專利名稱：固定化酶催化合成egcg脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，特別是在非水相體系中用固定化微生物脂肪酶催化反應(yīng)合成EGCG脂肪酸酯的方法，屬于酶催化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
綠茶中的茶多酚因具有極強的自由基清除能力和抗氧化活性，在食品、化妝品等工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，是一種不可多得的天然抗氧化劑。同時，茶多酚具有防癌抗癌、抗衰老、抗輻射、降血糖、血脂等重要的生理藥理功能。茶多酚及其衍生物的開發(fā)利用在國內(nèi)外引起了極大關(guān)注，多篇文獻和發(fā)明專利公開了其作為抗氧化劑、抗癌、抗病毒藥物的應(yīng)用。茶多酚中大部分為兒茶素，其中以表沒食子兒茶素-3-6-沒食子酸酯(EGCG)的含量為最高。然而，茶多酚較差的脂溶性使其應(yīng)用的范圍受到限制。通過改性的方式改變其溶解性、增強穩(wěn)定性可以有效提高其應(yīng)用面。改性方式可歸類為溶劑法、乳化法和分子修飾法。大量的研究和應(yīng)用實踐表明溶劑法和乳化法存在很多的缺陷，如溶劑揮發(fā)、溶劑安全、穩(wěn)定性差的等。最直接有效的辦法是分子修飾法，就是在這些化合物中增加如脂肪酸或甘油酯等的親油部分，這樣可以顯著調(diào)節(jié)這些水溶性天然化合物的脂相溶解度，而且其產(chǎn)品也可以直接水解做進一步代謝，其生物生理活性不受影響，而且可以引入有效的營養(yǎng)成分(如多不飽和脂肪酸)。
國內(nèi)外已經(jīng)有化學(xué)法改性茶多酚兒茶素的研究。如《精細化工》，19(2)，2002，通過茶多酚與脂肪酰氯反應(yīng)，制備了一系列含不同直鏈脂肪基團的脂溶性茶多酚。表明當(dāng)脂肪鏈的碳原于數(shù)＞10時，脂溶性茶多酚在色拉油中的溶解度是茶多酚的2000倍以上。專利CN1197786A和CN1263083A報道的將水溶性茶多酚改性成脂溶性茶多酚，但由于反應(yīng)過程中的強酸性環(huán)境，無法控制諸如“紅粉”的縮合物生成，因而影響產(chǎn)品的抗氧化效果。專利CN1448395A報道采用碳酸氫鈉、碳酸氫鉀以及金屬催化劑，降低反應(yīng)溫度等方式解決以上的問題。但化學(xué)合成普遍采用高溫、強氧化劑、強活性化學(xué)催化劑和化學(xué)試劑，例如以上的方法使用的脂肪酸酰氯性質(zhì)不穩(wěn)定，制備條件嚴苛復(fù)雜。特別是對產(chǎn)品的質(zhì)量不利，得率低，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反應(yīng)的選擇性不高，產(chǎn)物單體分離困難，生物生理活性可能喪失，甚至有毒害產(chǎn)品形成。
近20年來，非水相酶促合成有了長足的發(fā)展，酶不僅可以應(yīng)用于水解，在非水相中也可以用于合成。酶法合成比化學(xué)法的專一性強，產(chǎn)物定向。而且酶的價格也隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展而顯著下降，使工業(yè)應(yīng)用不僅從量產(chǎn)而且從經(jīng)濟方面都成為可能。
脂肪酶，是一類特殊的?；饷福茉谟?水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)拆分等有機合成反應(yīng)。根據(jù)脂肪酶的催化機理第一步中，脂肪酶和?；孜镄纬梢粋€中間復(fù)合物；第二步，親核試劑(醇、水、胺類等)進攻中間復(fù)合物的?；迹纬僧a(chǎn)物，同時作為催化劑的酶重新釋放出來。
脂肪酶催化酯合成的研究多集中在直鏈醇和直鏈酸之間的反應(yīng)，反應(yīng)較易發(fā)生。而對于本專利的目標物EGCG來說，由于其獨特的酚羥基結(jié)構(gòu)和三個苯環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，在攻擊中間復(fù)合物的過程中，很難形成酰基碳。?；孜锏倪x擇是一個難點，要保證中間復(fù)合物有較強的反應(yīng)活性。
另外EGCG具有極強的水溶性，在與脂溶性較強的油脂反應(yīng)時，溶劑的選擇也是一個難以平衡的矛盾。脂肪酶非水相催化選擇的溶劑常用依據(jù)，即常選擇的弱極性類溶劑不適合這一特定目標的反應(yīng)。不同極性溶劑的選擇影響著底物的傳質(zhì)。
酶的存在形式也影響著反應(yīng)的發(fā)生和催化特性。由于游離酶對環(huán)境十分敏感，目前酶催化反應(yīng)常使用固定化形式酶。但不同形式的固定化商業(yè)脂肪酶不僅影響著酶活力和底物的傳質(zhì)，最終影響著反應(yīng)的發(fā)生和轉(zhuǎn)化率的高低。
天然酚型或酸型生物活性化合物的酶促合成報道不多，對EGCG的酶促改性還未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了化學(xué)催化劑合成EGCG酯方法的缺點，提供了一種在非水相體系中用固定化微生物脂肪酶催化反應(yīng)合成EGCG脂肪酸酯的方法。
本發(fā)明采用反應(yīng)活性較高的脂肪酸乙烯酯作為酰基供體，解決了脂肪酶催化EGCG酚羥基反應(yīng)困難的問題。本發(fā)明選擇極性較強的溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，增大了底物的溶解度，利于反應(yīng)物之間的傳質(zhì)，加快了反應(yīng)的歷程，且反應(yīng)溶劑無毒性。本發(fā)明采用了新型的固定化脂肪酶，較之于多數(shù)的商業(yè)化脂肪酶更利于反應(yīng)的轉(zhuǎn)化，提高了反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。該方法的選擇性好，反應(yīng)溫和，產(chǎn)品基本上為單取代產(chǎn)物，產(chǎn)品質(zhì)量好，分離純化簡單。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步驟依次進行以天然兒茶素EGCG單體和含2-18個碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，EGCG與脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩爾比為1∶1~10，與有機溶劑和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5-5倍，在30-50℃的條件下，反應(yīng)36-200小時，取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、樹脂或紡織品膜為載體，載體上有酵母類脂肪酶。所得的EGCG脂肪酸酯產(chǎn)物為白色或棕黃色粉狀的固體。
