專利名稱：一種檢測(cè)移植腎功能的寡核苷酸芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能檢測(cè)移植腎功能的寡核苷 酸芯片，能檢測(cè)不同移植腎功能狀態(tài)包括腎功能穩(wěn)定狀態(tài)，急性排斥，急性腎 小管壞死等。
技術(shù)背景急性排斥是腎移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，可直接導(dǎo)致移植腎功能丟失或影 響移植腎的長(zhǎng)期存活。目前急性排斥的診斷主要依靠腎組織活檢，是一創(chuàng)傷性 的檢査，并收到取樣限制。許多研究者采用各種實(shí)驗(yàn)方法試圖尋找急性排斥的 生物標(biāo)志物，診斷急性排斥，但均未能廣泛應(yīng)用于臨床。芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)前沿的分子生物學(xué)技術(shù)，是微 電子，化學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)等學(xué)科交錯(cuò)綜合發(fā)展的新產(chǎn)物。依據(jù)核酸分子雜交原 理檢測(cè)代測(cè)樣本中的核酸序列及基因表達(dá)信息。目前基因芯片技術(shù)己成為生物 醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)強(qiáng)有力的工具，可用于基因表達(dá)譜研究、基因功能研究、基 因多態(tài)性分析、DNA測(cè)序、疾病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控、臨床診斷、藥物篩選以 及指導(dǎo)用藥等多個(gè)方面。在腎臟移植領(lǐng)域，基因芯片可以對(duì)腎移植術(shù)后不同腎 功能狀態(tài)下外周血細(xì)胞和組織中的基因表達(dá)水平進(jìn)行大規(guī)?？焖贆z測(cè)，并通過(guò) 生物信息學(xué)對(duì)這些基因特異性進(jìn)行綜合分析，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)免疫應(yīng)答過(guò)程。 而表達(dá)譜芯片是目前腎移植臨床研究中應(yīng)用最廣泛的是一種芯片。雖然表達(dá)譜 芯片較傳統(tǒng)方法相比較具有高度的并行性，高效性，高靈敏度，自動(dòng)化和能更 全面地研究某一表型或病癥的有關(guān)基因。但是在臨床疾病研究中廣泛使用表達(dá) 譜芯片檢測(cè)幾千個(gè)基因是不現(xiàn)實(shí)的，研究人員希望芯片上被研究的基因數(shù)目能 夠減少，因?yàn)橛稍S多與研究對(duì)象無(wú)關(guān)的基因所提供的數(shù)據(jù)會(huì)對(duì)分析與研究對(duì)象 有關(guān)的基因產(chǎn)生干擾，提供無(wú)用的或錯(cuò)誤的信息。并且低豐低度表達(dá)的基因易 被高豐度表達(dá)基因掩蓋而檢測(cè)不出。目前用于器官移植臨床研究的基因芯片主 要有兩大類，其一是以Affymetrix公司為代表原位合成的高密度短寡核苷酸 芯片，技術(shù)要求高，價(jià)格昂貴，商業(yè)合成的基因芯片，不能根據(jù)研究者需要而 提供定制服務(wù)；其二是以Stanford大學(xué)研究組為代表的cDNA芯片，采用PCR 方法合成后點(diǎn)樣，其制備過(guò)程復(fù)雜，工作量大，而且雜交信號(hào)的特異性有待于
進(jìn)一步的提高。所以針對(duì)基因的功能分類，有針對(duì)性的選擇與研究相關(guān)的某些 基因，再結(jié)合微陣列技術(shù)制成的類似于功能分類基因芯片，可以大大縮短發(fā)現(xiàn) 疾病相關(guān)標(biāo)志物的時(shí)間。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種移植腎功能檢測(cè)核苷酸芯片，由基質(zhì)尼龍膜、點(diǎn) 樣區(qū)、固定在尼龍膜表面矩陣分布的經(jīng)修飾及雜交的寡核苷酸探針組成，寡核苷酸探針具有SEQIDNO 1的序列。在芯片的點(diǎn)樣區(qū)分別點(diǎn)上特異性寡核苷酸 探針，點(diǎn)成96 (12X8)個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣包括15 (5X3)個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)的直徑為 0.6mm，點(diǎn)間距為1.5pm。本發(fā)明是采用接觸式打印的方法，將由BIOBASICINC (Canda)公司合 成的特異性代表一個(gè)基因的70bp的寡核苷酸片斷點(diǎn)樣于尼龍膜上，具體通過(guò) 以下步驟實(shí)現(xiàn)(1) 根據(jù)已發(fā)表的參考文獻(xiàn)及移植免疫學(xué)知識(shí)，篩選出免疫相關(guān)性基因 449條，合成70bp長(zhǎng)寡核苷酸序列，由芯片制備機(jī)器人的直徑為0.6mm的96 針點(diǎn)制于尼龍膜(8X12cm)上，點(diǎn)之間的間距為1.5mm;(2) 寡核苷酸探針液體濃度稀釋，稀釋成15umol/L的終濃度；(3) 芯片雜交前經(jīng)Ultraviolet crosslinker交聯(lián)處理(60mJ/cm2)，使寡核苷 酸固定在尼龍膜上；(4) 芯片雜交過(guò)程RNA樣本在逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈摻入同位素33P， 逆轉(zhuǎn)錄同位素標(biāo)記體系，雜交液(1% BSA, 1 mmol/L EDTA(PH 8.0)，0.5 mol/L \&21^04( 117.2)緩沖液,7%808 (十二垸基硫酸鈉)，在雜交爐中50'C預(yù)雜交 2小時(shí)(hr)，然后將已變性好的cDNA樣品加入雜交管中，5(TC雜交過(guò)夜，然 后用洗膜液(2xSSC (氯化鈉一檸檬酸鹽緩沖液)，0.1%SDS) 50°C洗兩次， 涼干，(5)數(shù)據(jù)提取與分析尼龍膜晾干后用保鮮膜包好，用磷屏(Kodak) 壓膜放射自顯影72hr，掃描儀Typhoon 9200掃描磷屏，使放射性信號(hào)轉(zhuǎn)換為 可視化圖像。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種移植腎功能檢測(cè)核苷酸芯片在移植腎功 能檢測(cè)中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是-(1) 本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，開(kāi)發(fā)了一種特異性針對(duì)腎移植患者的基因芯片；(2) 早期、快速、廉價(jià)、準(zhǔn)確檢測(cè)移植腎功能；(3) 可以區(qū)分不同病因?qū)е碌囊浦材I功能障礙包括區(qū)分急性排斥和急性 腎小管壞死。 (4)選擇用70bp寡核苷酸的優(yōu)勢(shì)在于70bp長(zhǎng)度的核苷酸既能保證雜交 信號(hào)的靈敏度和特異度，并且價(jià)格低廉；本發(fā)明選擇了 449個(gè)免疫相關(guān)的基因， 基因的選擇基于已有的科學(xué)理論基礎(chǔ)和推測(cè)，特異性的針對(duì)腎移植患者，減少 了無(wú)關(guān)基因?qū)τ幸饬x基因數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生干擾，提高了雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。這樣 既達(dá)到了高通量表達(dá)譜芯片的同樣目的，又可以節(jié)省大量的時(shí)間和金錢(qián)，達(dá)到 事半功倍的效果。


圖1為本發(fā)明的寡核苷酸芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為本發(fā)明每個(gè)基因點(diǎn)樣示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 本發(fā)明寡核苷酸芯片的制備和雜交 1，芯片制備參見(jiàn)圖1，寡核苷酸芯片由基質(zhì)尼龍膜1、點(diǎn)樣區(qū)2、固定在尼龍膜表面 矩陣分布的經(jīng)修飾及雜交的寡核苷酸探針3組成，寡核苷酸探針3具有SEQ ID NO 1的序列。在芯片的點(diǎn)樣區(qū)2分別點(diǎn)上特異性寡核苷酸探針3，點(diǎn)成96 (12 X8)個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣包括15 (5X3)個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)的直徑為0.6mm，點(diǎn)間距為 1.5pm。根據(jù)已有相關(guān)知識(shí)篩選出免疫相關(guān)性基因449個(gè)，利用Operon公司 提供的70bp長(zhǎng)寡核苷酸序列，交BIOBASIC INC (Canda)公司合成，參見(jiàn) SEQ ID NO 1的序列。1 OD合成的寡核苷酸溶于100ul雙蒸水(ddH20)， 濃度為15uM，吸40ul入384孔板，由芯片制備機(jī)器人(Genomic SolutionW)的 直徑為0.6mm96針點(diǎn)制于尼龍膜(8X12cm) (ImmobilonTM-Ny + transfer membrane, MilliporeCO.)上，點(diǎn)之間的間距為1.5mm。每個(gè)基因有平行的三個(gè) 重復(fù)點(diǎn)(參見(jiàn)圖2)，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)兩次。