專利名稱：羅氏沼蝦精子類明膠酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羅氏沼蝦精子類明膠酶(sperm gelatinase-like protease, SGP)及其編碼基因和應(yīng)用。
(二) 背景4支術(shù)
在受精過程中，精卵結(jié)合具有種間特異性的特點。作為質(zhì)膜融合的其 中一個調(diào)節(jié)物，精子上的蛋白質(zhì)在這個過程中起到了重要的作用。在哺乳 動物中，如老鼠， 一種精子蛋白Izumo是促使精卵質(zhì)膜融合的關(guān)鍵因子。 另一種精子表面蛋白cyritestin，對精子特異性粘附到卵子上起著重要的作 用。在無脊推動物的受精過程中，精子上的蛋白質(zhì)(蛋白酶)同樣具有重 要作用。如鮑魚，貽貝以及幾種螺類，精子蛋白lysin被認為是精子穿透 卵膜的主要因子。但是在隸屬于節(jié)肢動物的蝦類中，具有此類功能的蛋白 或基因至今沒有詳細的報道。
曱殼類十足目動物的精子是非典型的，以羅氏沼蝦(Macra6rac/n'ww ra^w&^//)為例，其精子類似翻轉(zhuǎn)的傘，有一個基部和單一棘突組成。 由于不能運動,精子上的蛋白酶類被認為在精子穿透卵膜的過程中起著更 為重要的作用。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從羅氏沼蝦(M myeW^^')的精子粗提物中分離純化的一種 具有水解明膠作用的蛋白酶，將其命名為精子類明膠酶(SGP)。此酶活 性能夠被羅氏沼蝦雄性生殖道特異性的Kazal型蛋白酶抑制劑所抑制。通 過對其基因構(gòu)造的解析，發(fā)現(xiàn)SGP的cDNA全長為577 bp，可被翻譯成
127個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。這是首例關(guān)于羅氏沼蝦精子蛋白酶基因的研咒。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
羅氏沼蟲下精子類明膠酶(sperm gelatinase-like protease, SGP )，含有 SEQ NO: 1所示的氨基酸序列。
基于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQNO: l所示氨基酸序列的 多肽的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該 多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上，均屬于本 發(fā)明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、 插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨 基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非 保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。本發(fā)明所述多肽的片段、衍生物或 類似物是指基本上保持本發(fā)明所述的羅氏沼奸精子類明膠酶的生物學功 能或活性的多肽，可以是下列情形(I)一個或多個氨基酸殘基被保守或 非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸 可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；(II) 一個或多個氨基酸殘基上 的某個基團被其它基團取代；(III)成熟多肽與另一種化合物(比如延長 多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融 合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多 肽的序列或蛋白原序列)。
SEQ NO : 1所示的氨基酸序列如下
QCFCSSLEVKGCHPFLVSIIDAVKEQCPKKKQ。其中包括107個氨基酸 組成的成熟肽和20個氨基酸組成的信號肽。
優(yōu)選的，所述羅氏沼蝦精子類明膠酶為SEQNO: l所示的氨基^ 列組成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及編碼所述的羅氏沼蝦精子類明膠酶的基因。所述編碼基 因含有SEQNO: 2所示的核普酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何 SEQNO: 2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同 源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一 個或多個核苷酸改變的多核苷S吏序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位 變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如 本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多 個核苷酸的取代、缺失或插入,但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
優(yōu)選的，所述編碼基因為SEQNO: 2所示的核苷S臾序列。 SEQNO : 2所示的核苷酸序列如下 5,誦GGCAGTCGATCAGCAGCTATCAAGGAAGACCCAAACATGAAATT CCTGTTCGCCGGTGGAATCCTCTTGTTTGCCTTGGCAGTGAGCGCCA
