專利名稱：銅綠假單胞菌鞭毛運(yùn)動相關(guān)基因pa2950及應(yīng)用的制作方法
銅綠假單胞鋼秘動相，因尸J2950 ^SiSffl
M領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種銅綠假單胞M毛運(yùn)動相關(guān)基因
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌(fteWo鵬nas aeruginosa)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，它是一 種分布廣泛的割頓病菌，在臨床上，它能引起菌血病、耳、眼、i^^:軟組織、骨及關(guān)節(jié)、心內(nèi) 膜和呼吸系統(tǒng)等的感染，是人類的三;^C病菌之一，是引娜炎的首要致病菌。由于其具有形成生 物鵬等多重耐藥機(jī)制，耐藥率高，常在臨床上引起頑固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問 題。
銅綠假單胞菌具有彰瑞鞭毛，運(yùn)動活潑。鞭毛作為主要的運(yùn)動器官，對銅綠假單胞菌提高營 養(yǎng)物質(zhì)的獲得,逃避毒性物質(zhì)，轉(zhuǎn)移到誠的寄主，找到魏的固著位點和向環(huán)境擴(kuò)散傳播起著重 要作用。生物 斷氐了藥物的 性，與耐藥性緊密相關(guān)，在生物被膜的形成過程中，鞭毛的運(yùn)
動對最初的固著與擴(kuò)t5:il^^至^M要的作用。對銅綠假單胞M，動相，因進(jìn)行研究,確 定縫因的功能,為揭示其鞭接動機(jī)理和鞭毛在生辦w^成中、在自然別專播中作用的機(jī)理提 供基礎(chǔ)，為臨床治療和耐藥防治,理論依據(jù)。
有關(guān)銅綠假單胞菌鞭秘動相錢因的功能研究，國內(nèi)尚無報道，國夕附就此方面有一定 的涉及，其研魅要是在控制鞭毛數(shù)目基因、調(diào)節(jié)鞭毛蛋白合成的調(diào)節(jié)因子等方風(fēng)f別于鞭頓 動相關(guān)基因的功能、各基因間如何調(diào)節(jié),尚存在不少疑點，缺少系統(tǒng)的研究。本研究從這一點 出發(fā)，探索與鞭^ig動相關(guān)基因的功能闡明其運(yùn)動相關(guān)基因之間的作用機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明目的是Mf共銅綠假單胞，^動相^S因尸」29M，并用該基因為新，點
研制抑制銅綠假單胞菌的新型藥物。
本發(fā)明^1共的銅綠假單胞菌鞭^動相，因iM295仏其核苷,列如序列^0 ^，其基因 長度為l懸p,位于銅綠假單胞菌基因組282節(jié)3309411—3310607。
Ji^的銅綠假單胞菌鞭，動相，因i^^ 可以用于以該基因為新IPE點設(shè)計并制皿菌 藥物，以及在食品衛(wèi)生和耐藥防治方面的應(yīng)用。
本發(fā)明基因M2W0的獲得方法ffiffl人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)(一種基于噬菌體Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座技 術(shù))，造成銅綠假單胞菌基因突變，粒突變子文庫。篩選泳動能力喪失的突變子，{頓S棚HI 酶切基因組DNA，酶切片段與pUC18載體連接，i!31電轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，用卡那 霉素和氨節(jié)青霉素艦LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，測定突變株中插入片段的核苷,列，發(fā)現(xiàn)Mu 插入的基因，確定此基因與銅綠假單胞M秘動有相關(guān)性。
本發(fā)明的有 *:
實^S現(xiàn)，本發(fā)明鵬的基因川"50缺失或失活后，倉^f賺毛介導(dǎo)的泳動能力喪失。
Mu插入失活的基因泳動能力喪失，說明此基因與銅綠假單胞M^毛的運(yùn)動有關(guān)，m鞭^ii
動相，基因的發(fā)現(xiàn)以及揭^基因的功能都有指導(dǎo)意義。
M本發(fā)明，可以針對/^"50基因設(shè)計藥物，限制其正常駄，使得細(xì)菌無法Mii鞭秘動