制備完成的芯片于-20'C保存?zhèn)溆谩?，雜交和數(shù)據(jù)分析芯片雜交過(guò)程RNA樣本在逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈摻入同位素"P，逆轉(zhuǎn)錄 同位素標(biāo)記體系，雜交液(1% BSA， 1 mmol/L EDTA(PH 8.0)，0.5 mol/L Na2HP04 (PH7.2)緩沖液，7% SDS。)，在雜交爐中5(TC預(yù)雜交2 hr，然后將已變性好的 cDNA樣品加入雜交管中，5(TC雜交過(guò)夜。然后用洗膜液(2xSSC， 0.1%SDS) 50°C洗兩次，涼干后用磷屏(Kodak)壓膜放射自顯影72hr，掃描儀Typhoon 9200掃描磷屏，使放射性信號(hào)轉(zhuǎn)換為可視化圖像。實(shí)施例二本發(fā)明制備的寡核苷酸芯片的用途1:芯片的重復(fù)性和準(zhǔn)確性預(yù)實(shí)驗(yàn)10個(gè)探針，每個(gè)探針獨(dú)立兩次雜交的結(jié)果，R2值為0. 88-0. 95,根 據(jù)芯片間數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)R2〉0.81即被公認(rèn)為實(shí)驗(yàn)具良好重復(fù)性這一標(biāo)準(zhǔn)，本 文所獲的雜交數(shù)據(jù)具良好重復(fù)性，能夠用于后續(xù)分析。急性排斥組與腎功能穩(wěn)定組比較篩選出的最顯著差異表達(dá)的10個(gè)基因， 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證的結(jié)果與芯片的檢測(cè)結(jié)果相一致，均表現(xiàn)為在急性排斥組中 高表達(dá)，驗(yàn)證了芯片雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。2:臨床標(biāo)本的檢測(cè)共完成了 62例移植受者的PBMC的雜交分析，包括15例腎功能穩(wěn)定(TX)， 15例急性排斥(AR)， ll例臨界改變(BL)， 5例急性腎小管壞死(ATN)， 7例 假定排斥(PR)和9例非排斥(NR)。15例病理證實(shí)的急性排斥與15例腎功能穩(wěn)定組比較，篩選出63個(gè)差異表 達(dá)基因。其中60個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào)，包括細(xì)胞間黏附分子，趣化因子及其受 體，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及參予蛋白代謝等基因；3個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因包括LTA， BIK， TRAF5。根據(jù)所有基因做聚類分析，結(jié)果急性排斥組與腎功能穩(wěn)定組聚成兩大 枝，能很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。病理表現(xiàn)為臨界改變者，其基因表達(dá)譜與急性排斥者 相似，兩者比較未篩選出差異表達(dá)基因；臨界改變組、急性排斥組與腎功能穩(wěn) 定組比較，篩選出33個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)這些差異表達(dá)的基因做聚類分析， 臨界改變、急性排斥與腎功能穩(wěn)定組區(qū)聚成兩大枝，也能很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。5例表現(xiàn)為移植腎延遲復(fù)功的受者，病理證實(shí)為急性腎小管壞死，其外周 血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)譜與腎功能穩(wěn)定組比較，篩選出io個(gè)差異表達(dá)基因， 包括細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)亡等基因，其中大部分基因也在急性排斥中高表達(dá)。 在這10個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因中，除了SELP (選擇素P)， MAPRE2 (微管相關(guān)蛋白 2)，其余8個(gè)同樣在急性排斥中高表達(dá)。急性腎小管壞死組、急性排斥組與腎 功能穩(wěn)定組做聚類分析，發(fā)現(xiàn)ATN、 AR與TX能很好的區(qū)分開(kāi)，而ATN與AR兩 者之間表達(dá)譜很接近。PR組的表達(dá)譜與TX組接近，PR與TX組篩選出2個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因， CD28(CD28抗原)禾卩RAG2 (recombination activating protein 2,重組活化基 因一2)。 AR組與PR組比較，篩選出32個(gè)差異表達(dá)基因，其中30個(gè)上調(diào)，2 個(gè)下調(diào)。PR組、TX組與AR組做聚類分析，結(jié)果PR、 TX與AR聚成兩大枝，PR 與TX未能區(qū)分開(kāi)來(lái)。NR組與TX組比較，未篩選出差異表達(dá)基因。AR組與NR組比較，篩選出 36個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，1個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。聚類分析顯示NR組的基因表達(dá)譜 與腎功能穩(wěn)定組較為接近，NR， TX與AR聚成兩大枝，能很好區(qū)分開(kāi)來(lái)。此發(fā)明的寡核苷酸芯片可以應(yīng)用于檢測(cè)移植腎功能，區(qū)分不同的移植腎功 能狀態(tài)。
本發(fā)明涉及的序列 〈110〉浙江大學(xué)〈120> —種檢測(cè)移植腎功能的寡核苷酸芯片及其應(yīng)用 <160> 1 <210> 1 〈211〉 449 〈212〉 RNA<213>人類(Homo sapiens) <220>〈221〉 MNDA <400> 1嵐CCAGGMGMGTGGGTCTTGCGGCACCTGCACCCACCGCMGAMCAAACTGACATCGGAAGCMGA ATGGGMGCCCAGCAATACCACGCAGTCCCTCCACTTTCTCAAAGCACACTGGAAAGGCCATTAGAATTG GGCTGMCACTGGCMCGACAAAGCCMCAGTCAAAACAGAGATGTGATMGGATCAGMCAGCAGAGGT TTGCTCATGCACCTGGGCAGATACATCCCATTCCTTCCTAGTGAGAAGCTGGAAAGMCCAGCTCTGTCT GGCAGGACCTGTGGCCMGTTCTTAGTTGCTGTATGTCTCGTGGTAGGACTGTAGAAAAGGGAACTGMC GTGGGAGTCATGGACATGAAGGGATGCTGCAATGTAGGMGGAGAGCTCTTTGTGMTGTGAGGTGTTGC CTGTCCCAGGGAGAGTTGCATCGCCCTCCACMGCCCTATTCCTMCATGGCTGATGACTATGGCTCTGA TCCTGGCTTCATTTTTTGCTGATGGTTCCCCCTCGTCCCAAATCTCTCTCCCAGTACACCAGTTGTTCCT GGCAATGTTCCCCCTCTCCTCTCTTCCTCCCTGGAATCTTGTMAGGTCCTGGC磁GATGATCAGTATG GACCCTGGACCTGATACGGCTCCCCAGTACACCCCACCTCTTCCTTGTAAATATGATTTATACCTMCTG TCTCATTTGGAMCTAAAACTTCATCTTCCCCMGTGCGGGGAGTACMGGCATGGCGTAGAGGGTGCTG CAGCTGCTCCCAGCGGGCTGTGATATTCACTACCAAAAGAGGCMGMAGTCTGTACCCATCCMGG嵐 TCGAAAGCTMGATGACCATGCGCCCTTTCCTCTGTACATATACCCTTMGAACGCCCCCTCCACACACT GCTGGGGTTGGAGGTTTCACTTGCACATCATGGAGGGTTTAGTGCTTATCTMTTTGTGCCTCACTGGAC AGTCMGCATTGTGAATTATTACCTAACCTGGGGMCCGAGGACCAGAAGGAAGGACCAGGCTTCCAGCT GCCATGAAGCTCCTGGATGCTCGAAATAAGGTTTTTGCAAAGCTCCACCACMCACGCAGACCTTCCMG CTGTATTCACCCGTCCAGACCTTGTTCACACTCTCACATGTTTAGAGTTGCMTCGTMTGTACAGATGG GCTTGCACCACATTCAGCATTMTCACTAGGTCACTTTGCTTGCTGACCCCTTCCTCATAGTTGTTTGGC GGGTAC嵐CTCATTGCTGC嵐TTGAAMCCATGCMAGGCTGTCTTCCTCTGGGGAGTTCAATGCCTC TCCATTGGAAAATCCAGTACTTCTGGACAGATTCCATGCTACTAGTGCTGACTGCTGCATCTCCTACACC CCAGGCACCTCACAGMATGAGATCAGGCTCTGCCTCACCTTGGGGCTTGACTTTTGTATAGGTAGATGTAGAGACTTTGCTAGATCCTCTCATATTTTGTCTTCCTCAGGGTGGCAGGGGTACAGAGAGTGCCTGATTG CGCCCMGGCCACGAGCTTGTTCTTTGTTCTTTGTCACAGGGACTGAAAACCTCTCCTCATGTTCTGCTT CTTCCTGGATTCCTCACTTTGMGAGTGTGAGGAAAACCTATGTTTGCCGCTTAAGCTTTCAGCTCAGCT