專(zhuān)利名稱(chēng)：一種嗜酸乳桿菌的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜酸乳桿菌的制備方法，屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
微生態(tài)制劑是指將已知的有益微生物通過(guò)現(xiàn)代生物工程技術(shù)制備成應(yīng)用于動(dòng)物的生物制劑，它能有效補(bǔ)充畜禽體內(nèi)的有益微生物，改善動(dòng)物體內(nèi)菌群平衡，提高機(jī)體抗病力和飼料吸收利用能力。由于微生態(tài)制劑無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗性，且具有預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，可有效克服長(zhǎng)期使用抗生素造成的一些不良影響，被認(rèn)為是飼用抗生素潛在的、天然的、對(duì)環(huán)境和健康無(wú)害的替代物。九十年代以來(lái)，微生態(tài)制劑在畜禽養(yǎng)殖方面的應(yīng)用發(fā)展很快，1989年全球飼用微生態(tài)制劑總銷(xiāo)售額為7500萬(wàn)美元，1993年為1.22億美元，2000年為1.86億美元，2007年估計(jì)可達(dá)3.5億美元。
微生態(tài)制劑按微生物種類(lèi)可分為芽孢桿菌制劑、乳酸桿菌制劑及酵母制劑等。嗜酸乳桿菌是動(dòng)物腸道內(nèi)的重要益生菌，也是可以在腸道中成活和定殖的少數(shù)乳酸桿菌之一。嗜酸乳桿菌具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽汁鹽能力，不用經(jīng)特殊處理就能順利通過(guò)胃腸環(huán)境而有效定殖于動(dòng)物腸道內(nèi)形成優(yōu)勢(shì)種群；而且其產(chǎn)生的乳酸和乳酸菌素可直接作用于病原細(xì)菌，這是其它微生物活菌制劑無(wú)法比擬的。但制備嗜酸乳桿菌比較困難，未見(jiàn)良好的生產(chǎn)方法。嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)比較困難，營(yíng)養(yǎng)要求高，生長(zhǎng)條件苛刻。其發(fā)酵培養(yǎng)基一般要求以牛奶為基質(zhì)，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等營(yíng)養(yǎng)成分；或由高濃度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些營(yíng)養(yǎng)成分組成，然后在厭氧或微氧狀態(tài)下培養(yǎng)。這種方法不但難于規(guī)?；页杀緲O高，產(chǎn)品無(wú)法在飼料中應(yīng)用。因而嗜酸乳桿菌作為微生態(tài)制劑的研制開(kāi)發(fā)，具有廣闊的發(fā)展前景。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種新的嗜酸乳桿菌制備方法，該方法可大大降低生產(chǎn)成本，制備的嗜酸乳桿菌產(chǎn)品可望在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中得到規(guī)模化應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的采取的技術(shù)方案 采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)二步發(fā)酵生產(chǎn)嗜酸乳桿菌。一步發(fā)酵接種粘紅酵母，通過(guò)發(fā)酵形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；二步發(fā)酵接種嗜酸乳桿菌，通過(guò)增殖培養(yǎng)形成嗜酸乳桿菌產(chǎn)品。
本發(fā)明的具體制備工藝如下 1.菌株鑒定 (1)粘紅酵母ZHRh028 細(xì)胞卵形到球形，2.3-5.0×4.0-7.8微米，單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞連結(jié)成串，多端出芽。在麥芽汁瓊脂斜面上菌苔呈現(xiàn)珊瑚紅到橙紅色，菌落表面光滑、有光澤、粘稠有時(shí)發(fā)硬，其橫切面扁平到有較寬的凸起，邊緣不規(guī)則到整齊，不形成菌絲，無(wú)假菌絲。不發(fā)酵任何糖，同化硝酸鉀，分解楊梅苷，不產(chǎn)生類(lèi)淀粉。可同化葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖、L-山梨糖、乙醇、D-果糖、松三糖、甘油等，不能同化乳糖、蜜二糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-木糖、菊糖、棉子糖、肌醇、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-山梨醇和赤癬醇。無(wú)有性生殖現(xiàn)象，生長(zhǎng)溫度25-36℃，pH2.5-10.0范圍均能生長(zhǎng)。
