專利名稱：：一種周質(zhì)分泌融合表達型前t載體及其制備與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可用于快速構(gòu)建周質(zhì)分泌融合表達基因工程菌的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體及其制備與應用。(二)
背景技術(shù)：
：基因工程是將目的基因重組于表達載體中，并將重組表達載體轉(zhuǎn)化至適當?shù)乃拗髦?，表達得到所需要的蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮效益。基因工程制藥的關(guān)鍵是如何獲得高純度的具有正確空間結(jié)構(gòu)的多肽或蛋白質(zhì)，基因重組僅僅是一個手段而已，應當盡可能減少基因重組階段花費的人力與財力。PCR技術(shù)是獲得目的基因片段的最常用的方法，是分子生物學和基因工程研究中的一項基本技術(shù)，它被廣泛用于體外擴增已知或未知的特異DNA片段。市場上已經(jīng)有用于PCR產(chǎn)物快速克隆的T載體，如pUCm-T載體。因為對PCR產(chǎn)物進行快速有效的克隆是開展雜交分析、高質(zhì)量測序及從復雜PCR產(chǎn)物中分離目的片段等下游實驗，實現(xiàn)PCR產(chǎn)物多種用途的必經(jīng)之路。T-載體是一種用于直接克隆PCR產(chǎn)物的載體，一般為線性，其分子末端各有一個3'dT(脫氧胸苷)突出。利用T^DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在擴增DNA的3'末端非模板依賴地加上一個核苷酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個3'dA突出端被用于把PCR產(chǎn)物插入到插入位點有一個3'dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產(chǎn)物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規(guī)克隆方法的缺點，而且搡作簡便、方法快捷、連接效率高，因而其應用范圍非常廣泛。但是目前市場上供應的T載體均為克隆型T載體，即T載體用于克隆目的基因的PCR產(chǎn)物，僅僅滿足基因保存和測序的需要。即使有使目的基因表達的T載體，其表達產(chǎn)物與目標產(chǎn)物不一致，N端會多出幾個氨基酸，得到的蛋白產(chǎn)物與目標蛋白有所不同，因而應用價值不高。如果能將PCR產(chǎn)物直接連接于表達載體的開放性閱讀框架中，環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主即可實現(xiàn)基因表達。這樣的過程可以省略繁瑣的重組工序，省時、省材料。而且，每次可以獲得若干個克隆，效率極高。由于基因表達，基因型與表型緊密相聯(lián)，可以根據(jù)表型測定基因型，對需要的克隆進行測序，可以節(jié)約大量時間和財力。目前基因工程方法制備目標蛋白還存在幾個技術(shù)難題第一，在大腸桿菌中直接表達重組異源蛋白，往往形成難以溶解的包含體，給下游的復性工作造成麻煩。可以將外源基因與受體菌自身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起進行融合表達,融合伴侶良好的增溶作用對于融合蛋白復性是極為有利的可以防止蛋白質(zhì)分子之間相互作用，避免形成多聚體；可以提高復性時蛋白質(zhì)的濃度，節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。目前常用的融合表達系統(tǒng)如谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)，二硫鍵形成蛋白(DsbA),硫氧化還原蛋白(TrxA)等通常都能夠在大腸桿菌中高效表達出可溶性的融合蛋白。直接獲得有正確空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的有效方法是分泌表達，如酵母分泌表達、大腸桿菌分泌表達等。分泌過程中蛋白質(zhì)分子相互影響小，而且通過二硫鍵維持空間結(jié)構(gòu)。比如在大腸桿菌周質(zhì)中分泌表達，在快速、過量表達的情況下，分子間形成二硫鍵，目標產(chǎn)物聚合成多聚體，而在適當條件下，如低溫、低誘導劑濃度等，可以借助周質(zhì)空間的氧化環(huán)境形成分子內(nèi)二硫^:，從而維持正確的空間結(jié)構(gòu)，利用該策略可以制備出重組腸激酶輕鏈。第二，許多具有藥用價值的天然生物活性肽，是通過分泌機制從一個細胞分泌形成的，基因表達采用Pre-Pro-成熟肽模式，Pre是信號肽基因，指導蛋白質(zhì)分泌，Pro肽是幫助成熟肽正確折疊的一段肽鏈，在分泌之前，利用體內(nèi)的蛋白酶酶切除去Pro肽得到成熟肽，最后分泌得到的成熟肽的第一個氨基酸一般不是甲硫氨酸。