GGCTCTCAAAGAACGGGTCGAGGAGGAAAACTGCACCAAATACGT
TCTCGCCGGAGGGGACTGCGAAATTGTCATCAGGATGGAAAAACTG
GAGAACATCCTGAAGGACTTCTTCCAATCCATGACCACGAAGCCTA
AACTGACCGAACTCTTCGACGCTTCGGTATCCTACTTCCTGGGAGG
CCAGTGCTTCTGTTCATCCCTCGAGGTCAAAGGATGCCACCCATTCC
GCAGTGATGATGTTAAATACCTCCTACGAGTTACCGAATGGACACTC
GTTGAGTATGATTGGTTAATGCTGACAAAATTGTTTTCTGAATAAAA
CATGAAACCATAAAAAAAAAAAA-3，。
該cDNA的全長為577 bp，由
36-bp的5'非翻i奪區(qū)(5，-UTR), 157-bp的3'非翻i奪區(qū)(3'-UTR)和384-bp
的開放閱讀框(ORF)組成。該序列已經(jīng)提交到GenBank上，但尚未公
開。序列號為EF647641。其中384-bp的開放閱讀框(ORF)可被翻譯
成127個氨基酸組成的前體蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及所述的羅氏沼奸精子類明膠酶在水解明膠中的應(yīng)用。
通過GenBank上的比對，SGP的cDNA序列和氨基酸序列，與已報 道的蛋白質(zhì)或功能域，均沒有相似性。Northern雜交的結(jié)果證實，SGP 特異性地在雄性生殖道中，即精巢、輸精管和末端壺腹部表達，而在其他 的組織，包括肝臟、卵巢、心臟和肌肉中沒有表達。利用gelatin-substrate film分析表明羅氏沼蝦的精子具有水解明膠的功能，這種水解作用能夠被 kazal型蛋白酶抑制劑(MRPINK)所抑制。而從精子粗提物分離純化得 到的SGP，在含有g(shù)elatin的SDS-PAGE上，顯示了明顯的水解明膠的作 用，并且也能夠被MRPINK所抑制。這種水解明膠的作用在很多哺乳動 物的精子中被認為是頂體酵素(acrosin)的功能。頂體酵素對哺乳動物的 精子穿越卵膜起著至關(guān)重要的作用。由此認為在羅氏沼蝦中SGP是精子 穿越卵膜的一個重要因子。在受精過程中，精卵質(zhì)膜的融合具有種間特異 性的特點。因此認為SGP在序列上與其他類似功能的蛋白沒有同源性是 合理的。這也可能是使不同物種間產(chǎn)生生殖隔離的其中 一個原因。
通過對不同物種的精子上與受精有關(guān)的酶的研究，有助于了解曱殼類 受精作用的機制，以及不同物種間產(chǎn)生生殖隔離的機制?；谶@些理論與 技術(shù)，使相關(guān)研究人員能夠建立優(yōu)良的雜交體系，從而獲得高產(chǎn)，快速生
長的雜交物種。
(四)


圖1為羅氏沼奸精子粗提物水解明膠活性的電泳圖，a為羅氏沼蝦精子粗
提物，b為羅氏沼蝦精子粗提物與MRPINK反應(yīng)后的產(chǎn)物；
圖2為SGP水解明膠活性的電泳圖；a為SGP, b為SGP與MRPINK反
應(yīng)后的產(chǎn)物。
(五)
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍 并不僅限于此
實施例l:羅氏沼壞精子類明膠酶編碼基因的獲得
① 利用Trizol，根據(jù)制造商提供的方法，從羅氏沼奸的雄性生殖道中提 取總RNA。以此為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。
② 根據(jù)氨基末端四十個氨基酸的序列，設(shè)計三條兼并引物(Fl: 5'-GAYGARAYYTNGCNWSNGARG畫3，， F2 : 5'-GAYYTNGCNWSNGARGTNCARCA-3，和Rl :
5 ， -ATYTCRTCRTCNCCNCCNGCNA國3 ，)。
③ 在第一輪PCR反應(yīng)中，以第一鏈cDNA為模板，F(xiàn)1和R1為引物。 PCR反應(yīng)體系為cDNA模板lpl,引物各lpl, 10xPCRBuffer2.5 pl， MgCl21.5 pl， dNTPs 1.0 pl， TaqE 0.25 pl，滅菌水補足到25 pl。 PCR程 序為94。C變性5 min,接著94 。C 30 sec, 52 °C 30 sec， 72 °C 30 sec，進 行30個循環(huán)。最后72。C延伸10min。第二輪PCR反應(yīng)以1.0 |il體積 的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，引物為F2和Rl各1.0pl。其余與第一輪反 應(yīng)相同，PCR反應(yīng)程序也與第一輪相同。反應(yīng)產(chǎn)物進行連接轉(zhuǎn)化后測序
得到SGP的中間片,殳序歹寸fragmentl。
根據(jù)fragmentl,設(shè)計3'RACE的特異性引物3PF: 5'-CAAGGACATGGCTCTCAAAGAA-3'。用于3'RACE的cDNA #4居 FirstChoice/RLM-RACEKit所提供的方法合成。然后以此為PCR的模板， 引物是3PF和由試劑盒提供的3'outerprimer。具體方法參照試劑盒說明。 PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化測序后，得到SGP的3'端序列fmgmentll。 ⑤根據(jù)fragmentll,設(shè)計了 5'RACE的特異性引物5PO: 5 ， -GCAAACTTGAGTGTCCATTCGGT-3 ，和5PI:
