專利名稱：：嗜熱地芽孢桿菌dm-2產(chǎn)生的生物乳化劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法嗜熱地芽孢桿菌DM-2產(chǎn)生的生物乳化劑及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于能源生物技術(shù)和環(huán)境生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，它涉及一株嗜熱地芽孢桿菌(Geotocz7/w.sp)DM-2菌株產(chǎn)生的生物乳化劑，及其在提高石油采收率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，隨著石油資源的日益短缺和勘探費(fèi)用的不斷增加，單純注水的二次采油技術(shù)由于效率較低(水驅(qū)后幾乎有6070%的原油仍殘留在油藏中)，已逐漸不能滿足人們對(duì)石油資源有增無(wú)減的需求。近年來(lái)，以微生物提高原油采油率(MicrobialEnhancedOilRecovery,MEOR)技術(shù)為代表的三次采油方法正逐漸受到廣泛重視。該技術(shù)利用微生物的有益活動(dòng)及代謝產(chǎn)物來(lái)提高原油采收率，是繼熱力驅(qū)、化學(xué)驅(qū)、聚合物驅(qū)等傳統(tǒng)"三采"方法之后的一項(xiàng)綜合性技術(shù)。在微生物降解原油的實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)遇到一種現(xiàn)象，就是乳化效果特別好的實(shí)驗(yàn)組其油水界面張力并不顯著降低?；诖祟惉F(xiàn)象，我們有兩個(gè)概念必須加以澄清，就是生物表面活性劑和生物乳化劑的區(qū)別。在廣義上生物乳化劑屬于生物表面活性劑，但在狹義上它們是按照各自的功能區(qū)分的。生物表面活性劑(如糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、短肽等)是一些低分子量的小分子，它們能顯著降低空氣一水或油一水界面的張力，從而有助于油水乳化，但形成的乳狀液往往不能穩(wěn)定存在。生物乳化劑是一些生物大分子，如多糖蛋白、脂多糖、或這些聚合物的混合物等，它們雖不能顯著降低表面張力，但對(duì)油水界面表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力，能夠吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，從而使這種乳狀液得以穩(wěn)定，這種效應(yīng)使得烷烴呈膠狀分散，增加了烷烴與細(xì)胞的接觸。因此生物乳化劑的主要作用是乳化原油，降低原油粘度，更重要的是提高微生物對(duì)烴的降解效率。生物乳化劑具可降解、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、安全無(wú)毒、價(jià)格低廉、高乳化活性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。目前最常見的生物乳化劑是兩親脂多糖類聚合物或蛋白因子，分子量較大(從5kD100kD)，它們一般不會(huì)使油水界面張力降得很低，但很適合于作乳狀液的穩(wěn)定劑，特別是對(duì)原油的乳化和粘度降低的性能要比生物表面活性劑好的多。生物乳化劑的研究開始于本世紀(jì)六十年代，目前所知多種微生物可產(chǎn)乳化劑，乳化劑種類很多，但對(duì)乳化劑的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)知之甚少，尤其是兼性厭氧嗜熱菌產(chǎn)生的乳化劑還未見報(bào)道；生物乳化劑具有對(duì)烴良好的乳化性能和促進(jìn)烴降解的特性，但是直到現(xiàn)在生物乳化劑的合成機(jī)制尚不清楚，因此有必要進(jìn)一步研究，這對(duì)于充實(shí)微生物采油和生物修復(fù)技術(shù)的機(jī)理具有重要的理論價(jià)值。加快國(guó)內(nèi)微生物采油技術(shù)的發(fā)展，符合我國(guó)石油工業(yè)發(fā)展的需要，有利于實(shí)現(xiàn)"穩(wěn)定東部、發(fā)展西部"的戰(zhàn)略決策。對(duì)能以垸烴為碳源的嗜熱菌的烷烴降解特性及其產(chǎn)生的生物乳化劑進(jìn)行研究，使其適用于高溫油田而提高石油采收率具有很好的發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)石油資源的日益短缺和勘探費(fèi)用不斷增加的問(wèn)題，提供一種地芽孢桿菌(Geo^"7/附.sp)DM-2產(chǎn)生的新型糖蛋白類生物乳化劑，以便提高烷烴和原油在水中的溶解度，促進(jìn)活性菌株對(duì)烷烴和原油的作用。