專利名稱：：大引物pcr進(jìn)行定點突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及定點突變的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，特別是一種大引物PCR進(jìn)行定點突變的方法。首先由突變引物和相應(yīng)的外側(cè)引物進(jìn)行第一步PCR，其產(chǎn)物即大引物不需純化，與加入另一外側(cè)引物引發(fā)第二輪PCR擴增出目標(biāo)片段。本發(fā)明是克服了常規(guī)大引物和外側(cè)引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，并使突變效率達(dá)到100%。適合實驗室分子生物學(xué)手段研究。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93'C-94°C)使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72'C將單核苷酸從引物的3'端開始摻入，以目的基因為模板從5'—3'方向延伸，合成DNA的新互補鏈。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達(dá)到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分'離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途1)生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；2)由少量mRNA生成cDNA文庫；3)從cDNA中克隆某些基因；4)生成大量DNA以進(jìn)行序列測定；5)突變的分析；6)染色體步移；7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。經(jīng)典的大引物PCR定點突變技術(shù)需要三個引物，兩條外側(cè)正向和反向引物以及內(nèi)部突變引物。首先由突變引物和相應(yīng)外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR得到大引物，經(jīng)純化后與另一外側(cè)引物引發(fā)第二輪PCR得到目標(biāo)片段。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對大引物PCR方法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，使得第一步PCR產(chǎn)物不需純化，可直接在一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行第二步PCR。但此方法要求引物的Tm有顯著差異，第二輪PCR引物Tm高于第一輪PCR引物Tm值，才能排除低Tm值外側(cè)引物的干擾，省略了第一步的純化，進(jìn)行特異性擴增。然而此方法的突變效率不能達(dá)到100%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的大引物PCR進(jìn)行定點突變的方法。突破了現(xiàn)有大引物PCR方法對引物設(shè)計時退火溫度差距顯著的要求，同時解決了突變效率不高的缺點，使之更加簡單、高效，并使突變效率達(dá)到100%，適合實驗室分子生物學(xué)手段研究。本發(fā)明提供的大引物PCRiS行定點突變的方法的步驟包括設(shè)計的正反向引物不受退火溫度差距大的要求的限制，長度為24—39bp，優(yōu)選長度27-34bp，5'端根據(jù)原模板需要引入各種酶切位點，3'端與模板互補，互補的堿基數(shù)為9-14bp，優(yōu)選堿基數(shù)為9bp;根據(jù)要突變的堿基所處序列的位置設(shè)計突變引物，包括要突變原始序列的后部分的堿基，則突變引物要與下游引物相對應(yīng)，二者引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)；要突變原始序列前半部分的堿基，則應(yīng)與上游引物相對應(yīng)，二者引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)；將需要突變的堿基替換成期望突變后的堿基，并在其位點前后各延伸12bp，實現(xiàn)定點突變；突變引物的退火溫度要高于正反向引物，具體的步驟1)首先由突變引物和其對應(yīng)的外側(cè)引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變堿基的基因片段，實現(xiàn)大片段的合成，即大引物；2)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核苷酸和DNA聚合酶，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)，實現(xiàn)目標(biāo)片段的合成；兩條外側(cè)引物和突變引物的退火溫度相差10"16'C。一種大引物PCRS行定點突變的方法，包括的步驟編碼人干擾素a2b的全長原始序列(IFN-a2b)為模板，498bp，根據(jù)該原序列模板設(shè)計的上、下游引物和2個突變引物上游引物5，-CATAAGCTTATGTGTGATCTGCCTCAA-3，下游引物5'陽GTCGAATTCTTCCTTACTTCTTAATCT-3，突變引物1:5'-TGTGTGATACAGGAGGTGGGGGTGGAGGAGACTCCCCTG陽3，突變引物25，-CTCATGGAGGACGCTGATGGCCTGAGCCTTTTGGAA-3'1)首先由突變引物和其對應(yīng)的外側(cè)引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變基因片段，即大引物；PCR反應(yīng)體系10^1Buffer緩沖液，8nldNTP，2pl下游引物,2nl突變引物1,1(11干擾素原始序列為模板,76nl超純水，lplpfil酶；第一輪PCR反應(yīng)條件94'C變性4min，6(TC下退火30s,72。C下延伸30s;94'C變性40s,60'C下退火30s，72'C下延伸30s;(24個循環(huán))94。C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸5min;(2)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系10nlBuffer緩沖液,8pldNTP，2pl上游引物，lplpfti酶；第二輪PCR反應(yīng)條件94。C變性40s,68X:下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環(huán))94°C變性40s，55°C下退火25s，72°C下延伸1min;(12個循環(huán))最后72'C下延伸5min。所述的定點突變是多個位點的突變，且多個突變位點間可以相鄰或者間隔。所述的兩條外側(cè)引物的長度為27—30堿基，解鏈溫度為55—65'C。所述的突變引物的長度為36—39堿基，解鏈溫度為70—75°C。