比如骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的第一個氨基酸為Gln,BMP-7成熟肽的第一個氨基酸為Ser，防御素HNP-1成熟肽的第一個氨基酸為Ala。為了使目的基因在大腸桿菌或酵母中表達，需要將目的基因置于開放性閱讀框架內(nèi)，即第一個氨基酸必須為ATG編碼的曱辟u氨酸。但是，在天然活性肽的N端增加一個曱硫氨酸，會導致免疫原性的產(chǎn)生，需要延長臨床試驗的時間以觀察其安全性，大幅度增加新藥報批的難度和成本。如果目標生物活性肽與DsbA融合表達，可以設(shè)計腸激酶酶切位點，由于腸激酶酶切的位置為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X的C末端，X為脯氨酸以外其他氨基酸，所以酶切后可以得到與天然氨基酸完全相同的N末端。第四，由于多肽藥物在消化道中被蛋白酶降解而且難以吸收，一般以注射方式給藥，因而對純度有較高的要求。純化工藝的建立是多肽藥物制備的難點。由于宿主細胞含有大量的自身蛋白，需要采用分離純化的手段將目標產(chǎn)物純化，如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、親和層析等，也就是所謂的下游技術(shù)。分離純化的步驟越多，收率越低，成本越高。利用融合表達策略可以使用親和層析簡易純化融合蛋白，如利用6His與Ni2+螯合親和層析純化，在大規(guī)模生產(chǎn)中，可以采用擴張床技術(shù)直接將細胞破碎液中的目標蛋白吸附、純化，從而省略復雜的純化工藝探索。大腸桿菌周質(zhì)空間是介于大腸桿菌細胞膜和細胞壁之間的空間，分泌于該空間的蛋白質(zhì)在基因表達時需要信號肽的參與。與細胞質(zhì)相比，該環(huán)境具有氧化性,蛋白質(zhì)分子可利用氧化性環(huán)境通過半胱氨酸殘基形成二疏鍵，以維持正確的空間結(jié)構(gòu)，從而得到有生物學活性的蛋白質(zhì)。將目的基因表達于周質(zhì)空間，具有抽提方便，宿主蛋白酶和雜蛋白少的特點，可以利用滲透壓休克法，無需破碎細胞即可抽提周質(zhì)蛋白。宿主周質(zhì)空間蛋白種類只有總蛋白的4%，有利于目標蛋白的下游純化，蛋白酶少可減少對目標蛋白的破壞。另外，周質(zhì)空間允許分子量小于600道爾頓的小分子通過，通透性好于細胞質(zhì)，這一特點十分有利于酶的工業(yè)化應用…-有利于底物和產(chǎn)物傳質(zhì)擴散。基于以上原因，有大量的將目的基因表達于周質(zhì)空間的才艮道。由于分泌于周質(zhì)的蛋白質(zhì)在基因表達時需要信號肽的參與，要使目標蛋白分泌于周質(zhì)空間，必須在目的基因的上游重組信號肽基因，在基因表達時，借助信號肽酶的作用，信號肽被切割，目標蛋白不含信號肽。由于分泌效率還和目標蛋白或多肽的N端氨基酸有關(guān)，不是所有的目標蛋白或多肽均可重組一種信號肽基因即可高效表達。將目標蛋白重組于周質(zhì)蛋白二硫鍵形成蛋白DsbA基因的下游，使DsbA融合蛋白分泌于周質(zhì)空間是一種非常有效的方法，因為DsbA本身就是一種周質(zhì)蛋白，易于分泌表達，在DsbA基因下游、目標蛋白基因上游之間插入連接肽(GSGSG)N(N=l~3)可以使目標蛋白與DsbA在空間上相互獨立，有利于目標蛋白的折疊，融合蛋白之間插入純化標簽6His，可以使融合蛋白用N產(chǎn)螯合親和純化的方法快速分離純化，如重組腸激酶可以利用該技術(shù)路線制備得到。但是要構(gòu)建一個分泌融合表達載體，涉及基因拼接和基因重組，雖然現(xiàn)代分子生物學技術(shù)為這種重組提供了可行的多樣的方法，但是過程較為復雜，耗時、耗材，需要使用限制性內(nèi)切酶、DNA純化等工序。T-載體是近年發(fā)M來的一種用于直接克隆PCR產(chǎn)物的新型載體。T-載體一般為線性，其分子末端各有一個3'dT(脫氧胸苷)突出。利用T^DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在擴增DNA的3'末端非模板依賴地加上一個核普酸，通常為脫氧腺苷酸(dA)。這個3'dA突出端被用于把PCR產(chǎn)物插入到插入位點有一個3'dT突出的T-載體上。這樣就將PCR產(chǎn)物以粘性末端連接的方式直接克隆到載體上。這種方式不僅克服了常規(guī)克隆方法的缺點，而且操作筒便、方法快捷、連接效率高，因而其應用范圍非常廣泛。PCR技術(shù)是分子生物學和基因工程研究中的一項基本技術(shù)，它被廣泛用于體外擴增已知或未知的特異DNA片段。利用限制性內(nèi)切酶制備T-載體是T-載體制備方法中最為先進的方式，其中最適合于制備T-載體，該酶的特異性識別序列為5'CCANNNNN*NNNNTGG3'，N可以是A、T、G、C的任意一種。酶法制備T載體首先要得到一個環(huán)狀的前T質(zhì)粒栽體，經(jīng)XcmI酶切兩個位點后，載體的大片段DNA線性化，而且兩個3，末端均帶dT，從而得到可用于PCR產(chǎn)物快速克隆的T載體，如市場上供應pUCm-T。目前市場上供應的主要是克隆型T載體，主要滿足基因保存和測序的需要，如果構(gòu)建一種表達型T載體，將PCR產(chǎn)物直接連接于表達型T載體上，使目的基因位于表達框架內(nèi)，直接得到表達載體，即可一省略復雜的DNA重組步驟。