本發(fā)明涉及的地芽孢桿菌(GeoZ)flc!7/^sp.)DM-2菌株，于2005年12月14日保藏于"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中科院微生物研究所)，其保藏號(hào)為CGMCCNo.1565。上述地芽孢桿菌(Geo^cz7/^sp.)DM-2菌株，是經(jīng)紫外照射誘變，挑選乳化原油最快的轉(zhuǎn)化子，并以液蠟為唯一碳源的情況下在70°C反復(fù)馴化培養(yǎng)十代而獲得。地芽孢桿菌(Geo^"7/^sp.)DM-2CGMCCNo.1565可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如普通牛肉汁、LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中生長(zhǎng)，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，也可以以烷烴或原油為碳源生長(zhǎng)。菌株在507(TC之間的一適宜溫度下兼性厭氧生長(zhǎng)。地芽孢桿菌(Geo6"c/〃Msp.)DM-2CGMCCNo.1565產(chǎn)生的生物乳化劑含有蛋白質(zhì)和多糖，不含脂類；多糖組分僅有一種葡萄糖組成，蛋白組分由賴氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五種氨基酸組成。該生物乳化劑能很好的乳化柴油、煤油、正烷烴、原油和芳香族化合物。上述生物乳化劑的制備方法，是在培養(yǎng)嗜熱地芽孢桿菌GeoZw"7/船sp.DM-2的過(guò)程中，向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加碳水化合物，即淀粉、乳糖、蔗糖或葡萄糖為碳源，其培養(yǎng)基組成如下g/L:K2HP04'3H204.8;KH2P041.5;(NH4)2S041;檸檬酸三鈉0.5;MgS04'7H200.2;葡萄糖2;酵母提取物0.1;CaCl2'2H200.002;MnCl2'4H200.0004;NiCl2'6H200.0004;ZnS04.7H200.0004;FeClr6H200.0002;NaMo04'2H200.0002;培養(yǎng)條件5070。C，優(yōu)選60。C-65。C，pH68，培養(yǎng)2448小時(shí)，以丙酮沉淀透析法和酸沉法分離乳化劑，最后得到生物乳化劑。生物乳化劑的具體分離提取方法是，將上述的培養(yǎng)發(fā)酵液8000rpm4X:離心除去菌體后，加入3倍體積冰冷丙酮或者工業(yè)酒精，用玻璃棒攪拌均勻，置于4'C過(guò)夜，離心得沉淀，用2000mlddH204。C透析，然后冷凍干燥，得乳化活性物質(zhì)。CGMCCNo.1565菌所產(chǎn)生的生物乳化劑做Molish反應(yīng)判定糖類，用Bradford比色法測(cè)定蛋白，油紅O染色測(cè)定脂類，實(shí)驗(yàn)表明該乳化劑含有蛋白質(zhì)和多糖，不含脂類，如圖4和圖5所示。生物乳化劑糖組分分析方法是，取該物質(zhì)5mg加入2MH2S04中，沸水浴10h以上，用BaC03中和H2S04，離心除去沉淀，得水解后樣品與單糖標(biāo)準(zhǔn)品在新華1號(hào)濾紙上經(jīng)正丁醇冰乙酸水=4:1:5的展開劑展開，9h后風(fēng)干，噴顯色劑苯胺-磷酸鹽溶液(a:b=2:3;a-苯胺水冰乙酸磷酸=2:20:18:1;b-丙酮)；再風(fēng)干后，于IO(TC顯色2-5min，計(jì)算樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值。生物乳化劑氨基酸組分分析方法是，取該物質(zhì)lmg加入6NHCl中，ll(TC水解24h以上，將HC1蒸干后，溶于雙蒸水中，得水解后樣品與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品在新華1號(hào)濾紙上經(jīng)正戊醇吡啶水=35:35:30的展開劑展開，9h后風(fēng)干，用10%茚三酮IO(TC顯色10min，計(jì)算樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值。CGMCCNo.1565菌所產(chǎn)生的生物乳化劑有明顯的乳化能力，根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的乳化能力測(cè)定方法，以柴油為乳化對(duì)象，乳化劑與柴油以7:3體積比混合，劇烈震蕩lmin，靜置24h，乳化指數(shù)(Emusificationindex,EI-24)用乳化層的高度與測(cè)試烴的總高度之比，乘以100%來(lái)計(jì)算。