所述的脂肪酸和脂肪酸乙烯酯為乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕擱酸、硬脂酸、油酸、乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕擱酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。
所述的酵母類脂肪酶為解酯假絲酵母脂肪酶或南極甲絲酵母脂肪酶。
所述的紡織品膜為綿、尼龍、絲綢、聚酯或纖維素的紡織布。
所述的反應(yīng)媒體有機溶劑為乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、甲基異丁基酮中的一種或其組合。
所述的反應(yīng)介質(zhì)有機溶劑為乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮等極性較強溶劑中的任一種。有機溶劑的加入量保證溶解EGCG單體即可，沒有嚴格的要求。
本發(fā)明的EGCG脂肪酸酯組成為表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-5-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-7-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-4’，7-O-二脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-4’，5-O-二脂肪酸酯、表沒食于兒茶素-3-O-沒食子酸-3’(5’)，7-O-二脂肪酸酯、表沒食于兒茶素-3-O-沒食子酸-3’(5’)，5 O-二脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-5，7-O-二脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-3’(5’)，4’-O-二脂肪酸酯等化合物中的任一種或任意種以任意比例組合。主要組成成分為表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-5-O-脂肪酸酯、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸-7-O-脂肪酸酯等幾種單取代產(chǎn)物。
本發(fā)明的固定化脂肪酶的制備方法是用酵母類脂肪酶的水溶液按1000-30000單位/克活化載體與活化載體浸泡、混合、室溫晾干，制得酶活為6000-8000IU/g的固定化脂肪酶。
本發(fā)明制備的EGCG乙酸酯，油脂過氧化值試驗表明，EGCG乙酸酯應(yīng)用于食用植物油中，其添加量為100-200ppm，抗氧因子高，其抗氧化活性比BHA、BHT更強(參見圖1)。過氧化值按照GB/5538-2005/ISO 39602001的方法測定。
本發(fā)明可應(yīng)用在包括醫(yī)藥、化妝品、食品以及飼料等領(lǐng)域，也適用于其他各種作為抗氧化劑添加使用的場合。本發(fā)明采用了新型的固定化脂肪酶，使用無毒性的反應(yīng)溶劑，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，固定化脂肪酶和反應(yīng)溶劑都容易回收重復(fù)使用，有利于連續(xù)化生產(chǎn)。該反應(yīng)的選擇性好，產(chǎn)品單取代產(chǎn)物比率高(參見圖4)。產(chǎn)品質(zhì)量好，分離純化簡單。其分子結(jié)構(gòu)測定結(jié)果顯示仍維持兒茶素EGCG的結(jié)構(gòu)特性(如圖2，3)，具有較好的穩(wěn)定性。


圖1EGCG乙酸酯抗氧化效果與幾種抗氧化劑的比較圖2EGCG的1H-NMR表征圖3EGCG乙酸酯的1H-NMR表征圖4EGCG乙酸酯的LC-MS聯(lián)用紫外和MS檢測圖具體實施方式
實施例1取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶0.5g，在溫度30℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)120小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為20％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.24g。
實施例2取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶1g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約120小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為25％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.30g。
實施例3取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml四氫呋喃中，加入固定化脂肪酶2.0g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)120小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為30％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.35g。
實施例4取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約120小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為35％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.41g。
