專利名稱：：產(chǎn)輔酶Q₁₀新菌株——鞘氨醇單胞菌ZUTE03及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株產(chǎn)輔酶Qw新菌抹一一鞘氨醇單胞菌ZUTE03及其應(yīng)用，屬于微生物制藥領(lǐng)域。(二)
背景技術(shù)：
：輔酶Q,。(CoenzymeQiQ,CoQ川)廣泛存在于動物、植物及微生物體內(nèi)，是生物細(xì)胞呼吸鏈中重要的遞氫體，也是一種良好的生化藥物。它具有抗氧化性、消除自由基、提高機(jī)體免疫力等功能，已廣泛應(yīng)用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。制備輔酶Q,。的方法主要有動物細(xì)胞提取法、煙葉茄尼醇半合成法、完全合成法、微生物發(fā)酵法或植物細(xì)胞培養(yǎng)法。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)物活性高、原料成本低、易控制及可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等特點。獲得優(yōu)良的發(fā)酵菌林是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Qu)的關(guān)鍵之一。目前已報道的輔酶Qw發(fā)酵菌抹主要有假單胞菌屬、酵母菌屬、光合細(xì)菌屬以及副球菌屬等。發(fā)酵菌體提取輔酶Qu)方法多為醇堿皂化后提取方法，步驟煩瑣，費時費力，且提取溶劑損耗較大。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一抹產(chǎn)輔酶Q,。產(chǎn)量較佳的新菌抹，且利用該菌種發(fā)酵液制備輔酶Q1()時采用同步皂化和提取工藝，簡化提取工藝，節(jié)約人力與試劑，在保證產(chǎn)物幾乎無損失條件下，提高提取工藝效率。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是產(chǎn)輔酶Q!o新菌抹——鞘氨醇單胞菌ZUTE03(Sp/n'"gomomwsp.ZUTE03),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2007年6月18日，保藏編號CCTCCNO:M207084。所述鞘氨醇單胞菌ZUTE03特征如下菌林在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上培養(yǎng)1天后呈亮黃潤澤，較小，圓形，邊緣齊整，表面光滑，易挑起，產(chǎn)黃色素；菌體呈桿狀，大小為(0.200.36)^imx(0.400.80)jim，具極生單根鞭毛，能運動，革蘭氏染色陰性，無芽孢；好氧，過氧化氫酶陽性，還原硝酸鹽陰性，利用葡萄糖、乳糖等產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲咮，最適宜生長溫度為28~30°C。ZUTE03菌林，分離自錢塘江沿岸杭州九堡段土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、BiologGN鑒定和16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該菌抹屬于鞘氨醇單胞菌屬，命名為S;/H'"gomomwsp.ZUTE03。目前國內(nèi)外尚未見到有關(guān)鞘氨醇單胞菌應(yīng)用于輔酶Q1Q生產(chǎn)的研究報道。發(fā)酵菌體中同步皂化和提取輔酶Q10的工藝同樣未見報道。鞘氨醇單胞菌ZUTE03主要用于發(fā)酵制備輔酶Q10。具體的，所述的應(yīng)用為以鞘氨醇單胞菌ZUTE03接種于適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基，2528X:下培養(yǎng)2436h，所得發(fā)酵液離心收集濕菌體，濕菌體經(jīng)皂化提取得到所述的輔酶QK)。優(yōu)選的，所述皂化提取為同步皂化提取，即急化與提取同步進(jìn)行。具體的，所述適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基按如下配方配制每加入1000mL水加入碳源10~20g、氮源5~15g、KH2P040.5g、Na2HPO41.5g、MgSO40.5g，pH6.0~8.0。所述氮源優(yōu)選為硫酸銨。所述碳源優(yōu)選為葡萄糖。優(yōu)選的，所述適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基按如下配方配制每加入1000mL水加入葡萄糖15g、硫酸銨10g、KH2P040.5g、Na2HP041.5g、MgSO40.5g，pH8.0。