如果EI-24大于等于50X，則說(shuō)明乳狀液是穩(wěn)定的。結(jié)果表明該乳化劑對(duì)二甲苯，甲苯，煤油和原油等都有很好的乳化作用，如表2所示。CGMCCNo.1565菌所產(chǎn)生的生物乳化劑有明顯的促使原油的降粘和降凝，并使原油的降解率提高。以產(chǎn)生生物乳化劑的發(fā)酵液作為種子液，與以烷烴培養(yǎng)的種子液相比，前者對(duì)原油的降粘和降凝作用更顯著，并可促進(jìn)原油的降解，如表3所示。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明涉及的一種地芽孢桿菌Geo6a"7/wssp.DM-2CGMCCNo.1565菌株，以糖為碳源在507(TC高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可產(chǎn)生一種新型的糖蛋白類的生物乳化劑；該乳化劑對(duì)柴油，煤油，原油和芳香族化合物都具有很好的乳化效果，能夠提高烷烴和原油在水中的溶解度，明顯促進(jìn)活性菌株對(duì)烷烴和原油的降解，該生物乳化劑用于微生物采油試驗(yàn)，產(chǎn)油有效期可達(dá)80天，共增產(chǎn)原油239噸，因此可用于提高石油采收率。圖1是G②6"c"/msp.DM-2CGMCCNo.1565菌生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)酵液表面張力，乳化指數(shù)和菌體量隨時(shí)間的變化曲線；圖2是Geo6"c!7/船sp.DM-2CGMCCNo.1565菌產(chǎn)生物乳化劑的發(fā)酵液對(duì)柴油的乳化作用；圖3-1是Geo6ac/〃船sp.DM-2CGMCCNo.1565菌產(chǎn)生的生物乳化劑不同濃度對(duì)柴油的乳化效果；圖3-2是Geo6a"7/wsp.DM-2CGMCCNo.l565菌產(chǎn)生的生物乳化劑對(duì)柴油形成的乳狀液在不同溫度下的穩(wěn)定性；圖3-3是Geo^7/wssp.DM-2CGMCCNo.1565菌產(chǎn)生的生物乳化劑對(duì)NaCl的耐受能力；圖4是GeoZw"'〃^sp.DM-2CGMCCNo.1565菌產(chǎn)生的生物乳化劑糖組分分析；圖5是G②Zw"7/wjsp.DM-2CGMCCNo.1565菌產(chǎn)生的生物乳化劑氨基酸組分分析；圖6是生物乳化劑注入試驗(yàn)1號(hào)井后產(chǎn)量變化曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例h生物乳化劑的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的CGMCCNo.1565菌能以碳水化合物為碳源(如蔗糖、葡萄糖等)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)生物乳化劑，以葡萄糖為碳源時(shí)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件(通氧量，發(fā)酵周期等)，等試驗(yàn)獲得該G^Z^"7/船sp.DM-2菌株產(chǎn)生生物乳化劑的最佳培養(yǎng)基為(g/L)K2HP04'3H204.8;KH2P041.5;(NH4)2S041;檸檬酸三鈉0.5;MgS04.7H200.2;葡萄糖2;酵母提取物0.1;CaCl2.2H200.002;MnCl2-4H200.0004;NiCl2'6H200.0004;ZnS04'7H200.0004;FeCl36H200.0002;NaMo04'2H200.0002;蒸餾水，1000ml。最佳培養(yǎng)條件為初始pH7.2。12rC滅菌30min，在507(TC條件下，130rpm振蕩培養(yǎng)48h，經(jīng)山東省科學(xué)院生物研究所研制的SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)菫榱悖藭r(shí)產(chǎn)生生物乳化劑效果最好，發(fā)酵液乳化能力為100%，24h后乳狀液穩(wěn)定，如圖2所示，并可穩(wěn)定7d以上。實(shí)施例2:生物乳化劑的分離提取。GmZw"7/msp.DM-2菌株在產(chǎn)生生物乳化劑的培養(yǎng)基和條件下(同實(shí)施例1)培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液8000rpm4。