃描儀(Scan Array Express)上掃描雜交結(jié)果(9).應(yīng)用微陣列分析軟件進(jìn)行定量分析。
(10).根據(jù)分析結(jié)果即可確定丹參酮的含量。
權(quán)利要求
1.一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片，其特征在于該基因芯片是在玻璃片基質(zhì)上設(shè)置丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片，其特征在于該探針的序列為丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)探針
陰性對(duì)照探針
空白對(duì)照點(diǎn)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片，其特征在于所述的陰性對(duì)照探針中，35號(hào)為大鼠糖皮質(zhì)激素受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為M14053；36號(hào)為酵母TRP4基因探針，NCBI的序列號(hào)為X04273；37號(hào)為人乙酰膽堿δ受體基因探針，NCBI的序列號(hào)為X55019；所述的空白對(duì)照點(diǎn)僅含2×SSC溶液。
4.一種如權(quán)利要求1所述丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于該制備方法步驟如下(1)設(shè)計(jì)丹參酮特異性探針在基因數(shù)據(jù)庫(kù)查找與丹參相關(guān)基因和表達(dá)序列標(biāo)簽，應(yīng)用京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的比對(duì)功能一一確認(rèn)與丹參酮代謝相關(guān)基因作為制備芯片所用基因，然后應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)丹參酮特異性探針；(2).合成探針應(yīng)用DNA合成儀合成丹參酮特異性探針；(3).片基的處理采用載玻片蒸餾水沖洗，重鉻酸鉀濃硫酸洗液浸泡20～30小時(shí)，然后蒸餾水沖洗、飽和NaOH/乙醇浸泡、蒸餾水沖洗后甩干、多聚賴氨酸溶液涂片后涼干備用；(4).點(diǎn)樣用2×SSC溶液溶解丹參酮特異性及陰性對(duì)照探針，使用點(diǎn)樣儀在玻片上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣，在三個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)只點(diǎn)2×SSC溶液；(5).將點(diǎn)好的玻片在長(zhǎng)波紫外燈下交聯(lián)3～5分鐘，使制備成的探針固定在玻片上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于所述的丹參酮特異性探針設(shè)計(jì)的技術(shù)要求為①.G+C含量為50％～65％；②.探針的Tm值上下波動(dòng)＜5℃；③.單一堿基要保證連續(xù)重復(fù)5次以下；④.探針分子內(nèi)部互補(bǔ)堿基少于5bp；⑤.探針之間的二聚體＜6bp；⑥.每個(gè)探針與非靶基因的相似性必須＜40％，探針連續(xù)同源的堿基數(shù)≤20個(gè)。
6.一種如權(quán)利要求1所述的丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片的檢測(cè)方法，其特征在于，該檢測(cè)方法步驟如下(1).總RNA提取采用異硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆轉(zhuǎn)錄制備cDNACy3-dUTP標(biāo)記一組cDNA，Cy5-dUTP標(biāo)記另一組cDNA；(3).在雜交箱中與芯片進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，預(yù)雜交為20～30分鐘，雜交為12～16小時(shí)；(4).共聚焦熒光掃描儀上掃描雜交結(jié)果；(5).應(yīng)用微陣列分析軟件進(jìn)行定量分析；(6).根據(jù)分析結(jié)果確定丹參酮的相關(guān)基因表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明屬于涉及一種丹參酮相關(guān)基因的檢測(cè)芯片、制備及檢測(cè)方法，它是在玻片上設(shè)置特異性探針制成基因芯片，然后與經(jīng)過標(biāo)記的丹參樣品的cDNA雜交，經(jīng)掃描結(jié)果和定量分析確定丹參酮的相關(guān)基因表達(dá)量。該芯片是針對(duì)丹參酮相關(guān)基因而設(shè)計(jì)，特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)丹參酮相關(guān)基因的表達(dá)，適用于對(duì)丹參酮相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)以獲得其功能信息，這為丹參酮的研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)丹參的基因工程改造具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101041861SQ20071005717
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者張伯禮, 王慶浩, 王瑞菊 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)