GGAGTGGGCTMGCACGGGCCATATGMTMCATGGTGTGCTTCTTAAAATAGCCATAAAGGGGAGGGAC CACTCTTMGCTTCCGCCGTCTCMCCCCTCACAGGAGCTTACTGGCCATGAAAAATCGGCTTACCA CTCAGCCTCTGAATATGMCGGTGAGCATTGTGGCTGTCAGCAGGMGCAACGMGGGAMTGTCTTTCC GACTTGGGGTTGCTTTTCCTCTTGMCCACAGTTCTACCCCTGGGATGTTTTGAGGGTCTTTGCMG CAAGAGAGAMGCTCCATGGGACTCTGCCCAAGCTGMTTTTGGGATGCTMGGAAAATGGGCTGMGCC CCGAMAGGCTGTGGATTTCGTATGGAAATAATGTTTTATTAGTGTGCTGTTGAGGGAGGTATCCTGTTG GCCATCCTCCCMGGGGCCCAAATTCTTTCAGTGGCTACCTACATACAATTCCAAACACATACAGGAAGG GCTCACCAGTCCCTCCCCMATGCTTTCCATGAGTTGCAGTTTTTTCCTAGTCTGTTTTCCCTCCTTGGA CACMTGCCTCATCTTCCCTGGAGGACCCACTTCCTGATCCCTCAACTGTGTCTGATGTTTCTTCTCATG GGACTGAGGGGAGGGGAGCATGGGAAGTGACGGTTTMTGGGCACAGGGTnATGTTTAGGATGTTGAAA AGTTTTAATTGAACTAACAATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTTGTCATTGCCAGCTGTGTTGGTAGTGC AGCTGCCTGGGAGGCAGATGGMCTTGAGCCTGTCMGAGGCAAAGGAATCCATGTAGTAGATATCCTCT MCTGTGCAGGGCAGGGCCATCTGTTCGGACCCCMCMCMGAGAGTGMGMTGCAGTTTACCTG CGCCTTGGACACAGTTGGATGGGTTCAGAGGCACAGMMATGCTGAGGCACTGCCCGTCAAAAAGA GCCACCCTGGAGGCCACCTCTTCTMGAGTCCCATCTGCTATGCCCAGCCACATTAACTMCTTTAATCT AAAGGGCTCACGCATTCAGCCAGGAGATGATACTGGTCCTTAGCCCCATCTGCCACGTGTATTTMCCTT CTCAGTGCTGTAACTGTGGGATGCTCCTCCCTTCTCTACCTCATGGGGGTATTGTATMGTCCTTGC CTCCCTCCTACCTGTCTGTAGTGTTGTGGGGTCCTCCCATGGATCATCAAGGTGAMCACTTTGGTATTC GGGAGAAAATMTCCAGTCTTCACTGGGTTCCCATTCTGAGGGTCCACTACTCAAAAATTTGCTTCACTC ACTGCTGCTTTAACCCGGTGCTCTATGTCTTCGTGGGGGTCAAGTTCCGCACACACCTGAAACATGTTCT AGACCMGCGTGAGCTCCACGCGGGTCGACAGACCTCCCTGTGTTCCGTTCCTAATTCTCGCCTTCTGCT GMTATGCCCMGCTATGCCTTGTCCTCTTGTCCTGTTTGCATTTCACTGGGAGCTTGCACTATTGCAGC TGACTATCGTACTGGCCTTMTGTACGTCTTCAGGGAGCACCMCGGAGCGGCAGTTACCATGTTAGGGA TTCCATCTACTTTTCTATCGCCGTCCCCTTTTGCAGCCCTCTCTGGGGATGGACTGGGTTGTTGACA GAGTCTGGGCCCTGGTCCMTGCTGCTGTTGTCTGAGGMTGGTTTGGTGAGMCAGATGTTAGAACTTG CCACACTGTCTAGGATTGTGCGGGGCTGGTGAGAGMCAAGATCTCTTCCGTGTTCMGGCAGACTTCCT TGGATTCGGATGATGCAAGGAGACACATGCCACCCCAGCAGTACACGCACTTACCTTGACTGGTGM ACGCTACTAACTACAGGMGCCTAAGCCCCCGCTGTMTGCACCTTCTCTGGAGCCAAGTCCAG CAACTAGGGGGTTGGGTAGGATTCCTAGGTATGGGGMGAGTTTTGGAAGGGGAGGMMTGGCAAGTGTTAGCGGGGGGCTGCMTAGGGGGGCCCACTGGACAAGGAGCACATTCCCACCAGAGAGAACATTCTAGCT GGGATGTGAAGAATTGAGGCATGCAACCCMTAGCATAAATGTCCTTTTTCCCCCCAAATATGGTCTAGA TACCTGTGGCTGTGTATCCGTGGCCACAGCTGGTTGGCGTCGCCTTGAAATCCCAGGCCGTGAGGAGTTA ATGGAAATTAGTATGTTCACTATTTAAGACCTATGCACAGAGCMAGTCTTCAGAAAACCTAGAGGCCGA ATTCTCGGCTTTAGCCCTGGACCCAGCAGGTGAGGCTCGGCTTGGATTATTCTGCAGGTTCATCTCA CTGGCMGACCTGATTTCTGAGCATTTMTATGGATGCCGTGGGAGTACAAAAGTGGAGTGTGGCCTGAG CGTGCACCACTGGMCAAAACCAAAATGTGACCATMCTGTTTAGGCTTCTGTGTGTTTGTMTATGCTC TATGGTAATACGTGAGGMTTTGACTCATCCCCAGCCTCCACCTCCTGTGTGATACTTGGGGGCTAG CCATTGCTTCACCAGCAGTACCAAATGAGGTCACACCACCCTCTGCTGATGCCAATTCCAGTAC CCACCCTCTTGTGCCCTTMGCATTACTTTAACTGGTAGGGAACGCCAGMCTTTTAAGTCCAGCTATTC CACTMGACTTTCCTCCMGAACTMGCCAACTTGATGTGAAAAGCACGGCTGTATATAATGGTGATGTC ACATCAAAATCCACCCCTTCTTCAAGACCATCTGGACTCTGCTGGAAAAGCGGAGGTTGGAGCCACC TACTGTATTCACTGTACCTTCTGCMCTCGAGCCCTGGCTGGGTGTGTGTTATGTGCAACCGGACTAGTA AAGACAGMGCTGMGTGCATCCAAAGGTGCTCAGAGAGCCGGCCCGCCTGAATCATTCTCGATTTAACT AGATCATCCAGAAGTTCCTCAAGGGCCAGGACTTTATCTAATACCTCTGTGTGCTCCTCCTTGGTGCCTG CAGTCCGTGGCATTCCCCAGCTTATTGCTGCATCACTCCAGTCTCTGTCTCTTCTGTTCTCTCCTCTTTT GTAAACAGCCTCTTTTTGATACTGGAGGMCACTTGATGGAGTGTGAGCCACCTMGATCTCGGTTTGCC CAGCTCGCCCAGGAGCTGCGGGCGCTGCMGGATGGATGAATGGAGAGGACAAAGGCAGCTTCTGACACA CAGTAGGCATTTCTGGACMTTCTGGTTGTGGTTGTGGCCTTTGTGGTTTGCTGGACTCCTTATCACCTG TTCTGTTGTTTTTATAGCAGGGTTGGGGTGGTTTTTGAGCCATGCGTGGGTGGGGAGGGAGGTGTTTMC GATCTGCTGACMMCCTGGGMTTTGGGTTGTGTATGCGAATGTTTCAGTGCCTCAGACTGTGTAT ACAGCTCTAGACACTGCCACACAGGGTCTGCMGGTCTTTGGTTCAGCTAAGCTAGGMTGTCCTGC CMCMGTMCTTTGTAGAAATGAGCCAGMGCCAAGGCCCTGAGTTGGCAGTGGCCCATAAGTGTA TATATTGTCATTTTATMCACTCTAGCCCCTGCCCTTATTGGGGGACAGATGGTCCCTGTCCTGCGGGGT GMGAGTGACATGTTTACAAACCTCMGCCAGCCTTGCTCCTGGCTGGGGCCTGTTGAAGATGCTTGTAT CGCGTGGCTCATCTGTTTACCCAAACACTTCTCMTATGGACCAAAAGATCACCAGTGTAAAACCTC TGGTTCCCATGAGGTGAGATGCAACCTGMTCATGGCCACCTAAAATTCCGCTATCATGCCAGGTGCTTG CAGCAGATGGCGACAATGCAGGACAGTAGACCTCACCCTTTCCAGACTTTAGAGCTTGTGGCTTGAATGT TCCMTTCCMGGAGTTCTCAGMCACTTCCGCTGCCCACCTGGCTCACCCATGAACCCGCCTCACAAGT TGAGCCACTCAGCATCTCCTGGTCCTGCAGTGTTGCTGTAMTCCCCATTGGAGACTGCATTAGGGMTT CACCAGGCAGGGCTCAAATTTCTGCCTACAGGGTCATGCTCTATCAGATTTCAGAAGTGAGCAGATC CAAACATGTGGTTMTGCCATGGACAGMGAAGGCAGCAGGTGGCAGMTGGGGTGCATGMGGTTTCTGCCMCATTGGATGTGAAAATTGCCTTTTGTCAGGGATTCGATAAACMGTGGATGTGTCATATATTGCCA AGAAAGCTGTTTATCCGTTCCATGGGTGMGCTCCTCAGGCAGTGCAGGACMCCCAGCTATGCCCACAT GATCTATTCCCCATCCCMGGCAAGCATGMTAAAATTAGGTT綴CGTAGCATGTGGCATCGCAGTCTC GCACTGGGCCTGGGC綴CATMTTACTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCA CCACGCTATAGTCTCTGGAGGTCATGAATGTGGTGTTGCCAC嵐GCCTGGMTCTACACCCTGTTMCC TCTACTTGGGTGATTTGGTGGATAGACCCATGMTGGCCCCTGGGGGTTTTCAATCTTGGATTGGAGGTG TGTCTGAAATAGAAGCTAGGATCGCCGCMCCACAGGCMCGGACAGCCAAGACGTAGATCCATCCMGA GGGGAGGCTTTGGGAGCAAAATAAGGMGAGGGCTGAGCTGAGCTTCGGTTCTCCAGAATGTAAGAAAAC CCTGGAGTTTMTACAGTGAGCTCTAGCMGGGAGGCGCTGCCTTTTGTTTCTAGMTATTATGTTCCTC GCGGGGCACCTGCGCAGATAGAGACMTCTTACCCGCAGGTTTTCAGATCTAGGATTTGMGTGAAATGC AGAGTTTGAGGGG嵐TGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTAT GCAAAAGCCC嵐GGTTCCTMGCCTGGCTGCAAAGMGMTCMCAGGGACACTTTTTM嵐CACTCT TGTGAAACCCCCACCCTTCTGCCTCGTGCTAMCGCACACAGTATCTAGTCAGGGGAAAAGACTGCATTT GATGACAAAGGAACMTTAAACTGGCTGATTTTGGCCTTGCCAGAGCTTTTGGMTACCTATCAGAGTAT CTGTMCTGTTGAGATGTATGTGCATGTGACCACAAATGCTTGCTTGGACTTGCCCATCTAGCACTTTGG AGAGGGACCAGGGCACCACTCTCTAGGGAGCCCACACTGCMGTCAGGCCACAAGGACCTCTGACCCTGA GGCCCCCTCCATCGGGCTGAGGMGCACAGCAGCATCTTC嵐CATGTACAMATCGATTGGCTTT嵐C TCMCCCCCAGTTTGTGCACCCCATCTTACAGAGTGCAGTATGAAACTCACCAGCGAGAACAAACACCTC TGCCTCATGTTTGTTAGCCAGCACTTCTGCTCTGTCGTCTCTCCACAGCACCTTTGTGAACTCAGGMTG ACTACTTGAAAAGGGCATTTGGCACCACTCTCTGAAACAACACAGTCACTCTAGCAAGGCCCCCAMGGG MGACAGTTTCCTATCCTGGGAGCAGGAGAGTGTGCCTATTTGMTGACAAAGGTGCCAGTAGTGCCAGG CTCACACGTATCTTGGGAGCTCGGTCTCTTGGCTATTTCMGTCCTGAAGGAGACCTATGGGCTTAGMA GTATTACCTGCGGGGGTGACCATT嵐CAGGAGCAGMCTTGGACCAGACCTACTTGGATGATGAGCTGA GAGGCAGTAGAGGCTGCTGTGAAAGAGGCTGGCTACACMTCGMTGGTTTGAGGTGATCTCGCAMGTT ATCTCAGCCCACATAGTGATGGTTCCCCTGTTCACTCTACTTAGCATGTCCCTACCGAGTCTCTTCTCCA GAGAGGGGMTMTAGAAGAACATCCMGGAGMACAGAGACAGGCCCAAGAGATGAAGAGTGAGAGGGC TCCMCTCCCATCTATCAGACTAGCAGCGGACAGTACATTGCCATTGCCCCMATGGAGCCTTACAGTTG ACMGGAGTCAGACATTTTAAGATGGTGGCAGTAGAGGCTATGGACAGGGCATGCCACGTGGGCTCATAT GCCTTAGTGCCCCAGGATCAGGGAGGACTGGGTTTCAGMGCTGCCAGAGGAGGAGCCAGAAACAGATCT CAGATTGAACTTACTGTAGCCTCAGATGATTTCCCCCCTCCGCCTCCCAGGMG織GAATGTTACTGCC TATCTTGATTTGGTCAACCCGTCCAGCTGTGGGGCAGAAAAGCAGAAAGGAGCCAAGAGTTCAGCAGACT ACCTCATTATCCCCACTCCAGAGGGATTCAGGGGTTCCAGCGTTCCTGMAATGATCGATTGGCTTCCAT<formula>formula see original document page 11</formula>CCCTATGGCAGAAGCCTTTGTGATCTCACCTGTTGGMTGCACTMTGTTTTCTGAGCCCCTT嵐TATC CTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGAT GGCTGTGTTCTTGCATCTTGTCTGCAAACAGGTCCCTGCCTTTTTAGAAGCAGCCTCATGGTCTCATGCT GCCGCCACTGGCTGTGCCTCCCCCGCCACCTGTGTGTTCTTTTGATACATTTATCTTCTGTTTTTCTCM GTATCAMTGGGCATCGTCTCATGGGGTGMGGCTGTGACCGGGATGGGAAATATGGCTTCTACACACAT ATCTATATGGAATTGCTTACCMAGGCTAGTGCGATGTTTCAGGAGGCTGGAGGAAGGGGGGTTGCAGTG CCTCACTGTGTACAGAACGCAAGAAGGGMTAGGTGGTCTGMCGTGGTGTCTCACTCTGAAAAGCAGGA AGCTTCAGCAGATTATGCGTCTGACAGGMCACCCCCCGCTTATCTCATTAACAGGATGCCAAGCCATGA GGTGGACAGCCGGGTMTGCTTTTAGCTGCTCGCATGCTTGTCTTTCTGCATCTCCATCATCTGTTTACC 磁TAMATCAGAGTTGTTGCTTCCCGGCGTGTCCCTACCTCCTCCTCTGGACAAAGCGTTCACTCCCAA CTCCATCAGACCTTCTTCCCAT(JTCTCCAAGTGTGTATGCGGTGTTGAGAGMMCCTGAGTCCCACMC CATGGGGACAGATTCCCATTCTTAGCCTMCGTTCGTCATTGCCTCGTCACATCAATGCMAAGGTCCTG GGGGTGTCAGGAGGGAGAGACAGCCTGGGTATGGGCMG嵐TGACTGT嵐TATTTCAGCCCCACATTA CAGGCCTCCCTCAACCCCACCACTTCTTTTATMCTAGTCCTTTACTAATCCAACCCATGATGAGCTCCT CATCCTCTGGTCTCCCCATTACMGGAGCTCATCTCAGGCCATGGCTTTGCACAGMCCAGCTAGTTATT CCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGMGTGTGAGA雄TTTCMCTCTCTCCTGTGAGMC TCCATGTGGGTGCTAGGGACATGGGAAAMCCACTGCTATGCCATTTCTTCTCTCTGTTCCCTTCCTCAC AGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCACMCAGTCMTAAGAGA GTGATTACAAGGCTTTATCTCAGGGGCCMCTAGGCAGCCMCCTAAGCAAGATCCCATGGGTTGTGTGT GCTCACTCTGGATTCCACACTGCACTGTTMTMCTCTCAGCAGGCAAAGACCGATTGCATAGGMTTGC TCATTCAAACCCCACCCTAGTTTCCCTGMGGMCATTCCTTAGTCTCMGGGCTAGCATCCCTGAGGAG GGGGAGCCTTTACCACCTTCCTCATGAACCTCAGCACGTGTCTGGATGTGATTCTCTACTACATCGTTTC CTCCTGTMTGGMCCTGTGGTGATAGAGMGACAAAGAGMTATCCCAGAGGATAGCAGCATGGTTTCC TACGAGCAGTTCTTGTTCMCACCTCCATGTTGGTGGACTATGGGGTTGAGGCCCTGGTGGATGCCTTCT ACMGMCTCACTACTGGGCATGGAGGGTGCCMCAGCATCTTTTCCGGGTTCCTGCTCTTTCCAGATAT AAGCCCTTTGTTGTGCGAGGGTGTTTTCCGAGGGGTCACTTCCTTTGGCCTTGAAMT磁TGCGGAGAC CCTTGGMGAGCMGGGACAGTGAGGCAGGAGMGMCMG磁TGGATGTMGCCTGGCCCATMTGTG GCCACTTCCTGGCACCTCCCCCCATGCTTGTCATTTMTTTTGGCCACTTGTAGGTATCAGTGTGATCTG GGTTACCTCCGAMCTGMGATCTCCTAGCCTGTCCCTCTGGGACTGGACMTTGCTTCMGCATTCTTC ACCCCAGAAGTGCTCTGMCCCCMTCCTCAAAATGMGATACTGACACCACCTTTGCCCTCCCCGTCAC GGACTGGCTGCCCCGTGACACATGCTCTMGAAGCTCGTTTCTTAGACCTCTTCCTGGAATAAACATCTG CCTCMCAGGCCCAGGGAGGGMGTGTGAGCGCCTTGGTATGACTTAAAATTGGAMTGTCATCTAACCACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGGAAGMGGTCCATGTCTTTGGGGATGMTTGAGTCTGGTGAC GCCCACCTATTTTGTGCTGGGTTCTACCTTMCCCAGAAGACACTATGMAAACMGACAGACTCCACTC TGTCCGTGGGTGTGCAGTGCCCAGCACGGGACCCGGCTGCAGGGGACCTTCMTAMCACTTGTCCAGTG TTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGAAGGMGGAGCGTGGTGCATTGGACATGGGTCTGACACGTGGAGM