不僅克隆目的DNA，而且還可以直接表達目的基因。另外，用酶法制備T載體有可能存在以下幾個方面的問題，一，如果酶切質(zhì)粒DNA質(zhì)量不高，外源基因不能插入載體中，而載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后能夠在抗性平板上生長。pUCm-T載體設(shè)計了藍白斑篩選方案以篩選目的DNA片段是否插入載體，如果插入載體，編碼半乳糖香酶a肽的基因LacZ被插入失活，細胞內(nèi)沒有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的篩選平板中白色菌落為插入失活陽性克隆，而蘭色菌落為不含外源基因的陰性克隆。這種方法需要使用價格昂貴的X—gal,制備藍白斑篩選平板也比較麻煩。在特定融合表達載體中不適合應用，需要采用別的篩選方案。二，如果兩個XcmI酶切位點空間位置較近，將影響載體的酶切效率，即使載體DNA的純度很高，酶的質(zhì)量也很好，也會出現(xiàn)酶切載體一"刀"的情況，這種線性的載體不能和PCR產(chǎn)物連接，而是載體自連，從而導致陰性克隆的產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明則是為了提供一種周質(zhì)分泌融合表達型前T載體及其制備方法，可利用這種載體簡單地、快速地構(gòu)建分泌于周質(zhì)的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcwI外，無需限制性內(nèi)切酶即可構(gòu)建分泌融合表達型基因工程菌。為達到發(fā)明目的本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是一種周質(zhì)分泌融合表達型前T載體，由如下方法制備得到(1)構(gòu)建編碼AspTI-GSGSG-HHHHHH-Xcml-Ampr-義c附I-歷"din的DNA片段一—DNA1;(2)定點突變pET39質(zhì)粒中LacI基因內(nèi)部的三個ZcmI位點，在編碼JL&酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使Xcml識別位點喪失，得到定點突變消除Xc附I位點的pET39，；(3)利用^;TI和歷"dIII將DNA1定向重組于pET39，中，得到所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體質(zhì)粒圖譜如圖1所示。本發(fā)明還涉及所述的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體的制備方法，所述方法如下(1)構(gòu)建編碼5s;TI-GSGSG-HHHHHH-Xc附I-Ampr-義cml-歷"dm的DNA片段——DNA1;(2)定點突變pET39質(zhì)粒中Lacl基因內(nèi)部的三個Icwl位點，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使Xc/wI識別位點喪失，得到定點突變消除XcwI位點的pET39，；(3)利用5^TI和///"dill將DNA1定向重組于pET39'中，得到所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。所構(gòu)建的5^TI-GSGSG-HHHHHH-^cml-Ampr-JTcml-歷mini目的結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>、所構(gòu)建的55pTI-GSGSG-HHHHHH-XcwI-Ampr-^cmI-///"din目的基因序列即DNA1,其序列可以有變化，前部分它只要編碼這些氨基酸(GSGSG-HHHHHH)就可以，不過編碼第五個組氨酸的密碼子必須設(shè)計為CAC,使該密碼子的第三個堿基與第六個組氨酸的密碼子的前兩個堿基組成Ic/wI識別序列(CCANNNNN*NNNNTGG的前半部分關(guān)4建識別序列CCA,其下游第五個石威基N、殳計為T);因此，所述DNA1在滿足編碼所述氨基酸序列的前提下，還應滿足如下條件含有片段CCANNNNTNNNNTGG，N選自A、T、C、G中的一種，根據(jù)其編碼的氨基酸進行設(shè)計。其中，下劃線標記的為關(guān)鍵序列，中間的T是制備T載體所必須的tt，可作為絲氨酸密碼子第一個堿基，在本發(fā)明中第六個組氨酸密碼子下游設(shè)計為氨基酸密碼子，不可以設(shè)計為TAA、TAG或TGA等終止密碼子，否則不能表達為融合蛋白。優(yōu)選設(shè)計甘氨酸密碼子。優(yōu)選的，所述DNA1序列如下5，-ATACT窗GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3,。