專利名稱：一種動物細胞的超低溫保存溶液及保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物保存技術(shù)，特別地，涉及一種動物細胞的超低溫保存溶液及保存方法。
背景技術(shù)：
在低于-80℃的超低溫狀態(tài)下，各種細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢甚或終止，利用這一原理，將細胞置于-196℃以下，使其生命活動“固定”而非死亡，需要時以適當?shù)姆椒ń鈨?，恢?fù)其活性的方法即為細胞的超低溫保存。
凍存過程中引起細胞損傷或死亡的情況很多，其對細胞造成的傷害主要有以下幾個方面1)細胞膜流動性減小，細胞膜僵化將導(dǎo)致細胞的進一步損傷；2)在復(fù)溫過程中產(chǎn)生氧自由基；3)導(dǎo)致細胞壞死和凋亡。
但是至今為止，除少數(shù)幾種細胞以外，超低溫的保存技術(shù)還不成熟，而且很難形成一套統(tǒng)一的方案?？梢姡蜏乇４嬉旱某煞稚行枰M一步的改良與優(yōu)化。這對于采用離體細胞通過體外組裝成的人工器官尤其重要。且有望用于化妝品和藥品臨床前的體外安全性檢測等。因此，本專利針對超低溫保存引起的細胞損傷現(xiàn)象，改良超低溫保存液成分，提高超低溫保存效果。
隨著中藥現(xiàn)代化，中藥有效成分具有抑制細胞凋亡、穩(wěn)定細胞膜和清除自由基等保護功能，可以通過各自機制保護細胞免于超低溫狀態(tài)下的細胞受損。以下是文獻所報道的部分中藥有效成分的一些具體作用。甘草酸[1]對細胞有抑制凋亡、清除氧自由基的功效，苦參堿在0.2～10mg/L濃度范圍下能清除自由基，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，減輕細胞的損傷，且能明顯抑制由腫瘤壞死因子所誘導(dǎo)的體外大鼠肝細胞的凋亡，且對細胞功能有很強的促進作用。山莨菪堿[2]有穩(wěn)定細胞膜和抗氧自由基損傷的作用。五味子乙素[3]對兩種不同自由基產(chǎn)生系統(tǒng)所引起的肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷均有保護作用，使肝細胞存活串提高，并能保持細胞膜形態(tài)完整。有相關(guān)功效的中藥有效成分還有丹參素[4]、黃芪多糖[5]、柴胡皂甙[6]等。
因此，這些中藥中的有效成分均是離體細胞超低溫保存的良好保護劑。根據(jù)超低溫損傷機理，所添加的中藥保護成分，主要用來清除氧自由基、抑制鈣通道、增加細胞膜的穩(wěn)定性和抑制超低溫引起的細胞凋亡等渠道來保護超低溫保存中的離體細胞。但至今未有文獻報道將五味子乙素、山莨菪堿、甘草酸、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙等中藥有效成分應(yīng)用于離體細胞的超低溫保存。
史桂蘭，胡志浩，甘草酸藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展，天津藥學(xué)2001，13(1)10-12。
王火、張淑環(huán)、黃良生，樟柳堿和山莨菪堿預(yù)防急性肺損傷的實驗研究，中國急救醫(yī)學(xué)，1999，19(11)19-20。
劉耕陶，五味子乙素對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞脂質(zhì)過氧化的抗氧化作用，中國藥理學(xué)報，1989，10(4)353[4]張文生朱陵群張麗慧牛福玲，丹參素對缺氧/缺糖損傷神經(jīng)細胞線粒體的保護作用，北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，27(3)53-56[5]李汶霞，孫圣剛，袁慧，王海濤，張顏波，孫保亮，黃芪多糖對星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中自由基系統(tǒng)損傷保護作用的時間依賴性，中國臨床康復(fù)，200610(11)59-61[6]周世文，周寧，徐傳福。中草藥抗肝細胞損傷有效成分研究進展，中國藥學(xué)雜志，1995，30(2)67-69。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種動物細胞的超低溫保存溶液，同時，也提供一種應(yīng)用此保存溶液進行超低溫的保存方法。
該發(fā)明的基本思路是在動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種保護因子，抑制因為超低溫保存所造成的細胞損傷，而且超低溫保存中以及前后的預(yù)培養(yǎng)和復(fù)溫培養(yǎng)中都添加了保護因子，強化其對細胞的保護作用。該保護因子主要由中藥有效成分組成。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種動物細胞的超低溫保存溶液，它包括動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜和中藥有效成分山莨菪堿、五味子乙素、甘草酸、苦參堿、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙；所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜的體積比為7∶2∶1，各中藥有效成分的濃度分別為山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
進一步地，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基、HTS液、L-15或Ham’sF12。
一種應(yīng)用上述超低溫保存溶液進行的超低溫保存方法，用于保存動物細胞，它包括如下步驟(1)將剛分離得到的或已經(jīng)過一段時間培養(yǎng)的動物細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0～24小時；(2)將預(yù)培養(yǎng)后的動物細胞在權(quán)利要求1所述的超低溫保存溶液中保存0～48月；(3)保存完畢后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)溫培養(yǎng)。
