專利名稱：食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因及應(yīng)用，屬于生 物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲具有地域分布廣泛、宿主種類多樣等特征，并容易使已發(fā)生線蟲病害 的植物繼發(fā)真菌或細(xì)菌感染，從而給農(nóng)作物、林木和食用菌帶來很大的危害。而我們現(xiàn) 今所依賴的化學(xué)防治，由于對環(huán)境的破壞以及對人畜安全性的影響，其使用正逐步受到 限制，因此生物防治病原線蟲的需要日漸彰顯。在線蟲侵染過程中，無論是對于蟲體本 身還是線蟲蟲卵來說，其覆蓋于表面的體壁或卵殼都是線蟲防止侵染的重要保護(hù)結(jié)構(gòu)， 而蛋白酶能有效地降解線蟲體壁，協(xié)助殺線蟲生物完成侵染過程，是線蟲侵染的重要毒 力因子，但至今從殺線蟲細(xì)菌中獲得的可降解線蟲體壁的蛋白酶基因屈指可數(shù)。因此在 食線蟲細(xì)菌的研究中，對新的可降解線蟲體壁的蛋白酶基因進(jìn)行克隆和功能研究，不僅 可以完善食線蟲細(xì)菌侵染線蟲的分子機(jī)理，并可促進(jìn)線蟲生防研究向基因工程方向發(fā) 展，為線蟲生防菌的遺傳改良及將侵染性蛋白酶基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物構(gòu)建培育出抗性品種奠 定重要基礎(chǔ)。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因及 應(yīng)用。
本發(fā)明人在開展殺線蟲細(xì)菌研究中，獲得一株對線蟲具有強(qiáng)侵染作用的食線蟲細(xì)菌 新種fecj'""s /7,t。c她s B16， fe"77ws "簡t。c油s B16保藏在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2004年4月5日；
保藏號CGMCC No. 1128。發(fā)明人從該菌中分離、純化到一個具有降解線蟲體壁功能的 胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶。
本發(fā)明是在前期工作基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)簡并引物，成功地克隆了該胞外侵染性堿性 絲氨酸蛋白酶的編碼基因并提交GenBank，序列號為AY708655。該基因開放性閱讀框 架全長1146 bp DNA序列，共編碼382個氨基酸殘基。其中包括30個氨基酸殘基的信 號肽，77個氨基酸殘基的前肽，275個氨基酸殘基的成熟肽。
本發(fā)明利用pET30載體系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，重組蛋白大部分是以包
涵體形式存在，經(jīng)過鎳離子親和層析柱純化得到重組蛋白，經(jīng)過復(fù)性后其活性達(dá)到原來 的60.82%。異源表達(dá)的重組蛋白酶與來自野生型的蛋白酶具有相似的生化特性PMSF
能夠完全抑制蛋白酶的活性，均能水解寬范圍的底物包括干酪素、膠原和線蟲體壁。將
純化得到的重組蛋白酶作用于受試活體線蟲尸a"a《re^t/s re^Vi"s，作用60小時后， 觀察到90%以上的線蟲死亡，且大多數(shù)死亡線蟲體壁降解；而用作陰性對照的磷酸鹽緩 沖溶液PBS處理受試線蟲相同時間后，線蟲死亡率在10%以下。同時利用該重組蛋白酶 處理純化的線蟲體壁，在解剖顯微鏡下觀察到被該蛋白酶降解產(chǎn)生的大量不完整的線蟲 體壁碎片。
本發(fā)明利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建該堿性絲氨酸蛋白酶的基因敲除突變株。對該突變 株進(jìn)行殺線蟲活性測試，發(fā)現(xiàn)突變株的蛋白酶活性明顯降低，同時也喪失了大部分的殺 線蟲活性。
本發(fā)明通過分析驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明了來源于殺線蟲芽胞桿菌的堿性絲氨酸蛋白酶基因 具有降解線蟲體壁的功能和殺線蟲活性。所以，該基因可以用來研究蛋白酶在侵染線蟲 過程中的生化本質(zhì)，并作為獲得高效生防菌株的靶基因。
本發(fā)明具有安全性高、環(huán)境無污染、殺蟲效佳等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因在大腸桿菌BL21中異源表達(dá)后 進(jìn)行SDS-PAGE電泳。泳道1、 3代表具有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株用IPTG誘導(dǎo)4 小時；泳道2、 4代表未用IPTG誘導(dǎo)的陰性對照；M泳道代表蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2 :a為從食線蟲芽胞桿菌中純化的堿性絲氨酸蛋白酶處理線蟲尸.re力'Wn/560 hr 對線蟲體壁的作用。 ' b為本發(fā)明中的胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因在大腸桿菌BL21中異源表達(dá) 產(chǎn)物處理線蟲尸.re力'w'ra560 hr對線蟲體壁的作用。
c為本發(fā)明中胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因敲除突變株的粗酶液處理線蟲