5 ，-GGCGTCAATGATGCTTACCAGGAA-3， 。 5 ，端擴增的沖莫一反的制備采用本實— 驗 室改進的方法獲得。在第一輪PCR擴增中，PCR體系和PCR程序與前面 介紹的基本相同，其中引物為5PO和adapter primer: 5，-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3，，退火溫度為60。C。第二輪PCR， 則以第一輪產(chǎn)物為才莫板，引物為5PI和5， adapterprimer。其余和第一輪 相同。擴增產(chǎn)物同樣被連接轉(zhuǎn)化并測序(fragmentIII)。
根據(jù)三個片段(fragmentl,fragmentll和fragmentIII)的序列，拼接后得 到SGP cDNA的完整序列
5'-GGCAGTCGATCAGCAGCTATCAAGGAAGACCCAAACATGAAATT
CCTGTTCGCCGGTGGAATCCTCTTGTTTGCCTTGGCAGTGAGCGCCA
TGGCCGACGAAGACCTTGCTTCCGAAGTGCAGCAATTCAAGGACAT
GGCTCTCAAAGAACGGGTCGAGGAGGAAAACTGCACCAAATACGT
TCTCGCCGGAGGGGACTGCGAAATTGTCATCAGGATGGAAAAACTG
GAGAACATCCTGAAGGACTTCTTCCAATCCATGACCACGAAGCCTA
AACTGACCGAACTCTTCGACGCTTCGGTATCCTACTTCCTGGGAGG
GCAGTGATGATGTTAAATACCTCCTACGAGTTACCGAATGGACACTC
GTTGAGTATGATTGGTTAATGCTGACAAAATTGTTTTCTGAATAAAA CATGAAACCATAAAAAAAAAAAA-3'。
該cDNA的全長為577 bp,由36-bp的5，非翻譯區(qū)(5，-UTR), 157-bp 的3'非翻譯區(qū)(3，-UTR)和384-bp的開放閱讀框組成。該序列已經(jīng)提交 到GenBank上，但尚未公開。序列號為EF647641 。其中384-bp的開放 閱讀框(ORF)可被翻譯成127個氨基酸組成的前體蛋白質(zhì)，其中包括 107個氨基酸組成的成熟肽和20個氨基酸組成的信號肽
QCFCSSLEVKGCHPFLVSIIDAVKEQCPKKKQ。
實施例2:羅氏沼蚱精子類明膠酶的水解作用 待測樣品制備
樣品1 (羅氏沼壞精子粗提物)取成熟雄性羅氏沼奸的壺腹，碾碎之后， 離心得到精子，在4。C條件下，用超聲波處理5分鐘，離心后所得的上清 即為精子粗提物，-8(TC儲存?zhèn)溆谩?br> 樣品2(羅氏沼蚱精子粗提物與MRPINK反應(yīng)后的產(chǎn)物)精子粗提物(10 嗎)與MRPINK (5mM)在28""C條件下反應(yīng)半個小時，反應(yīng)產(chǎn)物通過含 0.1%明月交的SDS-PAGE 4企測活性。
樣品3 (SGP):結(jié)合明膠活性檢測實驗，運用HPLC的方法，從精子粗 提物中分離純化到SGP。 HPLC的洗脫條件為含0.05%TFA的乙腈在1小
時內(nèi)，以1 ml/min流速，從0%-65°/0進行梯度洗脫。
樣品4 ( SGP與MRPINK反應(yīng)后的產(chǎn)物)HPLC分離純化得到的SGP,
在28。C下與MRPINK反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物在含0.1%明膠的SDS-PAGE
上檢測活性。
電泳步驟
① 含0.1。/。明膠的SDS-PAGE的制備配制10%的SDS-PAGE,在分離膠 中加入中濃度為0.1%的明膠。
② 電泳在20mA， 4。C條件下，進行2h。
③ 電泳結(jié)束后，凝膠在BufferA (0.1 M Tris,pH 8.0) +2.5%Triton X-100 中平衡1.5 h。然后用BufferA清洗。最后在含5 mM CaCl2和0.2 M NaCl 的BufferA中，37 。C過夜反應(yīng)。
④ 反應(yīng)結(jié)束后，用考馬斯亮藍R-250染色脫色。
⑤ 將待測樣品1與樣品2 —組，樣品3與樣品4 一組，按照上述方法進行 電泳，電泳圖參見圖1、圖2。
結(jié)論
在圖l-a中的透明亮帶表示羅氏沼蝦精子粗提物中含有能夠水解明膠 的蛋白酶，而將粗提物與MRPINK反應(yīng)后，蛋白酶活性消失(圖l-b)。 圖2-b透明亮帶顯示了 SGP水解明膠的活性，SGP與MRPINK反應(yīng)后， 其水解活性受到抑制(圖2-a)。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大學
<120>羅氏沼蝦精子類明膠酶及其編碼基因和應(yīng)用
<130>
<160〉 9
<170> Patentln version 3.4
<210〉 1
〈211〉 127
〈212> PRT
<213〉 Macrobrachium rosenbergii
〈400〉 1
Met Lys Phe 1
Leu
Phe 5
Ala Gly
Gly lie Leu 10
Leu Phe Als Leu
Ala Val 15
Ser Ala Met Ala Asp Glu Asp Leu Ala Ser Glu Val Gin Gin Phe Lys 20 25 30
Asp Met Ala Leu Lys Glu Arg Val Glu Glu Glu Asn Cys Thr Lys Tyr 35 40 45
Val Leu Ala Gly Gly Asp Cys Glu lie Val lie Arg Met Glu Lys Leu 50 55 60
Gu Asn lie Leu Lys Asp Phe Phe Gin Ser Met Thr Thr Lys Pro Lys
65
70