實施例5取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)約90小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為35％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯0.41g。
實施例6取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.94g(10.9mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度40℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)80小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為99％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯1.30g。
實施例7取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯1.88g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)36小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為99％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到棕黃色粉狀EGCG乙酸酯1.38g。
實施例8取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，辛酸乙烯酯3.71g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)150小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為85％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到白色粉狀EGCG辛酸酯1.18g。
實施例9取EGCG單體1.00g(2.18mmol)，月桂酸乙烯酯4.93g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在溫度50℃的條件下，搖床中(180r/min)，反應(yīng)200小時，EGCG轉(zhuǎn)化率為80％；取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到白色粉狀EGCG月桂酸酯1.40g。
以上對本發(fā)明所提供的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法進行了詳細介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式
及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步驟組成以兒茶素EGCG單體和含2-18個碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，EGCG與脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩爾比為1∶1～10，與有機溶劑和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5-5倍，在30-50℃的條件下，反應(yīng)36-200小時，取出固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、樹脂或紡織品膜為載體，載體上有酶活為6000-8000IU/g酵母類脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸為乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕擱酸、硬脂酸或油酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕擱酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的酵母類脂肪酶為解酯假絲酵母脂肪酶或南極甲絲酵母脂肪酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的紡織品膜為棉、尼龍、絲綢、聚酯或纖維素的紡織布。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的有機溶劑為乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丙基酮、甲基異丁基酮中的一種或其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于所述的有機溶劑為乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮的任一種。
全文摘要
一種固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法屬于酶催化領(lǐng)域。該方法采用以兒茶素EGCG單體和含2－18個碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯為原料，按摩爾比為1∶1－10，與篩選的有機溶劑和固定化脂肪酶混合，酶的用量是EGCG質(zhì)量的0.5－3倍，在30－50℃的條件下，反應(yīng)36－200小時。取出催化劑，反應(yīng)液經(jīng)過濾、減壓濃縮、脫溶劑干燥等步驟得到EGCG脂肪酸酯。本發(fā)明使用固定化脂肪酶，具有選擇性好，反應(yīng)溫和的特點。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)溶劑無毒性。得到的脂溶性EGCG脂肪酸酯組分明確，單取代產(chǎn)物含量高，抗氧化品質(zhì)好，其分子結(jié)構(gòu)維持兒茶素EGCG的結(jié)構(gòu)特征，具有較好的穩(wěn)定性。
文檔編號C12R1/72GK101086000SQ20071006541
公開日2007年12月12日 申請日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者王芳, 馬習(xí)東, 譚天偉, 鄧利, 聶開立 申請人:北京化工大學(xué)