尸.rerf/w'ra660 hr對線蟲體壁的作用。 d為陰性對照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶的基因克隆 1、引物設(shè)計(jì)
將從食線蟲芽胞桿菌中純化得到的電泳純的堿性絲氨酸蛋白酶經(jīng)過電轉(zhuǎn)移到 PVDF膜后，送中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行N-末端氨基酸檢測，測序結(jié)果 為AQSVPYGVSQ。將N-末端氨基酸檢測結(jié)果在NCBI上進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)它和來源于淀粉液 化芽孢桿菌及a忍WWi(^e/a"'e/^的堿性絲氨酸蛋白酶subtilisinBPN， (ID: P00782) 具有很高的同源性。根據(jù)蛋白質(zhì)同源性比對結(jié)果設(shè)計(jì)簡并引物
GGAGAGGATAAAGAGTGAGAGGCAAA和CTGAGCTGCCGCCTGTACGT用于目標(biāo)蛋白酶基因的擴(kuò)增。
2、 基因克隆
以提取食線蟲芽胞桿菌的基因組DNA為模板，以上設(shè)計(jì)的簡并引物為PC財(cái)廣增引 物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆目的基因。PCR反應(yīng)條件為95"C變性1 min ， 55 。C退火l min , 72 。C延伸1.5min,共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 t保溫10 min。 PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)基因 序列并切膠回收。將回收后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化￡ c^i DH 5a感受態(tài)細(xì)胞，然后對含有胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因的重組子進(jìn)行藍(lán)白斑 篩選。
3、 粒測序及序列分析
測序結(jié)果用看圖軟件Chromas校讀、經(jīng)初步分析排除錯誤堿基。 序列分析顯示，測序的目標(biāo)重組子含有一個U63bp的插入序列，其中侵染性堿 性絲氨酸蛋白酶基因的開放性閱讀框架長1146bp,編碼一個382個氨基酸殘基的蛋白 質(zhì)，包括30個氨基酸殘基的信號肽(編碼序列為15-104bp) , 77個氨基酸殘基的前肽
(編碼序列為105-335bp) ， 275個氨基酸殘基的成熟肽(編碼序列為336-1160bp)。 而N末端測序結(jié)果與成熟肽的前10個氨基酸，即108-118位吻合。將該基因登記 GeneBank，接受號為AY708655。同時，將側(cè)胞短芽孢桿菌侵染性絲氨酸蛋白酶基因推導(dǎo) 得到的氨基酸序列進(jìn)一步進(jìn)行同源性分析，揭示該蛋白酶與源于芽孢桿菌屬的絲氨酸蛋 白酶具有69%-97%的一致性，且它具有絲氨酸蛋白酶所特有的A印32，His64, Ser幼催化三 聯(lián)中心，從而確證了目標(biāo)蛋白酶所屬種類。
實(shí)施例二胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶的異源表達(dá)
I) 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)目的堿性絲氨酸蛋白酶基因設(shè)計(jì)上下游分別含有yVcoI和屈oI的一對引物
5' -CCATGGGCCGCTGCAACCGGAACA G-3， ； 5， -C T C G A GCAATCCAACTGCATTCCAGG C-3， ， PCR后將擴(kuò)增得到的DNA片 段進(jìn)行回收、酶切，并與大腸桿菌表達(dá)載體pET30a連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5ci，篩選得到堿性絲氨酸蛋白酶的表達(dá)重組質(zhì)粒。
II) 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE:
1、 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21,以含質(zhì)粒/ ET30a的BL21為對照菌株作誘導(dǎo) 表達(dá)。
2、 挑取轉(zhuǎn)化菌落接種到2 ml含50 wg/ml kanamycin的LB培養(yǎng)基中，37 。C下培 養(yǎng)14 16 h。
3、 5 %的接種量接至新鮮的相同培養(yǎng)基中，至6^。。為0.5 0. 7時加入i mmo1/ L 的異丙基硫代-e-&半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4 h。
有pET30a的對照菌株無目的蛋白的表達(dá)(見圖l)。
III) 包涵體的分離和純化
1. 將離心收集的菌體用50 mmol/L的Tris-HC1緩沖液(pH7. 5)洗滌2次。
2. 將菌體懸浮于溶液A (50 mrao1/L Tris-HC1， 20隱o1/L DTT， lmmol/L EDTA， pH7. 5)中，冰浴超聲破碎15 min， 10 000 rtm離心15 min收集沉淀。
3. 用溶液B (2 mo1/L尿素，1% TritonX-100， 50畫1/L Tris-HCl， 20畫1/L DTT， 1隱o1/ L EDTA， pH7. 5)洗滌包涵體2次。