(2)嗜酸乳桿菌 桿菌，兩端圓，0.6-0.9×1.5-6微米，以單個(gè)、成雙或短鏈出現(xiàn)。不運(yùn)動(dòng)，無(wú)鞭毛，菌落粗糙。在顯微鏡下觀察，顯示纏繞或微毛絲狀物，從似暗影的菌堆的中心放射伸出。無(wú)特有的色素?？赏嘈尤受?、纖維二糖、七葉苷、果糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸鹽、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨醇、木糖。同型發(fā)酵，產(chǎn)生DL-乳酸。從精氨酸不產(chǎn)氨。15℃下不生長(zhǎng)，45℃下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度35-38℃，生長(zhǎng)初始pH值為5-7，最適pH5.5-6.0。
2.制備工藝 (1)生產(chǎn)菌種 本發(fā)明所用的微生物菌種為粘紅酵母ZHRh028(Rhodotorula，glutinis ZHRh028)，保藏于CGMCC，保藏號(hào)CGMCC NO.1745，保藏日期為2006年06月27日；嗜酸乳桿菌ZJLa055(Lactobacillus acidlophilus ZJLa055)，保藏于CGMCC，保藏號(hào)CGMCC NO.2008，保藏日期為2007年04月13日。
(2)培養(yǎng)基 ①種子斜面培養(yǎng)基 粘紅酵母葡萄糖2％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.2％、瓊脂2.0％。
嗜酸乳桿菌蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、葡萄糖2.0％、K2HPO4 0.2％、檸檬酸二銨0.2％、乙酸鈉0.5％、吐溫80 0.1％、MgSO4·7H2O 0.058％、MnSO4·4H2O 0.025％、瓊脂2.0％，pH6.0。
②發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可為玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、飴糖等；氮源可為玉米漿、尿素、硫酸銨、蛋白胨、黃豆餅粉、酵母膏等。在此基礎(chǔ)上再添加一些其它營(yíng)養(yǎng)成份，如食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。
(3)培養(yǎng)方法 本發(fā)明所述的嗜酸乳桿菌制備方法，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進(jìn)行二步發(fā)酵培養(yǎng)。首先接種粘紅酵母，培養(yǎng)溫度28-33℃，培養(yǎng)4-30小時(shí)后將溫度提高到40-60℃，保溫1-18小時(shí)，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養(yǎng)15-100小時(shí)后放罐。
(4)產(chǎn)品后處理 培養(yǎng)液調(diào)制成一定的含菌量，干燥粉碎后分裝，即為產(chǎn)品。
具體工藝流程見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn) 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)比較困難，營(yíng)養(yǎng)要求高和生長(zhǎng)條件苛刻。其發(fā)酵培養(yǎng)基一般要求以牛奶為基質(zhì)，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏等營(yíng)養(yǎng)成分；或由高濃度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些營(yíng)養(yǎng)成分組成。原材料的高成本，決定現(xiàn)有制備嗜酸乳桿菌產(chǎn)品的成本很高。而本發(fā)明提供的嗜酸乳桿菌制備方法，通過(guò)發(fā)酵粘紅酵母來(lái)形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；而粘紅酵母營(yíng)養(yǎng)要求很低，其發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分均為一些常見(jiàn)的、低價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品。因此，采用本方法制備嗜酸乳桿菌，可大大降低生產(chǎn)成本。能極大地推動(dòng)嗜酸乳桿菌作為微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)利用。