進一步地，所述動物細胞是從組織器官中分離得到的原代細胞。
進一步地，所述步驟(1)和(3)中，所述二氧化碳培養(yǎng)箱中，為防止細胞在逐漸升溫過程中受損，使用的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了各保護因子，其組成為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
本發(fā)明專利的有益效果是，通過獨特的中藥有效成分和其他化學(xué)保護劑成分的添加，優(yōu)化了超低溫保存液配方，較好地通過超低溫保存方法維持細胞的生物學(xué)活性及特異性功能。同時，在-80～-196℃下超低溫保存情況下，細胞運輸和保存過程中不需要任何營養(yǎng)和氧氣供給，操作簡單可行，為離體細胞的長期保存和遠程運輸帶來便利，具有很大的實用價值。
具體實施例方式
下面根據(jù)具體實施例詳細介紹本發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。
為了克服現(xiàn)有的超低溫保存過程中保存細胞效果差的嚴重不足，本發(fā)明以基于添加各種不同功能的中藥保護成分為主要發(fā)明創(chuàng)造點，此外結(jié)合廉價的化學(xué)保護劑來研制一種有效的用于超低溫保存離體細胞的溶液，同時也提供一種相應(yīng)的便于操作的超低溫保存方法。
在預(yù)培養(yǎng)和復(fù)溫過程中，為了防止細胞在逐漸升溫時受到損傷，二氧化碳培養(yǎng)箱中在現(xiàn)有的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入了各種保護因子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L，pH調(diào)節(jié)至7.4；二氧化碳培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37℃，內(nèi)含5％的二氧化碳。
現(xiàn)有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為Eagle’s MEM，DMEM，Ham’s F10或12，DMEM/F12，PRMI 1640，L-15，M199，Williams’E等培養(yǎng)基。
本發(fā)明的超低溫保存溶液是在0.7升現(xiàn)有的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.2升的胎牛血清(FBS)、0.1升二甲基亞砜(DMSO)、0～500mg/L的山莨菪堿、0～100mg/L的五味子乙素、0～100mg/L的甘草酸、0～100mg/L的苦參堿、0～100mg/L的丹參素、0～100mg/L的黃芪多糖、0～100mg/L的柴胡皂甙，最終pH為7.4。
超低溫保存溶液所使用的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為1640培養(yǎng)基，HTS液，L-15，Ham’s F12等。
超低溫保存方法的步驟為將體外培養(yǎng)或剛分離得到的細胞先在正常培養(yǎng)溫度(37℃)下采用含有效保護成分的培養(yǎng)基來預(yù)培養(yǎng)0～24小時，將培養(yǎng)基切換成0～4℃的超低溫凍存溶液，保存細胞密度為5.0×106/毫升，放入-80℃冰箱過夜保存(12～15小時)后，再將其放入液氮中保存0～48月。保存完畢后采用37℃水浴快速復(fù)溫，采用新鮮的動物細胞培養(yǎng)基進行復(fù)溫培養(yǎng)，該培養(yǎng)基仍添加了有效保護成分。
保存和培養(yǎng)細胞的方式有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、凝膠包埋培養(yǎng)、聚球體培養(yǎng)等。這樣所得到的高活率細胞可用于人工器官和其他醫(yī)藥研究。
實施例1新鮮分離肝細胞，Williams’E培養(yǎng)基(添加有5mg/L苦參堿、5mg/L山莨菪堿、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹參素、10mg/L黃芪多糖、10mg/L柴胡皂甙)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱懸浮預(yù)培養(yǎng)0.5小時。將培養(yǎng)基換成1640培養(yǎng)基，該溶液成分為50％的1640培養(yǎng)基，添加體積比為10％的二甲基亞砜(DMSO)，此外復(fù)合保存液中還添加有100mg/L苦參堿、50mg/L山莨菪堿、50mg/L五味子乙素、50mg/L甘草酸、100mg/L黃芪多糖、100mg/L柴胡皂甙等，細胞最終密度1×107。-80℃冰箱過夜保存(15-20小時)，最后放入液氮中保存15天。于37℃水浴中進行解凍，然后進行復(fù)溫培養(yǎng)。該復(fù)溫時使用的Williams’E培養(yǎng)基中添加了與預(yù)培養(yǎng)時相同成分的保護劑，復(fù)溫并貼壁培養(yǎng)24小時、48小時、96小時后檢測各項指標。
單層貼壁培養(yǎng)方式下，使用添加有各種中藥保護成分的超低溫保存液與不含中藥保護成分的超低溫保存液的結(jié)果差別

由實驗數(shù)據(jù)，加藥組與對照組相比，其細胞存活率更高，可見使用添加有各種中藥成分的超低溫保存液其保存效果優(yōu)于普通超低溫保存液。