具體的，所述同步急化提取工藝按如下步驟進(jìn)行將濕菌體2g移入容器內(nèi)，加入0.30.7g焦性沒食子酸，12.5gKOH，10~20ml甲醇，3~7ml蒸餾水，混勻，同時加入C5C10的烷類試劑30~70ml，在70~90°C水浴鍋中回流，急化并同步萃取產(chǎn)物3060min，迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗，劇烈振蕩后靜置分層取上層有機(jī)相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀5(TC下將其濃縮至510ml，后放入冰箱冷凍，析出膽固醇，過濾，取濾液，即得輔酶Qu)。本發(fā)明方法省去了輔酶Q1()傳統(tǒng)提取方法中皂化后有機(jī)溶劑多次萃取的步驟，在皂化除雜的同時以提取溶劑對發(fā)酵菌體進(jìn)行萃取，此同步皂化提取方法節(jié)約了提取時間，并且，經(jīng)多次對照實驗，最終證明此同步皂化提取方法對發(fā)酵菌體中輔酶QK)的獲取不會造成損失，且提取溶劑回收率較高，減少了提取試劑的消耗，提高了發(fā)酵菌體中輔酶Qu)提取工藝的效率。本發(fā)明工藝參數(shù)經(jīng)單因素實驗、正交實驗多次平行驗證，為該方法最優(yōu)條件，即皂化溫度70。C90。C，皂化時間3060min，菌體皂化同時加入提取溶劑30~70ml。圖1為鞘氨醇單胞菌(Sp/z/"gomo"ossp.)ZUTE03的電鏡圖(放大20000倍)；具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例1:鞘氨醇單胞菌(Sp/z/"gcww"ossp.)ZUTE03的分離、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)輔酶QK)特性1、菌抹的分離(1)采集樣品采集錢塘江沿岸杭州九堡段土壤樣品后，取10g，加無菌水90mL,制成土壤懸浮液。(2)菌抹分離取菌懸液lmL，稀釋105倍，于選擇性平板上劃線，選擇性培養(yǎng)基(g/L)成分為異戊二烯0.5ml,(NH4)2S04l.Og，KH2P044.5g,Na2HP04'12H2021.6g,瓊脂1520g,水1000ml,pH7.0。按照微生物純種分離的常規(guī)方法，將上述分離培養(yǎng)基于28。C放置2~3d。挑取多個單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基上，并編號保存。再在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵性檢驗，結(jié)果得到一抹輔酶Qu)產(chǎn)量較高的菌抹ZUTE03。所用的培養(yǎng)基為葡萄糖20g,蛋白胨10g,酵母膏10g，KH2P040.5g，Na2HP041.5g，MgS04.7H200.5g，PH7.0。(如為固體培養(yǎng)基，再加入20g/l000ml瓊脂)。2、菌抹的鑒定(1)輔酶Qn)生產(chǎn)菌ZUTE03的菌體及菌落形態(tài)特征輔酶Qu)生產(chǎn)菌ZUTE03為桿狀，大小為(0.20~0.36)拜x(0.40~0.80)pm，革蘭氏染色陰性，無芽孢，具極生單根鞭毛；菌落呈亮黃潤澤,較小，圓形，邊緣齊整，表面光滑，易挑起，產(chǎn)黃色素。(2)輔酶Q!o生產(chǎn)菌ZUTE03的生理生化特征生理生化特征為好氧，過氧化氫酶陽性，利用葡萄糖、乳糖等產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲咮。上述菌學(xué)特征與文獻(xiàn)(常見細(xì)菌鑒定手冊)編錄的鞘氨醇單胞菌的生理生化性狀相吻合。結(jié)合菌4朱的16SrRNA序列同源性分析和Biolog系統(tǒng)分析結(jié)果，該菌珠鑒定為屬于鞘氨醇單胞菌屬的產(chǎn)輔酶Qu)新菌珠(5^/z/wgo附owossp.)。3、產(chǎn)輔酶QK)性能將鞘氨醇單胞菌(5^/"gomowossp.)ZUTE03以6%接種量，接種于液體培養(yǎng)基(碳源20g，氮源10g,KH2PO40.5g，Na2HPO41.5g，MgS040.5g，水補(bǔ)足至1000mLpH7.0)，以硫酸銨為氮源，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖這幾種常用碳源作為發(fā)酵的碳源，考察其對細(xì)胞生長總量和輔酶Q,o總量的影響，進(jìn)行碳源的單因素研究。結(jié)果如表1所示，表明碳源的利用對菌生長量和輔酶Qn)產(chǎn)量影響較不均勻。蔗糖對菌生長最有利，但輔酶Qu)產(chǎn)量卻最低，葡萄糖對菌生長量的影響最小，但輔酶Qn)產(chǎn)量最高，從菌生長量和輔酶Q,o產(chǎn)量之間的比例關(guān)系來看，葡萄糖為最佳碳源。同理，氮源的結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明有機(jī)氮源中以蛋白胨為最佳，其與無機(jī)氮源硫酸銨比較，雖然無機(jī)氮源不利于菌大量豐富的生長，但單位菌體的輔酶Qu)產(chǎn)量可以達(dá)到有機(jī)氮源的水平。