翻譯情況如下5,-TACTOJGCGAGAAAAAAGGTTCTGGT脈TITyrLeuSerGluLysLysGlySerGlyTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGASerGlyHisHisHisHisHisHisGlyTCTAATGGATAGGTTAATGTC畫3，SerXc挑I所述DNA1中還可含有卡那霉素除外的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因，如氨千青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因或氯霉素抗性基因等。前T載體有雙抗性，如果外源DM成功地插入于兩個位點之間，前T載體中位于兩個位點之間的抗生素抗性消失，只留下卡那霉素抗性，有利于用影印法快速篩選陽性克隆。所述DNA1構(gòu)建方法如下(1)引物A、B互為模板進行PCRl反應A:5，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3，；B:5，-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC國3，；PCR反應條件94。C變性10min,48。C退火300s，72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進行PCR2反應Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA國3';Amp2:5'陽CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3';Amp2引物的5，末端含有///wdlll和識別序列(CCANNNNN*NNNNTGG，其中N承設(shè)計為T，N選自A、T、C、G中的一種)。(3)將PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2進行基因拼接，得到所述編碼5spTI-GSGSG國HHHHHH-Xc附I國Ampr-Xc附I曙/7z"d111的DNA片段——DNA1;拼接反應條件94。C預變性3min,94。C變性30s，6(TC退火30s，72。C延伸120s,30個循環(huán)，72。C延伸10min。所述的定點突變?nèi)齻€ZcmI位點，采用常規(guī)SOE技術(shù)，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變Lacl基因的DNA序列，使XcmI識別位點喪失，得到定點突變消除JTcmI位點的pET39，所述的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體主要用于制備周質(zhì)分泌融合表達型T載體。具體的，所述應用如下將周質(zhì)分泌融合表達型前T載體用限制性內(nèi)切酶^b/wI在37。C下酶切2h，再進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片段，用3SDNAGelPurificationKit純化回收，得到周質(zhì)分泌融合表達型T載體。DsbA本身就是一種分子伴侶，是大腸桿菌周質(zhì)空間內(nèi)的巰基/二石克鍵氧化酶，主要催化底物蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，在適當條件下，比如低溫、低誘導劑濃度等，目標蛋白在周質(zhì)空間正確折疊，得到有相應生物活性的目標產(chǎn)物。相比于分泌至培養(yǎng)基的情況，周質(zhì)表達的產(chǎn)物仍然存在于細胞中，離心收集菌體，通過簡單的滲透休克，在無須破菌的情況下即可抽提出目標蛋白，十分方便。另外周質(zhì)空間蛋白酶種類少，目標蛋白受到蛋白酶破壞的可能性較小。DsbA具有較強的分泌表達能力，本發(fā)明可用于酶蛋白的周質(zhì)融合表達，文獻報道，周質(zhì)空間允許分子量小于600D的小分子自由進出，通透性好于細胞膜。分泌于周質(zhì)空間的酶蛋白分子因形成二硫鍵維持空間結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性好，底物和產(chǎn)物的通透性好，十分有利于工程菌細胞催化生產(chǎn)手性藥物中間體。融合蛋白中攜帶了6His親和純化標簽，為快速純化目標蛋白創(chuàng)造了條件，可省略復雜的純化工藝探索。融合蛋白經(jīng)蛋白酶酶切后得到的產(chǎn)物，其第一氨基酸可與天然的一致，十分有利于多肽藥物的開發(fā)。比如6His-Gly-Ser序列C末端可以設(shè)計腸激酶的識別序列，融合蛋白經(jīng)蛋白酶酶切后可以得到與天然氨基酸完全相同的N末端。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在除了使用XcmI制備T載體外，不需要用其它限制性內(nèi)切酶，一步法構(gòu)建融合表達基因工程菌，為大量制備活性肽工程菌庫提供了可行的技術(shù)方法。(四)圖1為本發(fā)明周質(zhì)分泌融合表達型前T栽體質(zhì)粒圖譜。