附圖為本發(fā)明制備工藝流程圖。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明有以下實(shí)施例 實(shí)施例一活菌總數(shù)大于50億/ml粉劑產(chǎn)品的制備 在70L發(fā)酵罐中，按葡萄糖3％、硫酸銨0.8％、蛋白胨0.1％、磷酸氫二鉀0.02％、碳酸鈣0.02％配成50L培養(yǎng)液。按常規(guī)方法滅菌后冷卻至28℃，接種1個(gè)茄子瓶的粘紅酵母生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)23小時(shí)后將溫度提高到50℃保溫15小時(shí)，使粘紅酵母自溶；然后將溫度降至36℃，接種1個(gè)茄子瓶嗜酸乳桿菌生產(chǎn)菌種，增殖培養(yǎng)75小時(shí)后放罐。噴霧干燥后加番薯淀粉調(diào)劑到總活菌數(shù)大于50億/ml，分裝即得產(chǎn)品。
實(shí)施例二總活菌數(shù)大于10億/克粉劑產(chǎn)品的制備 在70L發(fā)酵罐中，按紅糖2.0％、葡萄糖1％、西紅柿汁6％、玉米漿0.5％、尿素0.3％、磷酸氫二鉀0.02％、氯化鈉0.2％配成45L培養(yǎng)液。按常規(guī)方法滅菌后冷卻至30℃，接種2個(gè)茄子瓶的粘紅酵母生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)10小時(shí)后將溫度提高到60℃保溫10小時(shí)，使粘紅酵母自溶；然后將溫度降至38℃，接種2個(gè)茄子瓶嗜酸乳桿菌生產(chǎn)菌種，增殖培養(yǎng)30小時(shí)后放罐。加適量玉米芯粉吸附并調(diào)制到總活菌數(shù)大于10億/克，沸騰干燥后分裝即為產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1、一種嗜酸乳桿菌的制備方法，采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，其特征是通過(guò)二步發(fā)酵方法生產(chǎn)，一步發(fā)酵接種粘紅酵母Rhodotorula glutinis，通過(guò)發(fā)酵形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；二步發(fā)酵接種嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidlophilus，通過(guò)增殖培養(yǎng)形成嗜酸乳桿菌產(chǎn)品。其制備工藝的特征如下
2、按權(quán)利要求1所述嗜酸乳桿菌的制備方法，其制備工藝的特征如下
(1)生產(chǎn)菌種
采用粘紅酵母Rhodotorula glutinis ZHRh028和嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidlophilusZJLa055，菌種保藏于CGMCC，保藏號(hào)分別為CGMCC NO.1745和CGMCC NO.2008；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基
培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源采用碳源和氮源，其中碳源為玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖或飴糖；氮源為玉米漿、尿素、硫酸銨、蛋白胨、黃豆餅粉或酵母膏，并添加食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽；
(3)培養(yǎng)方法
采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進(jìn)行二步發(fā)酵培養(yǎng)，首先接種粘紅酵母，培養(yǎng)溫度為28-33℃，培養(yǎng)4-30小時(shí)后將溫度提高到40-60℃，保溫1-18小時(shí)，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養(yǎng)15-100小時(shí)后放罐；
(4)產(chǎn)品后處理
培養(yǎng)液調(diào)制后，干燥粉碎即為產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗜酸乳桿菌的制備方法，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)分步接種粘紅酵母和嗜酸乳桿菌進(jìn)行二步發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)。首先接種粘紅酵母，培養(yǎng)溫度為28-33℃，培養(yǎng)4-30小時(shí)后將溫度提高到40-60℃保溫1-18小時(shí)，使粘紅酵母自溶形成嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件；然后將溫度降至34-39℃，接種嗜酸乳桿菌，增殖培養(yǎng)15-100小時(shí)后放罐，調(diào)制后形成嗜酸乳桿菌產(chǎn)品。本方法能顯著降低嗜酸乳桿菌的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/23GK101096648SQ200710069019
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日
發(fā)明者竺利紅, 施躍峰, 吳吉安, 梁建根, 桑金隆 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院