形成生tlW，斷氐其耐藥性，超i胎療銅綠假單胞菌弓胞的感染的目的。


1
圖1是泳動能力喪失的陽性轉(zhuǎn)化子的蹭動運(yùn)動檢測圖，其中，1、野生型PA68作為陽' 照， 2、 i^2柳::MuPA68突變株。
圖2是Mu克隆子酶切^電泳圖，1、 DL15000 2、質(zhì)粒3、質(zhì)粒酶切。
圖3是Mu轉(zhuǎn)座子PCR,電泳圖(用PCR方法檢測轉(zhuǎn)化子的Mu轉(zhuǎn)座子)，
其中，4、 DL2000， 5、 Mu克隆子PCR產(chǎn)物。
用Mu-k孤Pl和Mu-kamP2作為弓物，克隆子質(zhì)粒DNA為*鎌，可以擴(kuò)增出700bp的特異性片 段，說明所檢測的克隆子質(zhì)粒中攜帶著插入了 Mu轉(zhuǎn)座子的基因片段。
具體實lfe^:
實施例l: 4頓Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)進(jìn)行突，文庫的^:
(1) 將臨床分離糊綠假單胞菌PA68接種于50 ml L-broth培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵 母粉,5g/LNaCl)中，37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(2) 次日按l: 100接種至200mlL—broth培養(yǎng)基中，200rpm， 37。C培養(yǎng)至OD540^0.5，終止培養(yǎng)。
(3) 于2。C 7000 g離心10 min，收集菌體。
(4) 依次用靴積、1/2體積、1/5體積在冰浴中預(yù)冷的300mM庶糖溶體織浮、洗滌菌體，2 。C 8000g離心10min，倒凈殘液。
(5) 根據(jù)菌體的多少用不同體積的300mM蔗糖溶液混勻，并ffiil活細(xì)胞計數(shù)制備j^度約為10" 個cells/ml的感受態(tài)細(xì)胞。
(6) 將感受態(tài)細(xì)胞5)^ 100 ul /管， 一部分直接用于電轉(zhuǎn)化，1分在液氮中冷凍后，放一80 。C職中保存。另一部分直接放—8(TC,保絲用。
(7) 取感受態(tài)細(xì)胞100 u 1、質(zhì)粒pSMC28和Mu轉(zhuǎn)座復(fù)，約50ng，加入到在冰浴中預(yù)冷的0.2 cm 電轉(zhuǎn)化杯中(陰'艦照只加感受態(tài)細(xì)胞不加質(zhì)粒)，在Bio-Rad電穿孔^Lt設(shè)置電容25uF，電阻
200 i^B^iS的電壓^電擊。
(8) 電擊后將轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入職37。C溫浴的900"L-broth培養(yǎng)基中。37°C， 225ipm， i歸lh 。
(9) 取100 P L菌液涂布于50 ii g/ml Km抗性平板上，溫箱37°C過夜培養(yǎng)，24小時后即可觀察結(jié) 果。
(10) 腿夜i歸的篩選平ISJ:挑取數(shù)個離，分別接種到1 ml的L一broth中，37°C， 200卬m 振蕩培養(yǎng)16—18 h。
(11) 取2 n 1菌液1辦鎌，以AX Mu轉(zhuǎn)座子上的特異序列Mul (5， - GCMCTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3')做引物，用PCR方纟,增Mu轉(zhuǎn)座子片段。同時分別以 銅綠假單胞0^株^M粒pmH2做陰性及陽'l^t照。擴(kuò)增條件為，先在94C性15min，然后， 94。C變性1 min， 55。C退火1 min， 72。C延伸1 min，共30個循環(huán)，雜72。C延伸10 min。
(12) PCR產(chǎn)鵬0.8%瓊脂糖繊中電泳檢測，EB染色后紫外燈下觀察結(jié)果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子即為Mu轉(zhuǎn)座復(fù)，轉(zhuǎn)化子。
實施例2:突變子的泳動能力的檢測