(五)具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此(實施例中所有試劑、質(zhì)粒、酶、引物等，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)實施例1:LacI基因定點突變消除IcwI位點采用SOE法，以pET39為PCR模板，六條引物分別設(shè)計為Lac-1:5，-ttaggatccgcgacccatttgct-3，(含5amHI4立,泉)Lac-2:5'-agagatatccgcaccaacgcgca-3，(含五coRV位點)Lac-3:5'國ctgattggcgttgctacctccagtctggccctgca-3，(用于突變《立點1)Lac-4:5,-gccagactggaggtagcaacgccaatcagcaacga-3，(用于哭變位點l)Lac國5:5'-tcccactgcgatgttagttgctaacgatcagatggcgct國3，(用于突變4立點2、3)Lac誦6:5，國catctgatcgttagcaactaacatcgcagtgggaacgatgc3，(用于哭變4立點2、3)表2:位點突變前后序列對比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以Lac-1和Lac-2為引物，pET-39質(zhì)粒為才莫板，PCR擴增Lacl序列。反應參數(shù)如下94。C預變性3min，進入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,50。C退火0.5min，72。C延伸2min，30個循環(huán)，72。C延伸10min,產(chǎn)物標記為"Lacl/2"。(1)定點突變979bp處的Xcml位點以Lac-l和Lac-4為引物、Lacl/2為模板進行PCR反應，參數(shù)為94r預變性3min,進入PCR循環(huán)94°C變性0.5min，50。C退火0.5min，72。C延伸1min,30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。其產(chǎn)物標記為"Lacl/4"。以Lac-2和Lac-3為引物、Lacl/2為模板進行的PCR反應，其參數(shù)為94。C預變性3min，進入PCR循環(huán)94。C變性0.5min，48。C退火0.5min，72。C延伸1min,30個循環(huán)，72。C延伸10min。產(chǎn)物標記為"Lac2/3"，置-20。C保存。(2)Lac-l和Lac-2為引物對Lacl/4和Lac2/3進行SOE拼接SOE參數(shù)94。C預變性3min,進入PCR循環(huán)94。C變性0.5min，56。C退火0.5min，72。C延伸2min,30個循環(huán)，72。C延伸10min。產(chǎn)物標記為"Lac979"。(3)定點突變1495bp和1513bp兩處的Xc附I位點以Lac-l和Lac-6為引物、Lac979為模板進行PCR反應，其參數(shù)為94。C預變性3min,進入PCR循環(huán)94°C變性0.5min,50。C退火0.5min,72。C延伸2min,30個循環(huán)，72。C延伸10min。產(chǎn)物標記為"Lacl/6"。以Lac-2和Lac-5為引物、Lac979為模板進行PCR反應，其參數(shù)為94。C預變性3min，進入PCR循環(huán)94"C變性0.5min，47。C退火0.5min，72。C延伸0.5min,4個循環(huán)；再94。C變性0.5min，50。C退火0.5min,72。C延伸0.5min,26個循環(huán)；72。C延伸10min。產(chǎn)物標記為"Lac2/6"。(4)以Lac-l和Lac-2為引物對Lacl/6和Lac2/5進行SOE拼接SOE參數(shù)94。C預變性3min，進入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,56。C退火0.5min,72。C延伸2min，30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。產(chǎn)物標記為"LacI'，，。拼接產(chǎn)物Lacl'利用BawHI和五coRV定向重組于pET39中(具體方法為以￡amHI和五coRV分別雙酶切LacrPCR產(chǎn)物和pET39,切膠回收pET39質(zhì)粒的大片段DNA,與Lacl'PCR產(chǎn)物的酶切回收產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主DH5cc)，得到LacI基因的三個XcwI位點定點突變的pET39'質(zhì)粒。實施例2:Icml酶切盒的制備及前T載體的構(gòu)建引物A、B互為模板進行PCR1反應A:5'國ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3'B:5'-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC國3'反應參數(shù)如下94。