C離心除去菌體后，加入3倍體積冰冷丙酮或者工業(yè)酒精，用玻璃棒攪拌均勻，置于4'C過(guò)夜，離心得沉淀，將沉淀透析后冷凍干燥，得乳化活性物質(zhì)，將在EM培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物，4'C條件下，10000rpm4'C離心收集沉淀，將沉淀用ddH20重懸，用2000mlddH204"C透析，然后冷凍干燥，得乳化活性物質(zhì)，該物質(zhì)溶于雙蒸水后對(duì)柴油的乳化能力為100%。在光學(xué)顯微鏡下觀察乳化液滴的大小，隨即測(cè)量20個(gè)液滴，計(jì)算乳化液滴的平均大小，如表1所示，提取的乳化活性物質(zhì)對(duì)柴油作用后，產(chǎn)生的乳化液滴約為發(fā)酵液作用的1/3。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3:生物乳化劑對(duì)不同鏈長(zhǎng)烷烴的乳化能力。Geo6""7/Msp.DM-2菌株產(chǎn)生生物乳化劑的發(fā)酵周期(同實(shí)施例1)。在發(fā)酵過(guò)程中，每隔兩個(gè)小時(shí)取樣，測(cè)量樣品在630nm的紫外吸收值，pH值，表面張力以及發(fā)酵液對(duì)柴油的乳化能力。表面張力用上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司的全自動(dòng)界面張力儀，乳化能力測(cè)量方法按照文獻(xiàn)報(bào)道，以各種烴(二甲苯，甲苯，煤油，柴油，原油)為乳化對(duì)象，乳化劑與測(cè)試烴以7:3體積比混合，劇烈震蕩lmin，靜置24h，乳化指數(shù)(Emusificationindex,EI-24)用乳化層的高度與測(cè)試烴的總高度之比，乘以100%來(lái)計(jì)算。如果EI-24大于等于50%，則說(shuō)明乳狀液是穩(wěn)定的。如圖1所示，在菌株生長(zhǎng)到Uh時(shí)，EI-24的值已達(dá)到100%，菌體濃度也最大，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，由于菌體在產(chǎn)生的胞外物質(zhì)作用下聚集，致使OD630的值越來(lái)越不準(zhǔn)確，呈逐漸減小趨勢(shì)，但是EI-24值已穩(wěn)定不變；在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的表面張力逐漸降低，到后期穩(wěn)定，由初始的67.9mN/m降至50.28mN/m;在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，pH幾乎不變。將發(fā)酵液(F)以及離心去菌體的發(fā)酵液(f)，測(cè)量對(duì)二甲苯，甲苯，煤油，柴油，原油的乳化能力。如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4:生物乳化劑的理化性質(zhì)。Geokici//^sp.DM-2菌株產(chǎn)生物乳化劑(同實(shí)施例3)，將該乳化劑溶于雙蒸水中測(cè)試不同濃度該乳化劑對(duì)柴油的乳化，以及該乳化劑在不同NaCl濃度和pH下對(duì)柴油的乳化能力以及對(duì)柴油形成的乳狀液在不同溫度下的穩(wěn)定性。在不同pH條件下，該乳化劑對(duì)柴油的乳化能力均為100%;如圖3-l至圖3-3所示，當(dāng)乳化劑濃度為lg/L時(shí)，對(duì)柴油的乳化能力可達(dá)100%，所以在后續(xù)試驗(yàn)中均采用該濃度；形成的乳狀液在不同溫度下測(cè)試穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在IOO'C水浴中過(guò)夜，仍保持有63.6%的乳化層；該乳化劑可耐受的NaCl濃度為25。/。，比已報(bào)道乳化劑耐受NaCl濃度都要高，更適合于高礦化度的油藏進(jìn)行驅(qū)油。將該乳化活性物質(zhì)溶于雙蒸水中，置于121'C高壓作用30min后，對(duì)柴油仍有100%的乳化活性。實(shí)施例5:生物乳化劑的化學(xué)組成。Geo6"a7/船sp.DM-2菌株產(chǎn)生的生物乳化劑(同實(shí)施例3)進(jìn)行Molish反應(yīng)判定糖類，用Bradford比色法測(cè)定蛋白和油紅O染色，實(shí)驗(yàn)表明該乳化劑含有蛋白質(zhì)和多糖，不含脂類。進(jìn)一步用紙層析法分析該生物乳化劑的組分，糖組分分析取該物質(zhì)5mg加入2MH2S04中，沸水浴10h以上，用BaCCb中和H2S04，離心除去沉淀，得樣品點(diǎn)在新華1號(hào)濾紙上，經(jīng)正丁醇冰乙酸水=4:1:5的展開劑展開，9h后風(fēng)干，噴顯色劑苯胺-磷酸鹽溶液(=a:b=2:3;3=苯胺水冰乙酸磷酸=2:20:18:1;b-丙酮)；再風(fēng)干后，于100'C顯色2-5min;氨基酸組分分析取該物質(zhì)lmg加入6NHC1中，ll(TC水解24h以上，將HC1蒸干后，溶于雙蒸水中，點(diǎn)在新華l號(hào)濾紙上，經(jīng)正戊醇吡啶.