a)在無菌塑料培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上一層泳動能力檢測培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/LNaCl， 0. 3%瓊脂糖)。
(2) 從Mu轉(zhuǎn)座子突變文庫中活化突'，株。
(3) 用滅菌的牙翻嫩 點種在培養(yǎng)基的表面，30 °C培養(yǎng)12到14小時。
(4) 細(xì)菌會 鞭％^動在培養(yǎng)基的表面以接種點為圓心向周圍泳動生長，形#小不一的圓環(huán)， 以野^MPA68為對照，篩選泳動能力喪失的突變株(圖l)。
實施例3:新包桿菌抑真菌相^S因的克隆 1 Mu轉(zhuǎn)座復(fù)合,化子基因組DNA的提取
(1) 將銅綠假單胞菌Mu轉(zhuǎn)座復(fù)激轉(zhuǎn)化子接于5mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C 200r/min過夜培養(yǎng)。
(2) 4'C 5000r/min離心10射中，棄上清，菌體重懸于200&裂解緩沖液。
(3) 力口入4mL 10 mg/ml的RNase, 37。C水浴30併中。
(4) 加入8^l 20 mg/mL的蛋白酶K， 20% SDS 5jjL，于56。C水浴30 ^H中。
(5) 分別用等#%口、苯酚，苯酚:氯仿(l:l)和氯仿各抽提l次，12000r/min離心10射中。
(6) 加入2倍^KR冷凍的^7jC乙醇，f2(rC敗置30射中。
(7) 挑出DNA， 70%乙瞎先滌2次，真空千燥。
(8) 溶于50|_iL TE， -20。C保存。
2大量提取規(guī)桿菌質(zhì)粒pUC18
(1) 25mL液體LB培養(yǎng)基，接入攜帶質(zhì)粒pUC18的大腸桿菌單01:， 30°C、 200r/min培養(yǎng)過夜。
(2) 菌液的OD6oo散于1.0后，4°C 6000r/min離心10射中，棄上清。
(3) 加STE溶液(100 mM NaCl ， 10 mM Tris. Cl pH8.0, 1 mM EDTA) 12. 5mL M胞，4°C 6000r/min 離心10贈，棄上清。
(4) 加溶液I (50 mM葡錄糖，10 mM EDTA, 25mM Tris.Cl， pH8.0) 0. 5mL再向各管中加入溶 菌酶(反應(yīng)濃度20ng/mL),輕微混，37。C7K浴15-30min。
(5) 加溶液II (0.2 M NaOH， 1% SDS) lmL輕輕混勻Mig明，冰浴10^t1。
(6) 加入溶液III (3 M KAc， 5 M乙酸，pH4.8) 0. 75mL劇烈振蕩后，冰浴30^Ht。
(7) 4'C 12000r/min離心5併中，^Ul清。
(8) 力口入0. 7 #%口、的異丙醇，室MW 15贈。
(9) 4°C 12000r/min離心10辦中，棄上清。
(10) 加入lOO^L TE溶液溶lft亥酸。
(11) 加入RNase (Si^濃度為100pg/mL) 37。CtK浴30射中。
(12) 靴積漂酚:氯仿(1:1)，抽提，振蕩均勻，4'C 12000r/min離心15併中，^Ul清。
(13) 加入2 ff^f只的^7K乙醇和1/10 #^只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， -20°C^S 20射t沉淀DNA。
(14) 4。C 12000r/min離心10射中，棄上清。
(15) 加入lmL70T。的冷乙醇洗DNA沉淀兩次，干燥。
(16) 加入50pL TE溶解質(zhì)粒，-2(TC保存。
3基因組DNA和質(zhì)粒pUC18的酶切(50mL體系) 10 X buffer 5yL fefflHI 2" DNA 10uL ddH20 33 yL
混勻，30t^浴過夜。
4酶的滅活與純化
(1) 酶切體系置于65。C水浴15併中，之后降M^溫。
(2) TE補(bǔ)^400pL，等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(3) 加入2倍^i口、的^7jC乙醇和1/10 ^f只的3mol/L NaAc (pH4.8)， -20。C方夂置20射^沉淀DNA。
(4) 4°C 12000r/min離心10倂中，棄上清。
(5) 加入lmL70"/。的冷乙ei先DNA沉淀兩次，真空千燥。