GCGCCTGGCCTATTGAAGGTTTTTMTCTTCAGAGTTTCGACTTTATCMCMCACTTAGMGCCACCM GAGMTGCTTMGGGATTCCAATCCCGATCCAAATCATMTTTGTTCTTMGTATACTGGGCAGGTCCCC TCTGAGTCCCAGTTCCCAGTGCAGCTGTAGGTCGTCATCACCTAACCACACGTGCMT嵐GTCCTCGTG GTCTGTCTGMGGMGCMCAGAGAAGTGGGGAATCCAGTCTGCTAGGCAGGAAAGATGCCTCTMGTTC CCCTCAAAATGGCAAATGGCATCTTCTGMCCTCCTTGCGTGAATAAGGTGTCTGACTGGAAGCTGGAGA ACACACTCTGCACCAACCTCACTGGGACACTTTTGCCTTCCCGAAACACTGATGAGACCTTCTTTGGAGT TTCACCTTCCAGTGTCTCGGAGGGATTCCCCTMCCTCATTCCCCMCCACTTCATTCTTGAAAGCTGTG GTTMGCTAAAGCAGTGTTTGCTCCACCTTCATATTGGCTAGGTAGGGTCACCTAGGGMGCACTTGCTC GACATGCCTCCATATGTGCCTTTCTGTTAGCTCTCTTTGACTCAAGCTGTGGGGCTCCTCTATACATGCT CCATACTTCGACTTATCAGGATTCTGGCTGGTGGCCTGCGCGAGGGTGCAGTCTTACTTAAAAGACTTTC GGGACTCTGATMCACCCATTTTAAAGGTTGAGG嵐CMGCCCAGAGAGGTTAAGGGAGGAGTTCCTGC GCATCATGTGCTCCTACCCTGCTCTACCGCTTTTCTGGGTCACAGAGGCCAAATGTGAGAGCATTGAATA GACTMTACACCAGTCCACACTTCTATGACTTCTGCCATTTCMAGACTCATTTCTCCTATAACCACCGC GGTGCTTATCTGACCTTMCAGTGCTCTCATCATGGTGGTGGTTGGGTCCTTGTCCCAGTACCAGTTGAT GGAAAAGATGGAGAAAATGAACAGGACATGGGGCTCCTGG嵐GAAAGGGCCCGGGAAGTTCMGGAAGA TTAGGACAGTCCTTTGCACTGAGTTGACACTCATGCCAACMGMCCTGTGCCCCTCCTTCCTAACCTGA GGGCTGGCCTGGCAGTTGAACAGAGGGAGAGACTAACCTTGAGTCAGAAAACAGAGAMGGGTMTTTCC GCTCAGCCTGCCCAGAAGCCCTTCTCTGATCTCAGCMGATCTTAGTAGTAMGCTAACGGATCCATTGA GGGTTTCCCTGGCTATTCTTCTCATCGGGGTTGTCCTACTGTGCATCTGGMGCTACTGGTGTCATTTCA TGGATACAGAGTTGTCCTTGGAGGATGGAGACAGGTGCAAGGCCMGATGTGATCGTTGAGGCTCAGAGA AGGMCCGCGAGATGGTCTAGAGTCAGCTTACATCCCTGAGCAGGAAAGTTTACCCATGMGATTGGTGG GCCCCGMTCTTCCGTCCCTCATCCTMCTTGCAGTTCACAGAGAAAAGTGACATACCCAAAGCTCTCTG AGACCGTGTGTG嵐TTCTCTTTCCTGTAGTCCCATTGATGTACTTTACCTG磁CAACCAAAGGGCCCC GACACCGG嵐CMT嵐TTGGMCACCTCCTC嵐CCTACCACTCAGGAATGTTTGCTGGGGCCGAMG CGCCCTGTAGCATACCCCTAGGTACCAACTTCCACAGCAGTCTCGTMATTCTCCTGTTCACATTGTACA TCTGMGGATTGCCAGCCCTAGAGTTCCCCMTGAAAAATAGAGCTGTTGGCTTCTCTGAGCTCCAGTGG MGATAAATTGCATGCGGCATGGCCCCAGCCATGAAGGAACTTAACCGCTAGTGCCGAGGACACGTTAM TTACGTATGCCATGCATACCTCCTGCCCCGCGGGACCACMTAAAAACCTTGGCAGACGGGAGTCTCCGACTTCCTGGTCTGMCTCCCGCCACATTTTAGCCGTACTTTGCTMCTGTGCTCCTCACTTCCTCTTCTTC CCCATGAGCCATCATCATGTCTCCTCTCCCATTCGCMTMGCTACCAAGAAGCCCMGATATCAGCCCA TGTGAGACTCTTCCCCCTGACTCCCCCATTGTGTTMGMCCCAGCAACCCAGGAGCCTAGTACAATATA GACCTGCCCTGGGCCACACTGACCCTGATACAGGCATGGCAGMGAATGGGMTATTTTATACTGACAGA CGGGACCCTCCCAGTGAGAAGGGCCTGCTCTGCTTTTCCTGTCTGTATATAACTTATTTGCCCTMGAAC GGGTGTCCAGGGCCCCGTAGAGAGACATTTAAGATGGTGTATGACAGAGCATTGGCCTTGACCAAATGTT TCATCTCTCTGCCCAACCCTTCCCTCACCTTGGCACCAGACACCCAGGACTTATTTAAACTCTGTTGCM TATGGTGTAGTTCTGAGTCCTGAGACTTTTCCGCGTGATGGCTATGCCTTGCACACAGGTGTTGGTGATG CCTGTATTGATTGCCACTGTAGTTTGGTATTTCCCTTTACTTTGGTGGCCTGCTTCCCTCATGCCCTGGA GGGAGGAGTGGAGGTGGGCTGGGCCCTCTCTTCTCACCTTTGTTTTTTGTTGGAGTGTTTCTAAT嵐CT TTCCCTGCTGCCTGTAAATATTTGTTTMTCCCCAGTTCGCCTGGAGCCCTCCGCCTTCACATTCCCCTG TGTCAGGGATGAGTTGAGGTGATATTTTTATGTGCAGCGACCCTTGGTGTTTCCCTTCCTCGGTGGCTCT CCMGTGACTGTGAAACCGTCAGTTCGGMGGCTGGTTAGMCATGTGGGAGCAACATGMTGTTCTACA TTTTCCTTCCCTTCTCCATCTCTCTGGCCCTCTACCCCTGATCTGACATCCCCACTCACGAATATTATGC GGGAAATACGCCA嵐TGTTGACAATGACTGTCTCCAGGTCAAAGGAGAGAGGTGGGATTGTGGGTGACT GGGCATTTTGGTCCMGTTGTGCTTATCCCATAGCCAGGAAACTCTGCATTCTAGTACTTGGGAGACCTG GGCCTGCACTAATTTGATGTTTACAGGTGGACACACMGGTGC磁TCAATGCGTACGTnCCTGAGMG GGTAGTCAAGATTGTGTTTTGAGGTTTCCTTCAGACAGATTCCAGGCGATGTGCMGTGTATGCACGTGT TGATTCCTACCGAGACTCTCCTCATAGTGAAAGGTATGTGTCAGCCATGACCACCCCGGCTCGTATGTCA MTCCTCTCTACAAAAGTGCCATCACGACCACCATCMTCCTCGCTTTCMGAGGCAGACAGTCCCACTC CTTCCTACCCTTCCTCACCACTTCCCTCAGTCCCAACTCCnTTCCCTATTTCCTTCTCCTCCTGTCTTT GAACCMCCACMGCACACAGGMGGAAAGCGCAGGAGGTGMAATGCTTTCTTGGCCAGGGTAGTAAGA GAGAGGGTGGMTATCCAATATTCGCTGTGTCAGCATAGAAGTMCTTACTTAGGTGTGGGGGAAGCACC CCACCTMTCAGGCTGAGGTGTCTTMGCCTTTTGCTCACAAAACCTGGCACMTGGCTMTTCCCAGAG CCTGGCACGTGTGCCACTTGCCCAGCTTCTTGGGCACACAGAGTTCTTCAATCCMGTTATCAGATTGTA AGTTATGACCTTGTCCTGCACGTTCCTCTCACTGGGGCTGMGCCTGTCTGATGTCTGTGGAGGAAGAGA GGATGGMAAGGMGACTAGAGGCTTGCATAATAAGCTAAAGAGGCTGAAAGAGGCCMTGCCCCACTGG GGGCCCAGTGGTTTTACGAATATGGGAATGCCCTGGMGGGTCCACCTTTGTGAGCCGTMAAAGGTTM GGTMGTCCACATAGTGTACTCATGGAAGGAGGGGCTGGGGGTAGMATGTCATGGGTGACTTCTGACTT GTACATTCTTCACCTCCTGGTGCCCTATCCCGCAAAATGGGCTTCCTGCCTGGTTTTTCTCTTCTCACAT GCCMTTCTGCCATAAGCCCTGTCCTCCAGATGTGMCATGGAATCATCMGGAATGCACACTCACCAGC GCTGGTCTTMCTTTAGGTMCTCTGCTGTGCTGGAGATCATCTTTMGGGCAAAGGAGnGGATTGCTGGCAGCC嵐GATTTTGGAGGAGMGGACATTTTACTGCAGTGAGMTGAGGGCCMGAAAGAGTCAGGCC TCTTCTCCAGATTTTTCGGAGGCCCCACTGATGCTGTTCTCTTCTTCATTCTATCMGCCCAGGTGCCAG TCCATCTTCTACCTCTGMTGGCCACCCTTAGACCCTGTGATCCATCCTCTCTCCTAGCTGAGTMATCC CCTGTATGCTGCMCTCATGAACTTGGCCATTCTTTGGGTATGGGACATTCCTCTGATCCTAATGCAGTG CCTGCATGTTCTGTGACTGMGMGATGAGCCTTGCAGATATCTGCATGTGTCATGAAGAATGTTTCTGG