實施例2將無菌條件下收獲的軟骨細胞，置于37℃進行凝膠包埋，注入中空纖維絲，細胞密度為1×105。將中空纖維絲組件放入5cm玻璃皿，浸沒于DMEM/F12培養(yǎng)基(培養(yǎng)液中的添加成分10mg/L苦參堿、50mg/L山莨菪堿、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹參素、10mg/L黃芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+。)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置預(yù)培養(yǎng)2h。將培養(yǎng)基換成保護劑添加含量和成分均相同的的HTS液，-80℃冰箱過夜保存(15-20小時)，最后放入液氮中保存2個月。于37℃水浴解凍，復(fù)溫時使用的DMEM/F12培養(yǎng)基中也添加了與預(yù)培養(yǎng)時同樣成分的保護劑，復(fù)溫并貼壁培養(yǎng)24小時、48小時、96小時后檢測各項指標。
凝膠包埋培養(yǎng)方式下，使用添加有各種中藥保護成分的超低溫保存液與不含中藥保護成分的超低溫保存液的結(jié)果差別

實施例3將無菌條件下收獲的成纖維細胞細胞，置于37℃進行聚球體培養(yǎng)，注入中空纖維絲，細胞密度為1×106。將中空纖維絲裝入硅膠管，加入RPMI 1640培養(yǎng)基(培養(yǎng)液中的添加成分10mg/L苦參堿、50mg/L山莨菪堿、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹參素、10mg/L黃芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+。)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱靜置預(yù)培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)基換成保護劑添加含量和成分均相同的的UW液，-80℃冰箱過夜保存(15-20小時)，最后放入液氮中保存5個月。于37℃水浴解凍，復(fù)溫時使用的RPMI 1640培養(yǎng)基中也添加了與預(yù)培養(yǎng)時同樣成分的保護劑，復(fù)溫并貼壁培養(yǎng)24小時、48小時、96小時后檢測各項指標。
聚球體培養(yǎng)方式下，使用添加有各種中藥保護成分的超低溫保存液與不含中藥保護成分的超低溫保存液的結(jié)果差別如下

上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種動物細胞的超低溫保存溶液，其特征在于，它包括動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜和中藥有效成分山莨菪堿、五味子乙素、甘草酸、苦參堿、丹參素、黃芪多糖、柴胡皂甙。所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜的體積比為7∶2∶1，各中藥有效成分的濃度分別為山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超低溫保存溶液，其特征在于，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基、HTS液、L-15或Ham’s F12。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的超低溫保存溶液進行的超低溫保存方法，用于保存動物細胞，其特征在于，它包括如下步驟(1)將剛分離得到的或已經(jīng)過一段時間培養(yǎng)的動物細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0～24小時。(2)將預(yù)培養(yǎng)后的動物細胞在權(quán)利要求1所述的超低溫保存溶液中保存0～48月。(3)保存完畢后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)溫培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述動物細胞是從組織器官中分離得到的原代細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述步驟(1)和(3)中，所述二氧化碳培養(yǎng)箱中，為防止細胞在逐漸升溫過程中受損，使用的動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了各保護因子，其組成為鈣離子Ca2+0～10mol/L、山莨菪堿0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦參堿0～100mg/L、丹參素0～100mg/L、黃芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述動物細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細胞的超低溫保存溶液及保存方法，用于保存細胞，特別是新鮮分離的原代動物細胞，如肝細胞，它是通過將已分離的動物細胞在37℃下預(yù)培養(yǎng)0～24小時后，將培養(yǎng)基切換成0～4℃的超低溫保存溶液，然后在－80～－196℃下超低溫保存0～48個月。保存結(jié)束后，采用新鮮細胞培養(yǎng)基在37℃條件下進行復(fù)蘇培養(yǎng)，最后采用正常動物細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在保存過程以及前后的培養(yǎng)基中采用添加中藥有效成分以及其他化學(xué)保護劑，提高動物細胞經(jīng)過超低溫保存后的存活率以及細胞功能。本發(fā)明提出的離體動物細胞長期超低溫保存技術(shù)，可以為生物人工肝及其他人工器官提供所需細胞的運輸和保存手段，同時也可保存動物細胞用于其他醫(yī)藥研究領(lǐng)域。
文檔編號C12N5/06GK101037667SQ200710067090
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者孟琴, 魯燕華, 沈沖 申請人:浙江大學(xué)