(6) pUC18溶于88^L lm mol/L Tris^Cl，基因組DNA溶于lpL TE。 5 pUC18去磷酸《七
pUC18 88^L
10X buffer 10pL CIAP (堿性磷酸酶) 2^L 置于37。C7JC浴30^H中。 6去磷酸鶴的除去
(1) TE補(bǔ)y^M200ML,加入2pL 0.5 mol/L EDTA。
(2) 75。C水浴10辦中，使酶失活，并降M^溫。
(3) 等體積的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(4) 加入2 fg^f只的^7K乙醇和1/10^f只的3mol/LNaAc (pH4.8)， -2(TC體20辦t沉淀DNA。
(5) 4°C 12000r/min離心10射中，棄上清。
(6) 力口入lmL7Wo的冷乙S^DNA沉淀兩次，真空千燥。
(7) 沉淀溶于5MLddH2。中。
7基因組DNA和質(zhì)粒pUC18的連接(15^1體系) DNA lpL ddH20 攀 pUC18 1mL
混勻，45。C7K浴5射中后，腿冰浴，再加T4連接酶1. 5mL， 10Xbuffer 1. 5mL， 14-16°C 水浴過夜。
8連接,的處理
(1) TE補(bǔ)趕200nL。
(2) 加入2倍^i口、的^7K乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH4.8)， -20。C方夂置20併中沉淀DNA。
(3) 4°C 12000r/min離心10射中，棄上清。
(4) 加入lmL70"/。的冷乙醇洗DNA沉淀兩次，真空干燥。
(5) 沉淀溶于5MLddH20中。
9 ，桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1) 將;^桿菌單麟接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C、 200轉(zhuǎn)/倂中過夜培養(yǎng)。
(2) 過夜i歸的菌液按l: 100接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 220 r/min振蕩培養(yǎng)。
(3) 菌液ODeoo在0. 5-0. 6之間時終止培養(yǎng)并置于冰上。
(4) 轉(zhuǎn)移至250mL離心中，4°C、 6000r/min離心10min,收集菌體。
(5) 100mL預(yù)冷的ddH2O懸浮洗滌細(xì)胞，4°C 6000r/rain離心10併中，收集菌體。
(6) 50mL預(yù)冷的l(m甘油懸浮洗滌細(xì)胞，4°C 6000r/min離心10辦中，收集菌體。
(7) 用2mL預(yù)冷的lW。甘油懸浮洗滌細(xì)胞，4。C 6000r/min離心10併中，棄上清，盡量吸干管壁 上的殘留液體。
(8) 用200^L預(yù)冷的1(m甘油培養(yǎng)^g;t細(xì)胞。
(9) 100倍稀釋后測菌液OD6qo，用預(yù)冷的10%甘油培#^將菌 釋至濃度為2xl()w-3xl0W個 細(xì)H/mL (10D6oo約相當(dāng)于2.5xloW個細(xì)M/ml)。
(10) 將菌液，，毎管95mL。用于電轉(zhuǎn)tt^-7(TC保存。 10 :^桿菌DH5a的電轉(zhuǎn)化方法
(1) 5pL DNA連接產(chǎn)物與95nL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴5-10條
(2) 混^t/轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中(陰'頓照不加混^tl，只加感受態(tài)細(xì)胞)，在Bio-Rad 電轉(zhuǎn)化^Ol設(shè)置2.50kv，進(jìn)行電擊。
(3) 從電轉(zhuǎn)化杯中吸出電轉(zhuǎn)化體系，并用lmL37'C預(yù)熱的S0C液體培養(yǎng)基(20g/L胰蛋白胨，5g/L 酵娜，0.5g/LNaC120mM葡繊，lOmM氯化鎂)糖后，37°C， 150轉(zhuǎn)/倂中i歸1小時。
(4) 菌液^涂布于含20咖ol/L MgS04 50pg/mL卡那霉素和lOOpg /mL氨節(jié)青霉素的LB固體 培養(yǎng)基上，37。C倒置過夜培養(yǎng)。
11克隆子的 、鑒定-.