CCCATTCCCAGCCCCCTGTTTATTCACGGACATCAGAGTTCTCCAGGACAGTTGCTCACACTTTGTAGM GTCGGAAAAGGGTGTTGGGAGGGTGGTCAACMAGAAACAAAGATGTTATGGTGTTTAGACTTATGGTTG TCTTAAGGAGGCTGAGAGCCCAAACTGCTGTCCCAAACATGCACTTCCTTGCTTAAGGTATGGTACMGC ACTTTGTAGCCCCATCACCCTTGGCCTGCTGGTGGCTGGCGTCCTGGTTCTGCTGGTTTCCCTGGGAGTG CTGACATTGGAGCCTGGGCATCCTCAGGTGGTCAGGCGTAGATCACCAGAATAAACCCAGCTTCCCTCTT GGGGGCTGGCCTCTGGCTCTCATGGGGTCCMGTTTTGTGTATTCTTCAACCTCATTGACMGMCTGM GGTGGCncnCATAGCAGGTMGCCTCTCCTTCTAAAAACTTCTCMCTGTTTTCATTTAAGGGMAGA ATGMGCTAAGAGGCAGAAGGCGGAGATGAAGAGCCAGCCGTCAGAGACAGAGAGGCTGACCGACGACTA GGGATMGGCCCAGCAATCTGCATTTTMCAAGCACCCCAGTCACTAGGATGCAGATGGACCACACTTTG GGCAATTAGCGATATAGCATACCCMACAMGATGTTCTCGATACAGTCTGGCAAAGACTATCCCAAGGT GTGTGTGGGGGTGGGTMGGGAGGGGATGGTTTATGTTGAATGTTTAGTTTTTCTTCTGCATGATACGTC GTAGCMCTGAMGAAGACATCCTGAGCAGTGCCAGCTTTCTTCTGTTGATGCCGTTCCCTGAACATAGG CTCCCTCTAAGTGGMTAGCCTCCCTGTMCTCCAGCTCTGCTCCGTATGCCAAGAGGAGACTTTMTTC CTGCTGTGACTGACCTACAGTGGACTTTCTCTCTGGAATGGAACCTTCTTAGGCCTCCTGGTGCAACTTA MTGACTTTGACGAGTACATCATGGCCATTG虹AGACCATCAAGTCAGGCTCGGATGAGGTGCAGGTTG GCAGGAGAGCAGCAAAATTTATGT嵐TCTTTGACGGGGTTTTCCTTGCTCCTGCCAGGATTA嵐GTCC MGGAGAAAATGMTGCCAAATGGGACACGGGTGAAAATCCTATTTATMGAGTGCCGTMCMCTGTGG CCCACAGTGCCTATTGATACTTGGGGAGGGTGCTTGGCACTTATTGMTATATGATCGGCCATCAAGGGA GGCCMGTGTTGCCTGCCACCMTCAGTAAGTTAGTCTATMCAAATTTTACCCTMCAGTTTTACCACC GCTCAACACATCACCTCGGACMATTCAGGAAGCATTTCTTTAGCCCACAAGTCCAGACCCAGGTGCTCT CGGGAGGAGCCACGCGTGAGCACACCTGACACGTTTTATMTAGACTAGCCACACTTCACTCTGAAGMT ATGTCTTTGCTGCAGAACTGAAGAGACTAGGCGCTGGGGCTCAGCTTCCCTCTTMGCTAAGACTGATGT GCATCCTTCTGCCTGTTTCTGTMGCAAATGCCACAGGCCACCTATAGCTACATACTCCTGGCATTGCAC GCGCAGGTGGGCTGGACTTCTACCTGCCCTCAAGGGTGTG窗ATTGTATAGGGGCMCTGTATGAAAAA GGACCCMCTGAACTGMCTMTCCTTCTGGCAGATTCMATCGTTTATTTCACACGCTGTTCTAATGGC TGCACCCAGMCAGTGGTGGCMCATTCATTGCCMGGGCCC嵐GAAAGAGCTACCTGGACCTTTTGTT CTCTGTTTAGAGCMGGGCTCAGAAAACAG嵐TACTGTCATGGAGGTGCTGAACACAGGGMGGTCTGG<formula>formula see original document page 16</formula>GGGGTGGGGCTGCGGGGGTTCCGTGTCCACCCCCATACATTTATTTCTGTAAATAATGTGCACTGAATAA AAMGATTATGAGCCTCCATTTGGTTCCAAGGTGCGGGAGCACCCCTGTGTCGMAGCATGAAGGACMC CCCCATCTTCCMGGGTTGMTTCTGGAGGMGAAGACACATTCCTAGTTCCCCGTGAACTTCCTTTGAC AMTAATGCCCAGTCTTCTCCCCAAAGTCMGCMGAGACTAGTTGAAGGGAGTTCTGGGGCCAGGCTCA CCCCTCTCTGCATGATCTTGTTGAGGCATTTAGCTGCCATGCACCTGTCCCCCTTTAATACTGGGCATTT GGCGTGGACTTACTATTTATTGCTGAATGACTACCMCAGTGAGAGCCCTTCATGCATTTGCACTACTGG GCTGTGGTTGGACTGAGTCTCTGTATTGCGGCGTGTATACCMTGCATGGCCCTCTTCTGATTTCAGGTT CTGCTTTGCCCCMGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGG嵐GTGTACGCCCTGTA ACTCTCTTCCCTTTCCCCAGCATCACTCCCCMGGMGAGCCAATGTTTTGGACCCATAATCCTTTCTGC TATTT磁TGAGTGTGTTTGTCACCGTTGGGGATTGGGGMGACTGTGGCTGCTGGCACTTGGAGCCMG TCACCMTTMCCAGAAATCCAGTTATTTTCCGCCCTCAAMTGACAGCCATGGCCGGCCGGTGCTTCTG GCATCAGGMGGCCCAGCTGAAATCAGAGMTCTGCTCGMGMGAGAATTAGGACCTGCTATCCACTGG GTGTGAGTTGAGTCTCCTCTCTGAGACTGCTMGTAGGGGCAGTGATGGTTGCCAGGACGMTTGAGATA GCATCTTCGMCTCAGCCATGTGGTCMCATCTGGAGTTTTTGGTCTCCTCAGAGAGCTCCATCACACCA ATCAGGGATCCMTATGACTCAGAGAACCAGTGCAGACTCMGACTTATGGMCAGGGATGGCGAGGCCT CAGTGCACCTACTTCMGTTCGAC磁G嵐ACAAAGAAMCACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTG GGTGCCCACCATTCTTGGCCTGTTACTTACCTGAGATGAGCTCTTTTMCTCMGCGAAACTTCAAGGCC CCCCMGATTCACACCTGACTCTG嵐TCTGAAGACCTCGAGCAGATGATGCCAACCTCTGGAGCAATGT ACACAGAT嵐G嵐CTGTGCTCGTGGCGGGATMGMTTCGGCGGCATGTGTGGTGTACGAGGACATGT GGGAGGMCTCCTTGCACACACCCTGAGCTTTTGCCACTTCTATCATTTTTGAGCMCTCCCTCTCAGCT GGCAAAGTTATCAGAGGATGGGATGAAGCTCTCTTGACTATGAGTMAGGAGAMAGGCTCGACTGGAGA TTTGCTTTTTAGCAAATCTGCTGTGGCAGGCTGTGGATTTTGAGAGTCAGGGGAGGGGTGTGTGTGTGAG TCCTTTGGTAGGMTGGCCTGAGTTGGCGTTGTGGGCAGGCTACTGGTTTGTATGATGTATTAGTAGAGC TCACTGATGTCATTGCCACTCTGCTCCTTGCTTTGGGAGTCTTCTGCTTTGCTGGACATGAGACTGGMG CGGAGGCTGAACMTAGGCTGTTCCCATGTAGCCCCCTGGCCTCTGTGCCTTCTTTTGATTATGTTTTTT CCTTCGGAGTTACCTAGCGGACMTGATGGAGAGATCTATGATGATATTGCTGATGGCTGCATCTATGAC CCCACCCCAGCCTCAAAACCTCTTCCTGACGACCCCCGCCCCGTGTGATTTGTTTCATTGTTAATATMT GCCAGGAGTGTTAAGCGTTCAGTGATGTGGGGTGAAAAGTTACTACCTGTCAAGGTTTGTGTTACCCTCC GGCTGATCTTAAG嵐GCTCAGGGGATAGCACCAGMGATMAGCTATCCAGGCAGMTTGCTGAAAGTC CTACCTCCCCATACCTCCATCCCCCATGCCCCACTTGATTTTAACTGATTCCTCTCCTGACCCTTTACTA ACTCTGGCTGGGGMGGCATGAGTGACAGACCCACAGCAAGGCGGTGGGGTMGTGTGGACCTTTGTGTA CCCAGTCAGTCACCGCCTCTGCGCTGTTCCTCAGGTGTMTATTGTTAAGAAAGAMGGGGCMGGAAAGCTTATTGCAAAATAGCATTTGTTTAAGGGTGATAGTCAAATTATGTATTGGTGGGGCTGGGTACCAATGC CCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGATTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATG TTGMCTAGGCTGAGCMTCTGACCCTATGGGTCTAGGACACAGTTCCTGGGMCATCACATTCCTCTGC GTGGTGTTCAGTGTCAGACCTCTTMTGGCCAGTGMTMCACTCACTGCTGGCATTTAATGTGCAGTAG