在所設(shè)計的突變引物長度范圍內(nèi)，突變點是1一5個多個位點突變，最適多個位點突變數(shù)目為3—4個。所述的方法得到的突變后的基因序列。所述的方法得到的干擾素a2b的突變后的基因序列。含有權(quán)利要求7所述的IFN-a2b突變后的基因序列的質(zhì)粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2以及具有Top10(rh-IFN-a2bl)和ToplO(rh-IFN-a2b2)的轉(zhuǎn)化子，分別由所述質(zhì)粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞而獲得。所述的原模板為干擾素a2b原始基因序列。所述的引物濃度為2(HiM。本發(fā)明的大引物PCR新方法，不僅克服了常規(guī)大引物和外側(cè)引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，解決了突變效率不高的缺點，使之更加簡單、高效，并使突變效率達(dá)到ioo%。適合實驗室分子生物學(xué)手段研究。圖l是實施例1的兩輪PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖2是實施例2的兩輪PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖3是實施例l的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖4是實施例2的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。圖5是質(zhì)粒pET-IFN-a2b構(gòu)建示意圖。具體實施例方式實施例h實驗步驟'(1)通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)數(shù)據(jù)庫檢索的人源干擾素a2b原始序列，運用primerpremier5.0軟件設(shè)計出該序列的上、下游引物，再根據(jù)要突變的堿基，設(shè)計出含有突變堿基的突變引物l。(2)由突變引物l和其對應(yīng)的外側(cè)引物(所述的引物濃度為20pM)引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變基因片段，即大引物。設(shè)計上、下游引物和突變引物序列，結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表l中下劃線部分是突變后的堿基。上游引物中CAT是保護(hù)堿基，AAGCTT是酶切位點；下游引物中GTC是保護(hù)堿基，GAATTC是酶切位點。由突變引物1和下游引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后再加入上游引物，它和上一輪PCR形成的大引物引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。由表中退火溫度可知，突變引物和上、下游引物的退火溫度相差在10-16。C之間，上、下游引物之間退火溫度相差在0-5。C之間。PCR反應(yīng)體系10plBuffer緩沖液(200mMTris-HCl,100mM(NH4)2SO4，100mMKC1,1%TritonX-100，20mMMgCl2,pH8.8),8pldNTP,2^1下游引物，2nl突變引物1,1pi干擾素a2b原始序列為模板,76nl超純水，l^ilpfo酶(北京鼎果生物技術(shù)有限公司)。第一輪PCR反應(yīng)條件94。C變性4min，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;94'C變性40s,6(TC下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環(huán))94r變性40s,60。C下退火30s，72。C下延伸5min。取出5nl產(chǎn)物跑EB(Ethidiumbromide,溴化乙錠)電泳，根據(jù)其條帶位置與marker(DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶)比較驗證合成的大引物堿基數(shù)目是否正確。如果正確，可進(jìn)行下一步;不正確的話，適當(dāng)改變反應(yīng)條件重新進(jìn)行PCR反應(yīng)。(3)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系6pldNTP，2nl上游引物,lnlpfu酶(同上)。第二輪PCR反應(yīng)條件94。C變性40s，68。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(10個循環(huán))94。C變性40s,55。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(12個循環(huán))最后72'C下延伸5min。(4)反應(yīng)結(jié)束后，取出5pl產(chǎn)物跑EB電泳，根據(jù)其條帶位置與marker比較驗證合成的含突變位點的干擾素序列的堿基數(shù)目是否正確。條帶位置正確，將PCR產(chǎn)物純化(采用EZSpinColumnPCRProductPurificationKit(BBI)試劑盒純化)。(5)用下面結(jié)果檢驗方法驗證突變的位點。結(jié)果檢驗和對比-將突變后的干擾素a2b片斷和pET28C載體質(zhì)粒分別用HindIII、EcoRI雙酶切，按插入的突變后的干擾素a2b片段載體=3:1的比例混合上述酶切純化后的產(chǎn)物，用同體積的連接緩沖液(DNALigationKitVer2.O(TakaRa寶生物大連有限公司)試劑盒的SolutionI(酶溶液))，在16'C下連接lh，將合成的突變基因片段插入到質(zhì)粒pET-28C的HindIII和EcoRI酶切位點之間，即可得到含有突變后的干擾素a2b基因序列的質(zhì)粒PET-IFN-a2bl。將連接產(chǎn)物在42'C熱擊條件下轉(zhuǎn)化到Topl0大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，加入40(HULB液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)50min后，取200W涂布在加有卡納霉素的平板上，37'C培養(yǎng)，即可獲得命名為T叩10(rh-IFN-a2bl)的轉(zhuǎn)化子。用牙簽挑取轉(zhuǎn)化子加入有5mlLB液體培養(yǎng)基的試管中搖床培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒，用HindIII、EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%的EB電泳驗證，結(jié)果如圖3所示，在500bp有片斷。將菌液測序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，測序結(jié)果進(jìn)行比對，突變位點正確，準(zhǔn)確率100%。