表1:碳源對ZUTE03輔酶Qw產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2:不同有機(jī)氮源對ZUTE03輔酶Q1()產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在以上基礎(chǔ)上進(jìn)行葡萄糖濃度添加的影響研究和以硫酸銨和蛋白胨及各種無機(jī)與有機(jī)氮源的組合氮源的比較研究。結(jié)果如表3、表4和表5所示，結(jié)果表明①過少的碳源加入量，影響菌體的生長量，因此使輔酶Qu)的產(chǎn)量隨之下降。而過多的碳源量，可影響其生物代謝途徑，既浪費原料，也不能使產(chǎn)量有所提高，且在一定程度上影響了菌體的生長。因此確定碳源葡萄糖的加入量為15g/L。②氮源研究結(jié)果顯示，菌體生長量和輔酶Q,。的總量均沒有有機(jī)氮源的促進(jìn)作用明顯，但就單位產(chǎn)值計算，硫酸銨超過了蛋白胨單一氮源和其他組合氮源的水平。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，硫酸銨的成本也更低，因此，選擇硫酸銨為最佳氮源，加入量為10g/L。表3:葡萄糖濃度對E03輔酶Qu)產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4:無機(jī)與有機(jī)氮對ZUTE03輔酶Qn)產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(各5g/L)表5:組合氮源對ZUTE03輔酶QK)產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>配制不同pH值的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖15g,(NH4)2SO410g,KH2PO40.5g，Na2HP041.5g，MgS04'7H200.5g，水1000ml),考察其對細(xì)胞生長總量和輔酶Qn)總量的影響。結(jié)果如表6所示，表明初始pH為8.0時發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q,o最佳。表6:pH值對輔酶Qu)產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>溫度既能影響反應(yīng)速率和發(fā)酵液的物理性質(zhì)，也能改變代謝產(chǎn)物的合成方向，進(jìn)而影響發(fā)酵動力學(xué)特性。溫度的優(yōu)化結(jié)果如表7，表明最佳發(fā)酵溫度為25。C。在此條件下，由菌林鞘氨醇單胞菌(5^2/"gowo"wsp.)ZUTE03發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q化的產(chǎn)量最高，達(dá)到了36.09mg/L,比優(yōu)化前提高了483%。表7:溫度對輔酶Qu)產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2:對鞘氨醇單胞菌(5^n'"gomo"ossp.)ZUTE03發(fā)酵菌體提取輔酶Qn)工藝的優(yōu)化與簡化將鞘氨醇單胞菌(Sp/2/wgomowossp.)ZUTE03以6%接種量，接種于優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖15g,(NH4)2S0410g,KH2P040.5g,Na2HP041.5g,MgSO40.5g，水1000mlpH7.0),培養(yǎng)溫度25。C,200r/min搖床培養(yǎng)時間36h后取發(fā)酵菌體，收集發(fā)酵液，15000r/min離心15min，傾去上清液，取菌體，用蒸餾水充分洗滌，離心得發(fā)酵菌體。將菌體移入150ml圓底燒瓶內(nèi)，分別以傳統(tǒng)急化提取法(具體方法將濕菌體2g移入容器內(nèi)，加入0.7g焦性沒食子酸，2.5gKOH，19ml曱醇，7ml蒸餾水，混勻。在90。C水浴鍋中回流30min,用自來水迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗，加入正己烷40ml，劇烈振蕩5min,萃取輔酶QK)，連續(xù)萃取2次，合并萃取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50。C下將其濃縮。加入5ml無水乙醇，放入冰箱冷凍，析出膽固醇，過濾，取濾液，即得輔酶Qi。溶液，定容至100ml，待測)和同步皂化提取方法(具體方法將濕菌體2g移入容器內(nèi)，加入0.30.7g焦性沒食子酸，12.5gKOH，10~20ml曱醇，37ml蒸餾水，混勻，同時加入正己烷3070ml，在7090。C水浴鍋中回流，皂化并同步萃取產(chǎn)物3060min，迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗，劇烈振蕩后靜置分層取上層有機(jī)相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50。