(1) 艦夜i歸的鵬平fei挑取轉(zhuǎn)化子，小量提M粒，用限制性內(nèi)切酶fe/iH酶切，并以 pUC18M I酶切產(chǎn)物為對照。
(2) 以DL15000為DNA標(biāo)準(zhǔn)，在0.8%瓊脂輸鵬中電泳檢測鑒定，釤隨同時具有pUC18載體帶 和夕卜源目的基因帶的克隆子(圖2)。
(3) 同時以從轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒為t鎌，用Mu轉(zhuǎn)座子DNA片段的Mu轉(zhuǎn)座子檢測弓物Mu-kam Pl 和Mu-kam P2進(jìn)行PCR (具體方法同實施例1中所述)。電泳檢測PCR產(chǎn)物，以DL2000為DNA標(biāo)準(zhǔn)， 以質(zhì)粒pHTH2為正,照，若能擴(kuò)增出700bp的特異性帶，貝i脫明轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒中含有A!Mu轉(zhuǎn)座子 DNA片段，克隆成功(圖3)。
(4) 對成功克隆的轉(zhuǎn)化子質(zhì)f腿行測序。 12克隆子質(zhì)粒的DNA測序
將用15%甘油管保存的轉(zhuǎn)化子菌液，用以Mu轉(zhuǎn)座子兩端的反向序列為依據(jù)設(shè)計的AM42P2作為 引物進(jìn)行測序，委肚海英俊公司進(jìn)行DNA測序，測定轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼的核苷,列。 13.基因推斷
測序結(jié)果在銅綠假單胞菌的基因組數(shù)據(jù)庫(http〃www. pseudomonas.com)或GenBank (http:〃麵.ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST中進(jìn)行序列t瀏最終發(fā)現(xiàn)所需基因。
序列表
<110>南開大學(xué)
<120>銅綠假單胞011^動相，因^"50皿用
<160> 1
<10> 1
<211>1197
<212>DNA
<213>銅纟錄假單胞菌(iVw^o附o/ oy am(g7-"asa) <400>1
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gactacgagcaggacgtcaacccgggcgtgcggatcgccaacctgatccaggcctga119權(quán)利要求
1、一種銅綠假單胞菌鞭毛運(yùn)動相關(guān)基因PA2950，其核苷酸序列如序列表所示，其基因長度為1197bp，位于銅綠假單胞菌基因組282節(jié)3309411-3310607。
2、 權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞翻秘動相關(guān)基因州"50的應(yīng)用，用于以該基因為新藥 耙點設(shè)計并制織菌藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了銅綠假單胞菌鞭毛運(yùn)動相關(guān)基因PA2950。屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明與銅綠假單胞菌致病性的研究息息相關(guān)，此基因大小為1197bp，國際上對該基因的功能沒有報道。實驗發(fā)現(xiàn)該基因的缺失能夠使鞭毛介導(dǎo)的泳動能力喪失。鞭毛是銅綠假單胞菌主要的運(yùn)動器官和重要的毒力因子，用銅綠假單胞菌鞭毛運(yùn)動相關(guān)基因PA2950為新藥靶點研制抗菌藥物，為臨床治療和耐藥防治服務(wù)。
文檔編號C12N15/31GK101195827SQ20071006018
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者喬明強(qiáng), 張秀明, 徐海津, 李迎麗, 芳 白, 白艷玲 申請人:南開大學(xué)