實施例2:實驗步驟(1)同實例l，運用primerpremier5.0軟件設(shè)計出干擾素a2b原始序列的上、下游引物，再根據(jù)要突變的堿基，設(shè)計出含有突變堿基的突變引物2。(2)首先由突變引物和其對應(yīng)的外側(cè)引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變基因片段，即大引物。設(shè)計上、下游引物和突變引物序列，結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2中下劃線部分是突變后的堿基。上游引物中CAT是保護(hù)堿基，AAGCTT是酶切位點；下游引物中GTC是保護(hù)堿基，GAATTC是酶切位點。由突變引物2和上游引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后再加入下游引物，它和上一輪PCR形成的大引物引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。由表中退火溫度可知，突變引物和上、下游引物的退火溫度相差在10-16'C之間，上、下游引物之間退火溫度相差在0-5'C之間。PCR反應(yīng)體系10plBuffer緩沖液(同上)，8nldNTP，2pl上游引物，2pl突變引物2,1pl干擾素a2b原始序列為模板,76pl超純水，lnlpfti酶(同上)。第一輪PCR反應(yīng)條件94'C變性4min,60'C下退火30s，72。C下延伸30s;94。C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環(huán))94。C變性40s,6(TC下退火30s，72。C下延伸5min。取出5pl產(chǎn)物跑EB電泳，根據(jù)其條帶位置與marker比較驗證合成的大引物堿基數(shù)目是否正確。如果正確，可進(jìn)行下一步；不正確的話，適當(dāng)改變反應(yīng)條件重新進(jìn)行PCR反應(yīng)。(3)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系6|aldNTP，2nl下游引物，lnlpfia酶(同上)。第二輪PCR反應(yīng)條件94'C變性40s,68。C下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環(huán))94。C變性40s，55。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(12個循環(huán))最后72'C下延伸5min。(4)反應(yīng)結(jié)束后，取出5nl產(chǎn)物跑EB電泳，根據(jù)其條帶位置與marker比較驗證合成的含突變位點的干擾素序列的堿基數(shù)目是否正確。條帶位置正確，將PCR產(chǎn)物純化(同上)，即得到含有突變位點的干擾素基因序列。(5)結(jié)果檢驗和對比方法同實施例l。由于突變位點不同，獲得的干擾素a2b突變片斷不同，我們將實例2中獲得的轉(zhuǎn)化子命名為T叩10(rh-IFN-ci2b2)。將菌液測序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，測序結(jié)果進(jìn)行比對，突變位點正確，準(zhǔn)確率100%。序列表SEQUENCELISTING<110>天津大學(xué)〈120〉大引物PCR進(jìn)行多位點定點突變的方法〈130>200707〈160>7〈170〉Patentlnversion3.4<210>1〈211〉27〈212〉DNA〈213〉干擾素(IFN-a2b)〈400〉1cataagcttatgtgtgatctgcctcaa27〈210〉2〈211>27〈212〉DNA〈213〉干擾素(IFN-a2b)〈400>2gtcgaattcttccttacttcttaatct27〈210>3〈211〉39〈212〉DNA〈213〉干擾素(IFN-a2b)<400>3tgtgtgatac鄉(xiāng)aggtgggggtggaggagactcccctg39〈210〉4〈211>36〈212〉DNA〈213>干擾素(IFN-a2b)<400>4ctcatggaggacgctgatggcctgagccttttggaa36〈210〉5.<211>498<212>DNA〈213〉干擾素(IFN—a2b)〈400>5tgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacag60atgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccag120gaggagtttggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatgatc180cagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagaccctc240ctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgata300cagggggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggaggactccattctggctgtgagg360aaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagcccttgtgcctgg420gaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaageiaagt480tt33gaagta3gg38tg3498〈210>6〈211>516<212〉DNA〈213>重組干擾素(rh-IFN-a2b)<400>6cataagcttatgtgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatg60ctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgacttt120ggatttccccaggaggagtttggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctc180catgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgg240gatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaa300gcctgtgtgatacaggaggtgggggtggaggagactcccctgatgaaggaggactcc&tt360ctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagc420ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaac480ttgcaagaaagtttaagaagtaaggaagaattcgac516〈210>7<211〉516〈212>DNA〈213〉重組干擾素(rh-IFN-a2b)〈400〉7cataagcttatgtgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatg60ctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgacttt120ggatttcccceiggaggagtttggcaaccagttccaaaaggctcaggccatcagcgtcctc180catgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgg240gatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaa300gcctgtgtgatacagggggtgggggtgacagagdctcccctgatgaaggaggactccatt360ctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagc420ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaac■ttgcaagaaagtttaagsagt犯ggaag犯ttcgsc51權(quán)利要求1、一種大引物PCR進(jìn)行定點突變的方法，其特征在于包括的步驟設(shè)計的正反向引物不受退火溫度差距大的要求的限制，長度為24-39bp，優(yōu)選長度27-34bp，5’端根據(jù)原模板需要引入各種酶切位點，3’端與模板互補，互補的堿基數(shù)為9-14bp，優(yōu)選堿基數(shù)為9bp；根據(jù)要突變的堿基所處序列的位置設(shè)計突變引物，包括要突變原始序列的后部分的堿基，則突變引物要與下游引物相對應(yīng)，二者引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)；要突變原始序列前半部分的堿基，則應(yīng)與上游引物相對應(yīng)，二者引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)；將需要突變的堿基替換成期望突變后的堿基，并在其位點前后各延伸12bp，實現(xiàn)定點突變；突變引物的退火溫度要高于正反向引物，具體的步驟1)首先由突變引物和其對應(yīng)的外側(cè)引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變堿基的基因片段，實現(xiàn)大片段的合成，即大引物；2)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核苷酸和DNA聚合酶，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)，實現(xiàn)目標(biāo)片段的合成；兩條外側(cè)引物和突變引物的退火溫度相差10-16℃。2、一種大引物PCR進(jìn)行定點突變的方法，其特征在于包括的步驟編碼人干擾素a2b的全長原始序列(IFN-a2b)為模板，498bp，根據(jù)該原序列模板設(shè)計的上、下游引物和2個突變引物上游引物5，-CATAAGCTTATGTGTGATCTGCCTCAA-3，下游引物5，-GTCGAATTCTTCCTTACTTCTTAATCT-3，突變引物1:5，-TGTGTGATACAGGAGGTGGGGGTGGAGGAGACTCCCCTG-3'突變引物2:5，-CTCATGGAGGACGCTGATGGCCTGAGCCTTTTGGAA-3'1)首先由突變引物和其對應(yīng)的外側(cè)引物引發(fā)第一輪PCR反應(yīng)，擴增出含突變基因片段，即大引物；PCR反應(yīng)體系lOplBuffer緩沖液，8pldNTP，2^1下游引物,2iul突變引物l,lW干擾素原始序列為模板,76nl超純水，lplpfU酶；第一輪PCR反應(yīng)條件94'C變性4min，60'C下退火30s，72。C下延伸30s;94'C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環(huán))94°C變性40s，60°C下退火30s，72°C下延伸5min;(2)產(chǎn)物不需純化，直接在同一反應(yīng)管中加入另一外側(cè)引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfo酶)，引發(fā)第二輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系10plBuffer緩沖液，8pldNTP，2W上游引物，linlpfu酶；第二輪PCR反應(yīng)條件94"C變性40s,68'C下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環(huán))94'C變性40s，55'C下退火25s，72'C下延伸lmin;(12個循環(huán))最后72'C下延伸5min。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的定點突變可以是多個位點的突變，且多個突變位點間相鄰或者間隔。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的兩條外側(cè)引物的長度為27—30堿基，解鏈溫度為55—65'C。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的突變引物的長度為36—39堿基，解鏈溫度為70—75'C。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在所設(shè)計的突變引物長度范圍內(nèi)，突變點是2—5個多個位點突變，最適多個位點突變數(shù)目為3—4個。7、權(quán)利要求1或2所述的方法得到的突變后的基因序列。8、權(quán)利要求2所述的方法得到的干擾素a2b的突變后的基因序列。9、含有權(quán)利要求7所述的IFN-a2b突變后的基因序列的質(zhì)粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2。10、具有ToplO(rh-IFN-a2bl和rh-IFN-a2b2)的轉(zhuǎn)化子，由權(quán)利要求8所述質(zhì)粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞而獲得。全文摘要本發(fā)明提供一種大引物PCR進(jìn)行定點突變的方法。首先由突變引物和相應(yīng)的外側(cè)引物進(jìn)行第一步PCR，其產(chǎn)物即大引物不需純化，與加入另一外側(cè)引物引發(fā)第二輪PCR擴增出目標(biāo)片段。本發(fā)明克服了常規(guī)大引物和外側(cè)引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，并使突變效率達(dá)到100％，適合實驗室分子生物學(xué)手段研究。文檔編號C12N15/01GK101210240SQ20071006015公開日2008年7月2日申請日期2007年12月25日優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日發(fā)明者元英進(jìn),劉春杰,祝琳琪,趙廣榮,超黃申請人:天津大學(xué)