4. 將包涵體在變性緩沖液(8 mo1/ L尿素'50 mmo1/ L Tris-HCl， 20鵬o1/ L DTT， pH8.0)中室溫溶解2 h，離心后將上清液通過0.2um的纖維素濾膜除去 不溶物。
5. 將樣品上l mL的Ni-NTA親合柱，用p朋.3的變性緩沖液洗滌2次，共計(jì)10個柱 體積后，用pH4.5的變性緩沖液洗脫。
6. 分別收集洗滌液和洗脫液做SDS-PAGE電泳。
IV) 純化產(chǎn)物的復(fù)性
1. 將上述純化得到的純化酶液分別調(diào)節(jié)pH為4.0、 6.0和9.0，用變性緩沖液調(diào)蛋 白濃度為2 mg/ mL。
2. 用復(fù)性緩沖液(50隱o1/ L甘氨酸，2鵬o1/ L DTT， 10 %甘油，150 mmo1/ L NaCl， 50畫1/ L H3P04， 3畫1/ L GSH， 0.3 mmo1/ L GSSG)稀釋50倍。
3. 靜置12h后，將pH為4.0和9.0的復(fù)性液調(diào)為pH6.0，然后測活性。為避免在稀 釋過程中產(chǎn)生大量沉淀而影響復(fù)性效果，上述操作均應(yīng)在低溫(〈5'C)下進(jìn)行。
實(shí)施例三侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因敲除突變株的構(gòu)建
1、 將重組表達(dá)的質(zhì)粒用C7al和尸"I雙酶切后得到295bp的片段，將其與同樣雙 酶切的整合載體pCP115連接。
2、 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，通過菌落PCR擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證篩選陽性轉(zhuǎn) 化子。
3、 制備殺線蟲芽孢桿菌的感受態(tài)并將上述陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入該感受態(tài)細(xì)胞中取受 體菌接種于BY培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)到對數(shù)生長早中期。此時OD620應(yīng)在0. 4左右，培 養(yǎng)時間約為4 5小時。將培養(yǎng)后的菌液離心，棄去上清液，再用生長培養(yǎng)基(GM液) 洗菌一次，然后將菌體細(xì)胞重新懸浮在與BY培養(yǎng)液等體積的GM液中。37'C繼續(xù)振蕩培 養(yǎng)到對數(shù)生長后期。此時0D620應(yīng)在0. 6 0. 9,培養(yǎng)時間約為3 5小時。以1:10的比 例將GM液中培養(yǎng)的菌液稀釋于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(TM液)中。即取菌液0. 2ml加入1. 8nilTM 液中，在20X 150mm的試管中，37。C振蕩培養(yǎng)90分鐘。加入供體質(zhì)粒，至最終濃度lug/ml ， 于20X150,的試管中，37'C振蕩培養(yǎng)30分鐘。取200ul涂布抗性選擇平板，37。C培 養(yǎng)48小時。
4、 Southern blot和PCR驗(yàn)證突變株的構(gòu)建。實(shí)施例四堿性絲氨酸蛋白酶的酶活及殺線蟲活性測定
I )蛋白酶活性測定
1、 取125ul的待測酶液與125 u 1 10. 5%的Casein混合，置于37 。C水浴中孵育 20 rain。
2、 被降解的底物用250 u 1的10%的TCA(三氯醋酸)來沉淀，并12000rpm 5min離心。
3、 取500yl的上清與2. 5ml的Na2C03、 500pl的福林酚試劑混合，3CTC水浴 15min。
4、 于680nm下測定該混合物的吸收光值。
5、 對照組通過酶液與底物不經(jīng)水浴直接用TCA沉淀獲得。 II)殺線蟲活性測定
取無菌的1.5mlEppendorf管中加入150 yl待測酶溶液，再加入一定數(shù)量(50-60 條)用無菌水洗滌干凈的線蟲，26 'C孵化12-60小時，隔一定時間用顯微鏡觀察線蟲 體壁的分解和線蟲的死亡情況(見附表)。對照分別用50 mM的磷酸鹽緩沖液和加熱失 活的粗酶樣品。此外，將待測蛋白酶液加入純化的線蟲體壁中，每12hr用光學(xué)顯微鏡 觀察線蟲體壁變化(見圖2)，由此再次確定其蛋白酶降解線蟲體壁的功能。
附表野生菌株、表達(dá)菌株及突變菌株的蛋白粗酶液對活體線蟲尸.re^Wras的毒殺作用
粗酶液樣品來源線蟲死亡率％ (SD)
12小時24小時36小時48小時60小時
野生型菌株60(4. 5)80(2. 4)90(2.6)95 (2.6)100(0. 0)
表達(dá)菌株40(5, 0)55(4. 3)70(2. 8)85(3. 5)90(3.0)
突變菌株25(3. 6)35(2. 2)40(2.8)45(1.9)45(2.5)
PBS5(0. 3)5(0. 5)5(0. 9)10(0. 2)10(0. 3)
上述的研究結(jié)果表明，我們在本發(fā)明中所獲的目標(biāo)基因編碼一個可降解線蟲體壁、 具有殺線蟲活性的胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶，該基因的異源表達(dá)產(chǎn)物能使線蟲在
60hr后死亡率達(dá)90%,且線蟲體壁被顯著降解；將該基因敲除后突變株則喪失了大部分 的殺線蟲活性。與此同時，由于該目標(biāo)基因來自于容易培養(yǎng)，繁殖快的細(xì)菌，所以該胞 外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因能用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并可 作為獲得高效生防菌株的靶基因。