C變性10min，48。C退火300s,72。C延伸10min。以pETllb為模板，利用下列兩條引物進行PCR2反應Amp1:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3'Amp2:5'國CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC國3'反應參數(shù)如下94。C預變性3min，94。C變性30s,55。C退火30s,72°C延伸120s，30個循環(huán)，72。C延伸10min。上述兩PCR1和PCR2產(chǎn)物片4殳用引物A和Amp2進行基因4丼接反應，反應參數(shù)如下94。C預變性3min，94。C變性30s，60。C退火30s，72°C延伸120s，30個循環(huán)，72。C延伸10min。得到編碼^/TI-GSGSG-HHHHHH-Ic附I-Amp^YcwI-7/z"dni的DNA片段，利用^pTI和///"dill定向重組于實施例1已定點突變消除JTcwI位點的pET39，中，得到周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。實施例3:目的基因與分泌融合表達型T載體的重組TnaA1:5，國CTGATGACGATGACAAAATGGAAAACTTTAAACATCTC-3，38bpTnaA2:5'隱AAGCTTTTAAACTTCTTTAA-3'21bp以五.co/z'K-12為模板，TnaAl和TnaA2為引物，用72^plusDNA聚合酶PCR擴增色氨酸酶基因，反應參數(shù)如下94。C預變性3min,94。C變性30s,42。C退火30s,72。C延伸90s，30個循環(huán)，72。C延伸10min。將實施例2的表達型前T載體用Zc附I限制性內(nèi)切酶在37。C下酶切2h，再進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果可見兩條明顯的亮帶，切取大即得到線性化表達型T載體。將PCR產(chǎn)物直接與線性化T載體用T4DNAligase在4。C冰箱中連接16h，連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化五.co/ZDH5a。實施例4:正向連接重組子的篩選以及分泌融合表達基因工程菌的構(gòu)建表達型重組轉(zhuǎn)化子的篩選引物check:5'-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTT畫3'首先，將連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化液在含100pg/mL卡那霉素的LB固體平板均勻鋪開，35。C恒溫箱培養(yǎng)1620h。正向篩選能正常生長的菌落。然后將在卡那霉素抗性LB固體平板上正常生長的菌落影印到含100pg/mL氨千霉素LB固體平板上。3(TC恒溫箱培養(yǎng)1620h。在卡那霉素抗性平板上挑選相應的不能在氨節(jié)霉素抗性平板上生長的克隆。這一步可以將未酶切和只有一個位點酶切的重組質(zhì)粒篩掉，稱為反向篩選。最后，將篩選到的克隆，用單菌落PCR法，以鑒定引物check和目的基因的下游引物和用PCR進行鑒定，這一步可以消除平板上殘余的未轉(zhuǎn)入宿主細胞的重組質(zhì)粒的影響并能確定目的基因的插入方向，稱為正向篩選。其體系和參數(shù)分別為10xBuffer(withMg2+)5|iL10mmol/LeachdNTPs2|iL10mmolTnaA12|iL10mmol/Lcheck2|iL相應陽性單克隆無菌牙簽蘸取DNA聚合酶0.5無菌雙蒸水補足至50nL94。C預變性3min，進入PCR循環(huán)94。C變性0.5min,42。C退火0.5min,72。C延伸1.5min，30個循環(huán)，最后72。C延伸10min。取部分PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并攝片，有分子量約1500bp條帶出現(xiàn)的為陽性克隆。經(jīng)check引物鑒定為陽性的克隆送英俊生物技術(shù)有限公司測序i正實，正向測序引物為T7promoterprimer#69348-3，反向測序虧1物為T7terminatorprimer#69337-3。權(quán)利要求1.一種周質(zhì)分泌融合表達型前T載體，由如下方法制備得到:(1)構(gòu)建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定點突變pET39質(zhì)粒中LacI基因內(nèi)部的三個XcmI位點，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識別位點喪失，得到定點突變消除XcmI位點的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組于pET39’中，得到所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。