GTCACTATTGAAATGGCATCMCATGATGCTGCCCATTCCACTGMGTTCTGMATCTTTCGTCATGTM GATGGCTGCCCATACCATGGG嵐TGCCACTGTAGGTCGTCGATACCTCTGGCTGMGGATTGCAAAATT GGGAAGMCCAGGATGCAGGGCTGGCTCAGGGTCTGCGCMGATGTTTGGCTGATTAAAAGTTAAACCTT AGATGTCCCTTTCTTGGCCAGTTATCCCTTCCTTTTAGCCTAGTTCATCCAATCCTCACTGGGTGGGGTG AGTGGACAACAGGTTTTCACCATAGCCTACGTTMCCCATTTTTGAGCCMGCTTCMCCCTCAGCCTTG MCAGGMGTCATC磁GGTTTTGMGAGGGTGCAGCCCAGATGAGCTTGGGGCAGAGGGCGAAGCTGAC CTGCATCTGTGCAAACGGGCGGCAMCTGTGTCCTGGGCAGTAACCCCAMGTCATTAGGAAATGTGMT GGAGGMGGTGGGMGCAGATGACTGAGGAAGGGATGGACTMGCTMTCCCCTTnGGTGGTGTTTCTT TCACAGCACCATCCAGTACTGTGACTTCTCCCCACAAAACCATTTGGCAGTGGTTGCTTTGTCCCAGTAC ATACGGGAGMCTMGGCTGAAACCTCGGAGGMCMCCACTTTTGAAGTGACTTCGCGGCGTGCGTTGG CCCTCGATCATATTTCCCCTTGGACACTTGGTTAGACGCCTTCCAGGTCAGGATGCACATTTCTGGATTG GGCCMGTGTTGCCTGCCACCMTCAGTMGTTAGTCTATMC嵐TTTTACCCTMCAGTTTTACCACC TCTGTGCTGGAGCATGCCCGTATTTATGGAGTTCAGACACTCAGCACAGCAGGGTCCTGAGCTTATATM AGAGAGGGATGG嵐GCTTCCATACAACTGGAGTAA嵐TGGTTTMAGAAGAGGMACTGAC磁CCCG CCCTGTGCTTCTTATGTAAGAATCCTCCTGTGGCCTCTGCTTGTACAGAACTGGGMACAACACTTGGTT GGTGCATCCTGGGGTTGGCTTTAG嵐CTMACTTCTCCAAAAGGACAGGGCAGATTGTMACGTCGTCT GCCCCTTGTGCTCGCCTCATAGGTGTCTATTTGGACTCTAAGCTCTACGGGTGACAGATCTTGTTTCTGA TTTGACTTCTGGGMCTTGGTTCAGATGTCCCTTTCACTGTATGTCCTCTGACCCCTTTGGCMGGTTGC GGGGAGGCATCAGTGTCCTTGGCAGGCTGATTTCTAGGTAGGMATGTGGTAGCTCACGCTCACTTTTAA TGTTGCCATAGCMCTGGAGGCGATGGGGCAGTGMCAGMTMCMCAGCAACAATGCCTTTGCAGGCA GTCCCACCCCGCGAGMCACTTTACMCGACGAGGAGATTCGTTTCCMACCAGAGGAGATCAATTGTAC ATTGTGCCTATCCTTGAGMGATGCAGGACAAGTAGGACTGGMGGTCCTTGCCTGAACTCCAGAGGTGT GTGCAGGAGACATTGGTATTCTGGGCAGCTTCCTMTATGCTTTACAATCTGCACTTTMCTGACTTAAG ACACACTTCCTGCTGCG嵐GACCCACATGCTACMGACGGGCA嵐TAMGTGACAGATGACCACCCTG CCATCCACTACAGTGAGCAGGGAGTGGAATGGAAACCATACAGGCTGAAATCCTCCATGGTGGACMGAT GATGGGTGTGTCATGTTGCGTGTGTCTGTCTGTGAGCCTTTCACACCTGTGCTGGCGCTGGMAATTATT TGAGACCAGAAAGCTGGGAGCCCTGCGTGGAGGTGTGAMTCCAGACAATTGAAGATGGGGCATATCAGA AAGMGGAGAGCATAGG嵐CCACACAGACTTGGGCAGGGTACAGACACTCCCACTTGGCATCATTCACACTCTGGGACTTMGCTGCTATATCCCCTCAGAGCTCAC磁TGCCTTTACATTCTTTCCCTGACCTCCTG TTTCCCCMTTACAGGGTGACTCACAGCCGCATTGGTGACTCACTTCAATGTGTCATTTCCGGCTGCTGT CCGCTGCT嵐CACACTGCAGGAGGGACTCTGAAACCTCMGCTGTCTACTTACATCTTTTATCTGTGTC CCTCCAGGTTTCCTTAAGGGACMCATCCTTAAGTCAAAAGAGAGAAGAGGCACCACTAAAAGATCGCAG GGGCGAGCACGGMCMTGGGGCCTTCAGCTGGAGCTGTGGACTTTTGTACATACACTAAAATTCTGMG GAGGTGTATATAAAGAGTACCGAGACTGGCCAGTACTTGGCCATGGACACCGACGGGCTTTTATACGGCT GGCCCACACCTTCCTCCAGAGAAAAAATGATCCCTATGCTCTTGCATCCCTGGTGTCCTTTGMGTTAAG AGGACMGCTGCAGCGGCTACAGGAATTGGAAGGCACCTATGAGGMAATGAGCGGGCACTGGAGAGTAA CCGAGGTTCCCACTCTGGGCAAAGCCCCTCACACTGCAAGGGATTGTAGATMCACTGACTTGTTTGTTT TACTGTTGAGATCTCCCCTGGACCCCGGATTGCTGCTCAGATTGGAGACTCAGTCATGTTGACATGTAGT TTTT嵐TMGGACCCCAAAGAGAGGCTCGGCTGCCGGCCACAGACTGGATTTTCTGACATCMGTCCCA GACTTG磁TACTACTTACCATATGTGCTTGCCTCAGTAAMTGMCCCCACTGGGTGGGCAGAGGTTCA CATGGACGAGGCTCAGCGGGMGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCCTAGGTTCCCATA TACCCCTACCTCAAAGGMCAGAGTGGCAGCAGTACCAATGGCAGCMTGGCAGTGAGTCTTCCMGMT AGCCACCTTCMGG嵐CCAGTTGAGGAGGMTTGMCTCAGGACTCAGAGTAGTCCAGGTGTTCTCCTC AAAAACCCGTCMTGTACTAGGGTACTGCTGCGTCATTACAGGGCACAGGCCATGGATGGAAAACGCTCT TCATCCAGMTGTGAACMGAGCCATGGGGGCATATACGTGTGCCGGGTCCAGGAGGGCMCGAGTCATA GATCGGAGGACCGGTACCGGAATCCCAAAGGATTCAGCACCTTGGCACAGCTG織CAGAGGAACACGCT CAGCTAGTTAGGAGCCCATTTTTTCCTAATCTGTGTGTGCCCTGTMCCTGACTGGTTMCAGCAGTCCT CTGCACAGTGTCCACCCTGTTCCCACTCCCATCTTTCTTCCGGACMTG嵐TAAAGAGTTACCACCCAG CAC磁GTTGTGTGAAGCAGMGAGAAAAGCTGGAGGAAGGCCGTGGGCMTGGGAGAGCTCTTGTTATT GAGGAAMGCAGCTCAAGMCACATGTGCAGTCACTGGTGTCACCCTGGATAGGCMGGGATMCTCTTC CCTCCMGGGTTTCGACTGGTCCAGCTCTGACATCCCTTCCTGGAAACAGCATGAATAAAACACTCATCC ATCAGCCCGGACAGGGTCTACATCAACTATTACGACATGMCGCGGCCMTGTGGGCTGGMCMCTCCA GCCCCMGGACAGTTGTCAGTGGCCTGGTGMTCATGTTCCTCTTGAACAGATGCMMTCGGATGGTGA GGCCAGCAGGCACCTGAGTGGCTGGGACMGGGATCCCCCTTCCCTGTGGTTCTATTATATTATAATTAT TTATGGTACAGATACAAACTGGACTCTCAGGACMAACGACACCAGCCAAACCAGCAGCCCCTCAGCATC TCTTATTTMCACCCCACACCCACCCCTCAGTTGGGACMATAAAGGATTCTCATGGGAAGGGGAGGACC TCMAAAAGCMTCCAACCCACTGCAGMGCTCTTTTTGAGCACTTGGTGGCATCAGAGCAGGAGGAGCC ATATGTATTCCTGATCGCCAACCTTTCCCCCACCAGCTMGGACATTTCCCAGGGTTMTAGGGCCTGGT GCTGCCTATTGAGTGGTATAGCTGTATGCTTACCCAAAAAAGGGMCACTGTGGTTATGACTTGTATTAT MG嵐GCCATGAGGTCTTCMTACTGTTTTACCCCATCCCTTGTGCATATTTCCAGGGAGMGGAAAGCGGGCCCAAACCTATTTGTAACCAAAGAGCTGGGAGCAGCACMGGACCCAGCCTTTGTTCTGCACTTAAT CACCAGACCATGCTTCAGTGAGAGACTGTCTCAGATGACCMTACCACCATGC嵐CAAGATACCCACTG AGGCACCATCTMTAGCGGGTTACTTTCACATACAGCCCTCCCCCAGCAGTTGMTGACMCAGAAGCTT CTGAGGTACCTGMCTTCTTTACMAAGCCACTCCACTCTCTTCMCGGTGACACTCAGTATGTCTGCAG CTGATGGGTTTCTCCAGAGGGMTTGCAGAGTACTGGCTGATGGAGTMATCGCTACCTTTTGCTGTGGC