-水=35:35:30，9h后風(fēng)干，用10%茚三酮IO(TC顯色10min。分別計(jì)算Rf值，結(jié)果表明，如圖4和5所示，樣品1和2分別是丙酮沉淀和工業(yè)酒精沉淀所得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的Geo^a7/^sp.DM-2菌株所產(chǎn)生的生物乳化劑由多糖和蛋白組成，是一種糖蛋白復(fù)合物。多糖組分僅有一種葡萄糖組成，蛋白組分由賴氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五種氨基酸組成。實(shí)施例6:生物乳化劑對(duì)原油降解率的促進(jìn)和對(duì)原油降粘降凝的促進(jìn)作用。將GeoZ^c///^sp.DM-2菌株在產(chǎn)生物乳化劑的培養(yǎng)基和條件下(同實(shí)施例1)培養(yǎng)發(fā)酵，作為種子液(S)接入降解培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)和降粘，降凝培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成KH2P04，0.3g;Na2HP04'12H20，1.25g,NH4Cl，2.0g;酵母粉，0.5g;原油，300g;地層水，1000ml)，6(TC振蕩培養(yǎng)7天，將作用后的原油脫水，用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)測(cè)量原油的粘度，參照GB/T510測(cè)定原油凝點(diǎn)，采用紅外測(cè)油儀測(cè)量原油降解率。與將Ge0&d//Msp.DM-2菌株在垸烴里培養(yǎng)發(fā)酵的發(fā)酵液作為種子(P)進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。采用產(chǎn)乳化劑的培養(yǎng)基發(fā)酵菌株做為種子液，對(duì)原油的降粘率可達(dá)67.78%，降解率為50.18%，把原油的凝固點(diǎn)由19.5'C降至1(TC，這種種子液遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于用烷烴發(fā)酵菌株所得的種子液，由于蔗糖比垸烴便宜的多，在礦場(chǎng)試驗(yàn)中前者種子液可大大節(jié)約經(jīng)費(fèi)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例7:生物乳化劑對(duì)稠油(試驗(yàn)l號(hào)井原油)的降粘作用將離心分離后的發(fā)酵液上清液(原液)、在12rC處理30分鐘的上清液、絮凝沉淀去除活性成分的上清液分別與等體積的試驗(yàn)l號(hào)井的稠油混合，在50'C、7CTC、IO(TC水浴搖床上振蕩24小時(shí)，將原油脫水，于50'C下測(cè)定原油粘度結(jié)果見表6。從表4可以看出，上清液(原液)含有生物乳化劑，對(duì)該高膠質(zhì)瀝青質(zhì)原油有一定的降粘作用，處理溫度對(duì)降粘效果影響不大；絮凝沉淀去除了活性成分(生物表面活性劑)的上清液，對(duì)原油的降粘作用變得很小甚至完全沒(méi)有降粘作用；在12rC熱處理30分鐘的上清液，對(duì)原油的降粘作用大大加強(qiáng)，這表明該生物乳化劑具有極強(qiáng)的耐高溫性能。表4生物乳化劑在不同溫度下對(duì)試驗(yàn)1號(hào)井原油的降粘作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例8:生物乳化劑的濃度和處理時(shí)間對(duì)稠油(試驗(yàn)l號(hào)井原油)和高含蠟、高含膠質(zhì)瀝青質(zhì)原油的(試驗(yàn)2號(hào)井原油)降粘作用將稀釋成不同生物乳化劑濃度的發(fā)酵液上清液分別與等體積的試驗(yàn)1號(hào)井原油(稠油)和試驗(yàn)2號(hào)井原油(高含蠟、高含膠質(zhì)瀝青質(zhì)原油)混合，在不同溫度的水浴搖床上振蕩24h、48h、72h，將原油脫水，于5(TC下測(cè)定原油粘度，結(jié)果列于表5。表5表明，生物乳化劑可使高膠質(zhì)瀝青質(zhì)原油特別是稠油粘度下降，在同一處理溫度下不同濃度表面活性劑溶液的降粘率相差很大，最高可達(dá)50%左右；處理時(shí)間超過(guò)24h以后降粘率的變化已不顯著。