堿性絲氨酸蛋白酶序列.txt SEQUENCE LISTING
<110〉 云南大學(xué)
<120〉食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因及應(yīng)用
〈130〉 1
<160> 1
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 1163
〈212〉 DNA
<213〉 Bacillus neraatocida <220〉
〈221〉開放性閱讀框架
<222〉 (15). . (1160) <223>
〈220>
〈221〉信號肽
<222〉 (15).. (104) <223〉
<220〉
〈221 >前肽
<222〉 (105).. (335)
〈223>
〈220〉
〈221〉成熟肽
〈222〉 (336).. (1160)
〈223〉
<300〉
堿性絲氨酸蛋白酶序列.txt
<308> GenBank/AY708655 <309〉 2004-10-20 <313> (15)..(1160)
〈400> 1 gg卿ggataggcaaaaaggtttgctgtttgcttt3gcgt60
taatctttacgatggcgttcggcagcacgtctcctgcccaggcggc鄉(xiāng)gaaatcaaacg120
ggg犯肌g朋atacattgtcggatttaaacagacastgagcacgatg站cgccgctaaga180
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cggttatcgacagcggtatcgattcttctcatcctgattta犯ggtagcaggcggagcca480
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ctxtttacgctgtaaaagttctcggcgctgacggttccggccagtacagctggatcatta660
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cttctggttctgcagcgttaaaagcggc服ttgacaaagccgttgcttccggcatcgUg780
tcgtsgcggcagccggteieicgaaggcacttccggcagctxggctaccctg840
gt犯atacccttctgtcattgcggtaggggcag"ttaacagcagc^cca^aagagcatctt900
tctcaagcgtaggttctgagcttgatgtcatggcaccaggcgtctctatccaaagcacgc960
ttcctggaaacaaatacggcgcgtacaatggtacgtcaatggcatctccgcacgttgccg1020
gagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacgtccgcagcaL080
gtttagaa犯aaacttggtgatgctttctactacggaaaagggctgatca1140
acgtacaggcggcagctcag116權(quán)利要求
1、一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因，其特征在于該基因含有一個1146bp的開放性閱讀框架，編碼一個382個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中包括30個氨基酸殘基的信號肽，77個氨基酸殘基的前肽，275個氨基酸殘基的成熟肽。
2、 權(quán)利要求1所述食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因的應(yīng)用，其 特征在于該基因能用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并可作為獲得高效生 防菌株的耙基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食線蟲芽孢桿菌胞外侵染性堿性絲氨酸蛋白酶基因及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該基因是從食線蟲芽孢桿菌中克隆得到，其開放性閱讀框架長1146bp，編碼一個382個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中包括30個氨基酸殘基的信號肽，77個氨基酸殘基的前肽，275個氨基酸殘基的成熟肽。該基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)的重組蛋白能降解線蟲體壁、并有殺線蟲活性；而其基因敲除突變株表明蛋白酶活性降低、且喪失大部分的殺線蟲活性。該堿性絲氨酸蛋白酶基因是食線蟲芽孢桿菌侵染線蟲過程中的一個重要的毒性因子。該基因能用來研究蛋白酶在侵染線蟲過程中的生化本質(zhì)，并可作為獲得高效生防菌株的靶基因。本發(fā)明具有安全性高、環(huán)境無污染、殺蟲效佳等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N9/52GK101096679SQ20071006591
公開日2008年1月2日 申請日期2007年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者張克勤, 牛秋紅, 黃曉瑋 申請人:云南大學(xué)