GGAGCCACCCMGGGAATGATCTCTGATGACCTAACCTMGCA嵐CCACTGAGCTTCTGGGAAGACAAC TGGCTCCCCTCCTGGGGTTGTMGTTTTGTTCATTCATGAGGGCCGACTGTATTTCCTGGTTACTGTATC CCCTGGAGCCCGTGGGTGCACCTGTTACTGTTGGGCTTTCCACTGAGATCTACTGGAT嵐GMTAAAGT GGGAACCACGTCTGCTMCTTGGAGCCCCAGTGCCMGCACAGTGCCTGCATGTATTTATCCMTAAATG CTTCTGCTCATTGATGGGAAAAACCGAGGTTCCAGATACCAGTGCACATTMCGCATGCTGCAGGGTACC GCTCCMGGCTCTGCACCATGCCACACACTTGCTGTMGGCTAGMGTGMGACCTTATTMTAGGAGCA GGCCTTGGACTCTTCCCTGAGGGTTGCCTG嵐TTCCTTCATGCTTTCTATTCAGGACTMTTCCCTTAC GCMGATCTACTACATCCCACATTAGTGTTCTTTATATACCTTCMGCAACCCTTTGGATTATGCCCATG ATATGATGGGTGCTTTGAGTGTGAATGCAGCAGGCTCTCTTGTTTCCGAGGTGCTGCTTTTGCAGGTGAC GCCTGAGCACCAGGMCCAGGAGACTTACGAGACTCTGAAGCATGAG嵐CCACCACAGTAGCTTTAGM GGTCCAGGTACTGAGGGACAAGTAG嵐GATTTGMACAGTTGGCATGGAGGCTGCGACTGATGAAGGCA TCMCCCTACCCCAGGCAGCMTGCTATCTCAGATGCCTACCTTMTGCCTCTG嵐CAACCACTCTGAG CCCTCCCTGGTCTCCTGCTTCAGCTCTGTACMCGAGGGC綴GATGCT嵐TCTTGCTTTGCATTCAGT TGAGAGCTGGGCTTTCCTCTGTGACCATCCCGGCCTGTAACATATCTGT嵐TAGTGAGATGGACTTGGG ATACTGTAGTATTCTTTGGGGTGCCCCTCTCCTTCTTAGCTATCAnGCTTCCTCCTCCCCAACTGTGGG GAGCCTCTGGAATGCATGGGGCGGGTCCTAGCTGTTAGGGACATTTCCAAGCTGTTAGTTGCTGTTT磁 AGMGTCCTGATGTGAGGAGAGGTGCGGGGAGACATTCCAAAAATCAAGCCMTTCTTCTGCTGTAGGAG CAGTGTGTTGGCTTTCTGGAAACATGGGATGCAGGGTAAAAGCTTCMGTCAGATGAGGTTACCCAGGAG CCACCACTGTGGGTTGCAGGCCCAATGCAGAAGAGTATTAAGAAAGATGCTCAAGTCCCATGGCACAGAG CTGTTGCCCATTGCACTTACATACCACCACCAAG嵐GCCTTCAAGATGTCMATMAGCAAAGTGATAT GTCAGGGGCTATCTTTTGGTATACTTGTGTG嵐GTGGCTGGTTGGGAGCAGAGCTAAGTGGCTTCCCAT TCCCACCCAG嵐CCTTGGATACTGAGTCTCCTMTCTTATCAATTCTGATGGTTTCTTTTTTTCCCAGC AACTGACCGACTTCCTGCAGGCGGAGACTGAC嵐CTGGMGATGAGAAATCTGGGCTGCAGCGAGAGAT TCCGMTCCTGCTCCMGGCTCACCGCAGMGCAGTAGCAGCGGGGACCMTCATCAGACTCCTTGMCT GGCCTTMGMGGGGTTAGTGCATCTTTCAGGGGTCACTCTGCCATGGGGATAAAATAGCTGTnCACAA CAGGTATCCTGGGTGMGCCTGTTTGCCTCTCTTGAAAATGGCAGGTGCTCTTGTTTTACCCATGTTGGG CTGGGCACTCTGCCTCTGGGAGAGAGGMGMGAAAGGGGCCCCATTTTTTMMATCTGTACAGAGCCTCTCCTGGCCCCMTACCCATTTTGGMGCCCCTGTGGCCGTGTGGATGTCGGTAACAGTTGTATAAMTA CCATGACCACTGCCCTGGAGGTGGCGGCCTGCTGCTGTTATCTTTTTAACTGTTTTCTCATGATGCCTTT MACGAGTGTGTGCTGGAGMGGCCTGGCTCGCATGGAGTTGTTTCTTTTGTTGTGTGCCATTTTGCAGC GGTGAGTTGTTTTGAACAGAACTGTTTTTTCCCCTTCCTGTMGACGATGTGACTGCACAAGAGCACTGC GGGAGAGGACTTACTCAGAGACCCCAACAGGTGATACTGCACAAAGCCTGGTTCTTCAATTTTCCTACCC GMGGGTAGGGCAGCCAGAG嵐GGAGCAGAGMGGCACACAAACGAGGAATGAGGGGCTTCACGAGAGG MTGGGCTGCTGCTTAGCTTGCACCTTGTCACATAGAGTGATCTTTCCCMGAGMGGGG線CACTCGT 嵐GCGTAGACMGGAGATGCAGGTATTGGTGAGTCGGATCGCAGCTTGGATGGCCACTTACCTGAATGA GCAGGTGMGACTTCATAGAAGGCGACAGATAGATTGGGAGGCTATTGAAGCAGTTTTTCTGMGCCTGC GTCTTTCTGTAGCCTCTGCATACTACTGGCTGTCATCACACCAGCGTACAGTAGCTAAATTTTTGGTGCA AATTTMGACTCTCGCATCTTCCCMCCCCTTMGCCCTGGCCCCCTGAGTTTCCTTTTCTCGTCTCTCT CTGCCAGCTCCAGMGATGTAGAGAC雄CTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCMC
權(quán)利要求
1. 一種移植腎功能檢測(cè)核苷酸芯片，其特征在于由基質(zhì)尼龍膜(1)、 點(diǎn)樣區(qū)(2)、固定在尼龍膜(1)表面矩陣分布的經(jīng)修飾及雜交的寡核苷酸探針(3)組成，寡核苷酸探針(3)具有SEQIDNOl的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植腎功能檢測(cè)核苷酸芯片，其特征是點(diǎn)樣 區(qū)(2)矩陣排列為12X8，每個(gè)矩陣包括5X3個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)的直徑為0.6mm，點(diǎn) 間距為1.5^m。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片的制備方法，其特征是通過(guò)以下 技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1) 根據(jù)已發(fā)表的參考文獻(xiàn)及移植免疫學(xué)知識(shí)，篩選出免疫相關(guān)性基因 449條，合成70bp長(zhǎng)寡核苷酸序列，由芯片制備機(jī)器人的直徑為0.6mm的96 針點(diǎn)制于尼龍膜上，點(diǎn)之間的間距為1.5mm;(2) 寡核苷酸探針液體濃度稀釋，稀釋成15umol/L的終濃度；(3) 芯片雜交前經(jīng)Ultraviolet crosslinker交聯(lián)處理，60mJ/cm2，使寡核苷 酸固定在尼龍膜上；(4) 芯片雜交過(guò)程RNA樣本在逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈摻入同位素33P， 逆轉(zhuǎn)錄同位素標(biāo)記體系，雜交液，0.5mol/LNa2HPO4緩沖液，PH7.2， 7%十二 垸基硫酸鈉，在雜交爐中5(TC預(yù)雜交2小時(shí)，然后將已變性好的cDNA樣品 加入雜交管中，5(TC雜交過(guò)夜，然后用洗膜液5(TC洗兩次，涼干；(5) 數(shù)據(jù)提取與分析尼龍膜晾干后用保鮮膜包好，用磷屏壓膜放射自 顯影72小時(shí)，掃描儀掃描磷屏，使放射性信號(hào)轉(zhuǎn)換為可視化圖像。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸芯片的制備方法，其特征是洗膜液 由2x氯化鈉一檸檬酸鹽緩沖液、0.1%十二垸基硫酸鈉組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征是采用接觸式打印的 方法將寡核苷酸探針固定于尼龍膜上。
6. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片在移植腎功能檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種移植腎功能檢測(cè)核苷酸芯片，由基質(zhì)尼龍膜(1)、點(diǎn)樣區(qū)(2)、固定在尼龍膜(1)表面矩陣分布的經(jīng)修飾及雜交的寡核苷酸探針(3)組成，寡核苷酸探針(3)，具有SEQ ID NO 1的序列，采用接觸式打印的方法，將由BIO BASIC INC(Canda)公司合成的特異性代表一個(gè)基因的70bp的寡核苷酸片斷點(diǎn)樣于尼龍膜上。本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，可早期、快速、廉價(jià)、準(zhǔn)確檢測(cè)移植腎功能，可在移植腎功能檢測(cè)中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101122562SQ20071007024
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者強(qiáng) 何, 浩 楊, 茅幼英, 董海濤, 陳江華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)