2.如權(quán)利要求1所述的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體，其特征在于所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體質(zhì)粒圖鐠如圖1所示。3.制備如權(quán)利要求1或2所述的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體的方法，所述方法如下(1)構(gòu)建編碼5spTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Ampr-XcmI-///"din的DNA片段——DNA1;(2)定點突變pET39質(zhì)粒中Lacl基因內(nèi)部的三個XcmI位點，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使ZcwI識別位點喪失，得到定點突變消除XcwI位點的pET39';(3)利用^spTI和歷ndIII將DNA1定向重組于pET39，中，得到所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1序列含有如下片段CCANNNNTNNNNTGG。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA1序列如下5'-ATAC7T^4GCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCACCATGGATCTAATCiGATAGGTTAATGTC畫3，。6.如權(quán)利要求3所迷的方法，其特征在于所述DNA1中含有卡那霉素除外的的普通大腸桿菌敏感的抗生素抗性基因。7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1構(gòu)建方法如下(1)引物A、B互為模板進行PCR1反應A:5，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3，；B:5，-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3，；PCR反應條件94。C變性10min，48。C退火300s,72。C延伸10min;(2)以pETllb為模板，利用引物Ampl、Amp2進行PCR2反應Ampl:5'-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3';Amp2:5'畫CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC國3';(3)將PCRl和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2進行基因拼接，得到所述編碼^pTI-GSGSG-HHHHHH-Jrcml-Ampr-JTcwI-州"dni的DNA片段——DNA1;拼接反應條件94。C預變性3min,94。C變性30s,60°C退火30s,72。C延伸120s,30個循環(huán)，72。C延伸10min。8.如權(quán)利要求1或2所述的周質(zhì)分泌融合表達型前T載體在制備周質(zhì)分泌融合表達型T載體中的應用。9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于所述應用如下將周質(zhì)分泌融合表達型前T載體用限制性內(nèi)切酶XcmI在37。C下酶切2h，再進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條明顯的亮帶，切取大片^:，用DNA純化試劑盒回收DNA,得到周質(zhì)分泌融合表達型T載體。全文摘要本發(fā)明提供了一種周質(zhì)分泌融合表達型前T載體，由如下方法制備得到(1)構(gòu)建編碼BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA1片段；(2)定點突變pET39質(zhì)粒中LacI基因內(nèi)部的三個XcmI位點，在編碼氨基酸序列不變的情況下，改變DNA序列，使XcmI識別位點喪失，得到定點突變消除XcmI位點的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII將DNA1定向重組于pET39’中，得到所述周質(zhì)分泌融合表達型前T載體。本發(fā)明除了使用XcmI制備線形T載體外，不需要用其它限制性內(nèi)切酶，一步法構(gòu)建融合表達基因工程菌，為大量制備活性肽工程菌庫提供了可行的技術(shù)方法。文檔編號C12N15/63GK101381739SQ20071007121公開日2009年3月11日申請日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者于真真,任慧穎,楊丹燕,林陳水,明許申請人:浙江工業(yè)大學