C下將其濃縮至510ml，后放入水箱冷凍，析出膽固醇，過濾，取濾液，即得輔酶Qm溶液)提取發(fā)酵菌體中的輔酶QK),每組設(shè)3組平行。產(chǎn)物通過HPLC檢測，結(jié)果表8所示，表明同步皂化提取方法對發(fā)酵菌體中的輔酶Qw的產(chǎn)物不會造成損失。表8:不同皂化方法對輔酶Qu)提取的影響皂化方法輔酶QH)產(chǎn)量(mg/L)單位菌體的輔酶Q,。產(chǎn)量(mg/g)傳統(tǒng)方法16.8211.06同步皂化提取法16.9813.9權(quán)利要求1.產(chǎn)輔酶Q10新菌株——鞘氨醇單孢菌ZUTE03(Spingomonassp.ZUTE03)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年6月18日，保藏編號CCTCCNOM.207084。2.如權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌ZUTE03,其特征在于所述鞘氨醇單胞菌ZUTE03特征如下菌抹在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上培養(yǎng)1天后呈亮黃潤澤，較小，圓形，邊緣齊整，表面光滑，易挑起，產(chǎn)黃色素；菌體呈桿狀，大小為(0.200.36)^imx(0.400.80)i^im，具極生單根鞭毛，能運動，革蘭氏染色陰性，無芽孢；好氧，過氧化氫酶陽性，還原硝酸鹽陰性，利用葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲咮，最適宜生長溫度為2830°C。3.如權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌ZUTE03在發(fā)酵制備輔酶Q1()中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以鞘氨醇單胞菌ZUTE03接種于適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基，2528。C下培養(yǎng)2436h,所得發(fā)酵液離心收集濕菌體，濕菌體經(jīng)皂化提取得到所述的輔酶Qu)。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述皂化提取為同步皂化提取。6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基按如下配方配制每加入1000mL水加入碳源1020g、氮源515g、KH2PO40.5g、Na2HP041.5g、MgS040.5g，pH6.08.0。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述氮源為硫酸銨。8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述碳源為葡萄糖。9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述適用于鞘氨醇屬菌種的液體培養(yǎng)基按如下配方配制每加入1000mL水加入葡萄糖15g、硫酸銨10g、KH2PO40.5g、Na2HP041.5g、MgS040.5g,pH8.0。10.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述皂化提取按如下步驟進(jìn)行將濕菌體2g移入容器內(nèi)，加入0.30.7g焦性沒食子酸，12.5gKOH,1020ml曱醇，37ml蒸餾水，混勻，同時加入C5C10的烷類試劑30~70ml,在70卯。C水浴鍋中回流，皂化并同步萃取產(chǎn)物3060min,迅速冷卻至室溫，倒入分液漏斗，劇烈振蕩后靜置分層取上層有機(jī)相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50。C下將其濃縮至510ml，后》文入水箱冷凍，析出膽固醇，過濾，取濾液，即得輔酶Qn)溶液。全文摘要本發(fā)明提供了一株產(chǎn)輔酶Q₁₀新菌株——鞘氨醇單胞菌ZUTE03(Sphingomonassp.ZUTE03)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年6月18日，保藏編號CCTCCNOM207084。利用該菌種發(fā)酵物制備輔酶Q₁₀時，采用同步皂化提取新工藝，節(jié)約人力與試劑，省時簡便，在保證產(chǎn)物幾乎無損失條件下，提高了輔酶Q₁₀提取工藝效率。文檔編號C12N1/20GK101177670SQ20071007080公開日2008年5月14日申請日期2007年8月16日優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日發(fā)明者吳石金,孫柯丹,方建軍,柳華貴,邱樂泉,凌金,鐘衛(wèi)鴻,陳建孟申請人:浙江工業(yè)大學(xué)