75
80
Leu Thr Glu Leu Phe Asp Ala Ser Val Ser Tyr Phe Leu Gly Gly Gin 85 90 95
Cys Phe Cys Ser Ser Leu Glu Val Lys Gly Cys His Pro Phe Leu Val 100 lb5 110
Ser lie lie Asp Ala Val Lys Glu Gin Cys Pro Lys Lys Lys Gin 115 120 125
〈210〉 2 <211> 577 <212> 腿 <213〉 Macrobrachium rosenbergii
<400> 2 ggcagtcgatcagca_gct3tcaagg犯gaccc犯acatg3aattcctgttcgccggtgga60
atcctcttgtttgccttggcagtgagcgccatggccgacgaagaccttgcttccgaagtg120
cagcaattcaaggacatggctctc犯agaacgggtcgaggcaccaaatac180
gttctcgccgg&ggggactgcgaaattgtca犯犯ct ggag33C3tCCtg240
saggacttcttccaatccatgaccacgaagcctaaactgaccgaactcttcgacgcttcg300
g"tatcctacttcctgggaggccagtgcttctgttcatccctcgaggtcaaaggatgccac360
ccattcctggtaagcatcattgacgccgtcaaggaacEiatgtcccaagaag卿cagtga420
tacctcctac.gagttaccga3tggacactc犯gtt.tgc犯ctacacttga咖
actttagattttgcccactctaattctgttgagtatgattggtt組gctgacaawttg540
ttttctgaat aaaacatgaa accataaaaa aaaa犯a
577
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>Unknown
〈220>
<223>人工合成
<400>3
Gly Ala Tyr Gly10
15
Asn Gly Ala Arg Gly
20
<210〉 <211> 〈212〉 <213>4 23 PRT Unknown
<220> <223>人工合成
〈400>4
Gly Ala Tyr Tyr 1Thr Asn Cys Ala 20〈210〉 <21L〉 <212> <213>5 22 PRT Unknown
<220〉 〈223〉人工合成
<400〉5
10
15
Ala Thr Tyr Thr Cys Arg Thr Cys Arg Thr Cys Asn Cys Cys Asn Cys 15 10 15
Cys Asn Gly Cys Asn Ala
20
〈210〉6
<211〉22
〈212>DNA
〈213〉Unknown
<220>
<223〉人工合成
<400>6
caaggacatg gctctcaaag aa
22
<210〉 7
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Unknown
<220〉
<223〉 人工合成 <400> 7
gcaaacttga gtgtccattc ggt
<210>8
<211〉24
<212〉DNA
<213>Unknown
<220〉
<223〉人工合成
〈400〉8
ggcgtcaatg atgcttacca ggaa
〈210〉 9
<211〉 21
<212> DNA
〈213> Unknown
〈220〉
<223>人工合成
〈400〉 9
tgtagcgtga agacgac卿a
權(quán)利要求
1.羅氏沼蝦精子類明膠酶(sperm gelatinase-like protease，SGP)，含有SEQNO1所示的氨基酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的羅氏沼蚱精子類明膠酶，其特征在于所述羅氏沼 蝦精子類明膠酶為SEQ NO: 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3. 編碼權(quán)利要求1所述的羅氏沼奸精子類明膠酶的基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因含有SEQ NO: 2所示的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為SEQ NO: 2所示的核苦酸序列。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的羅氏沼蟲下精子類明膠酶在水解明膠中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從羅氏沼蝦(M.rosenbergii)的精子粗提物中分離純化的一種具有水解明膠作用的蛋白酶——羅氏沼蝦精子類明膠酶(spermgelatinase-like protease，SGP)及其編碼基因和應(yīng)用。通過對不同物種的精子上與受精有關(guān)的酶的研究，有助于了解甲殼類受精作用的機制，以及不同物種間產(chǎn)生生殖隔離的機制?；谶@些理論與技術(shù)，使相關(guān)研究人員能夠建立優(yōu)良的雜交體系，從而獲得高產(chǎn)，快速生長的雜交物種。
文檔編號C12N9/64GK101368178SQ20071007080
公開日2009年2月18日 申請日期2007年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者曄 李, 楊衛(wèi)軍, 馬文明 申請人:浙江大學