另外，從搖瓶的外觀看，加入該生物表面活性劑的原油對(duì)瓶壁的脫附能力及溶解性增強(qiáng)，在鏡檢時(shí)可觀察到形成水包油乳狀液。這些特性有利于原油的增采和輸送。表5不同生物乳化劑在不同溫度與兩種原油作用不同時(shí)間的降粘效果處理乳化劑處理24h處理48h處理72h原油溫度濃度％粘度降粘率粘度降粘率粘度降粘率°C/mPa.s/%/mPa.s/%/mPa.s/%700.0114707.0138012.7139012.00.03131516.888444.189043.70.06125020.976651.576051.90.09107032.374053.282947.50.12125320.777950.778050.6試驗(yàn)l號(hào)0.15125920.378350.478250.5井*1000.0114508.2139012.0140011.40.0315203.8132716.0133715.40.06腦031.0109031.0108031.60.09127019.6118824.8108831.10.12125020.9114527.5117225.80.15107532.098737.598038.0500.0169.0068.40.867.32.40.0366.53.664.07.266.83.20.0664.26.955.120.157.416.80.0959.513.857.217.155.619.40.1260.412.555.020.354.221.4試驗(yàn)2號(hào)0.1561.510.956.018.857.017.4井**700.0171.11.367.06.967.46.40.0368.94.362.513.260.915.40.0666.65.455.522.955.023.60.0971.01.458.219.258.019.40.1271.12.660.416.159.617.20.1569.93.061.015.360.516.0H式驗(yàn)1號(hào)井原油含蠟14.7%,含膠質(zhì)瀝青質(zhì)27.89%，原始粘度1580mPa.s，粘度均在5(TC用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)2號(hào)轉(zhuǎn)子在750r/min下測(cè)定。**試驗(yàn)2號(hào)井原油含蠟24.5%，含膠質(zhì)瀝青質(zhì)24.84%，原始粘度69.0mPa.s(處理溫度5(TC實(shí)驗(yàn)組)和72.0mPa.s(處理溫度7(TC實(shí)驗(yàn)組)，粘度均在50'C用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)1號(hào)轉(zhuǎn)子在750r/min下測(cè)定。實(shí)施例9:生物乳化劑對(duì)原油分散性及凝固點(diǎn)的影響按實(shí)施例8所述處理方法將發(fā)酵液上清液與試驗(yàn)1號(hào)井、試驗(yàn)2號(hào)井原油按1:1體積比混合，在5(TC、7(TC水浴搖床上振蕩24h，觀察原油分散情況，同時(shí)用蒸餾水作為對(duì)照介質(zhì)，結(jié)果列于表6。表6中還列出了分散處理后回收原油的凝固點(diǎn)測(cè)定值。生物乳化劑對(duì)兩種高含蠟原油的作用是將原油乳化、分散，但不改變其凝固點(diǎn)，即起物理化學(xué)作用，而非化學(xué)作用(降解反應(yīng))。表6生物乳化劑對(duì)兩種原油分散性和凝固點(diǎn)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*"一"代表不分散，"+"代表分散，"+"號(hào)越多，分散程度越大。試驗(yàn)l號(hào)井原油含蠟37.44%，含膠質(zhì)瀝青質(zhì)4.73%;試驗(yàn)2號(hào)井原油含蠟24.5%,含膠質(zhì)瀝青質(zhì)24.84%實(shí)施例10:本發(fā)明提供的生物乳化劑在試驗(yàn)1號(hào)井的采油現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。將一定生物乳化劑的量加入注入井中—關(guān)井(吞吐井)或注水(驅(qū)油井)數(shù)天—提高采出井油產(chǎn)量。生物乳化劑注入油井后油產(chǎn)量變化曲線見圖6，由圖可知該井日均增產(chǎn)2.5噸以上，有效期80天，共增產(chǎn)原油239噸。權(quán)利要求1、一種嗜熱地芽孢桿菌Geobacillus.spDM-2保藏號(hào)CGMCCNo.1565產(chǎn)生的新型糖蛋白類生物乳化劑。2、如權(quán)利要求1所述的生物乳化劑，其特征在于該生物乳化劑僅含有蛋白質(zhì)和多糖；多糖組分僅有一種葡萄糖組成，蛋白組分由賴氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸和甘氨酸五種氨基酸組成。3、如權(quán)利要求2所述的生物乳化劑，其特征在于乳化劑的性質(zhì)測(cè)定方法用Molish反應(yīng)判定糖類，用Bradford比色法測(cè)定蛋白，油紅O染色測(cè)定脂類。4、如權(quán)利要求2所述的生物乳化劑，其特征在于乳化劑多糖組分組成的分析方法是，取該物質(zhì)5mg加入2MH2S04中，沸水浴10h以上，用BaC03中和H2S04，離心除去沉淀，得水解后樣品與單糖標(biāo)準(zhǔn)品在新華1號(hào)濾紙上經(jīng)正丁醇冰乙酸水=4:1:5的展開劑展開，9h后風(fēng)干，噴顯色劑苯胺-磷酸鹽溶液；再風(fēng)干后，于100℃顯色2-5min，計(jì)算樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值；其中顯色劑苯胺-磷酸鹽溶液是由苯胺-磷酸溶液與丙酮按2:3混配而成，苯胺-磷酸溶液是由苯胺水冰乙酸磷酸=2:20:18:1混配而成。5、如權(quán)利要求2所述的生物乳化劑，其特征在于乳化劑蛋白組分氨基酸組成的分析方法是，取該物質(zhì)lmg加入6NHCl中，ll0℃水解24h以上，將HC1蒸干后，溶于雙蒸水中，得水解后樣品與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品在新華1號(hào)濾紙上經(jīng)正戊醇吡啶水=35:35:30的展開劑展開，9h后風(fēng)干，用10%茚三酮100℃顯色10min，計(jì)算樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值。6、一種權(quán)利要求1所述的生物乳化劑的制備方法，其特征在于在培養(yǎng)嗜熱地芽孢桿菌Geobacillussp.DM-2的過(guò)程中，向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加碳水化合物，即淀粉、乳糖、蔗糖或葡萄糖為碳源，其培養(yǎng)基組成如下g/L:K2HP(V3H204.8;KH2P041.5;(NH4)2S04l;擰檬酸三鈉0.5;MgSO4'7H2O0.2;葡萄糖2;酵母提取物0.1;CaClr2H2O0.002;MnCl2'4H200.0004;NiCl2'6H200.0004;ZnS04'7H200.0004;FeCl3'6H200.0002;NaMo04'2H200.0002;培養(yǎng)條件5070℃，pH68，培養(yǎng)2448小時(shí)，以丙酮沉淀透析法和酸沉法分離乳化劑，最后得到生物乳化劑。7、如權(quán)利要求6所述的生物乳化劑的制備方法，其特征在于生物乳化劑的分離提取方法是，將權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)發(fā)酵液8000rpm4℃:離心除去菌體后，加入3倍體積冰冷丙酮或者工業(yè)酒精，用玻璃棒攪拌均勻，置于4℃過(guò)夜，離心得沉淀，用2000ml無(wú)菌水回溶，4℃透析，然后冷凍干燥，得乳化活性物質(zhì)。8、如權(quán)利要求l所述的生物乳化劑，其特征是其能很好的乳化柴油、煤油、正垸烴、原油和芳香族化合物。9、一種權(quán)利要求1所述的生物乳化劑在提高垸烴和原油在水中的溶解度，促進(jìn)解烴菌活性菌株對(duì)烷烴攝取和原油降解的效率，以及提高石油采收率中的應(yīng)用。全文摘要嗜熱地芽孢桿菌DM-2產(chǎn)生的生物乳化劑及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及的地芽孢桿菌Geobacillus.spDM-2保藏號(hào)CGMCCNo.1565菌株，以糖為碳源在50～70℃高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可產(chǎn)生一種新型的糖蛋白類的生物乳化劑；該乳化劑對(duì)柴油，煤油，原油和芳香族化合物都具有很好的乳化效果，能夠提高烷烴和原油在水中的溶解度，明顯促進(jìn)活性菌株對(duì)烷烴和原油的降解，可以應(yīng)用在提高石油采收率技術(shù)中。文檔編號(hào)C12N1/20GK101173233SQ20071006132公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2007年9月30日優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日發(fā)明者靜劉,劉如林,劉清坤,梁鳳來(lái),君王,挺馬申請(qǐng)人:南開大學(xué)