專利名稱：β－葡萄糖苷酸酶在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物材料的制備方法，具體地說二、背景技術(shù)近年來，人們一直致力于研究新型的口服疫苗以避免傳統(tǒng)的注射疫苗所具有的缺點。大量的細菌、病毒及寄生的病原體都是通過粘膜表面進入機體的，因此作為一種免疫途徑口服疫苗要優(yōu)于傳統(tǒng)的注射疫苗；注射疫苗雖能引起系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但不能有效的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生分泌型抗體sIgA；口服疫苗不但使用比較方便且成本不高，對于很多病原體來講口服免疫可能會產(chǎn)生群體免疫效應(yīng)，即在群體內(nèi)部僅有幾個成員獲得免疫時，這種免疫力會在群體內(nèi)部成員之間傳播，這些優(yōu)點尤其適用于工業(yè)化程度不高的國家。因此，對口服疫苗抗原傳遞活載體的研究和選擇就變得極為重要。
理想的黏膜免疫活載體疫苗可以促進抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸、刺激體液和細胞免疫反應(yīng)、在單劑量免疫以后產(chǎn)生長期的免疫保護作用，并且穩(wěn)定、無毒性。目前研究得最多的是致弱病原菌載體，因其仍可能保持侵襲性和毒性使它們在應(yīng)用于兒童和免疫缺陷者時受到限制。針對基因工程致弱微生物大范圍應(yīng)用的安全和環(huán)境問題，發(fā)展了以乳酸菌為代表的非致病性革蘭氏陽性菌載體。幾個世紀(jì)以來，乳酸桿菌被用于生物加工及食品和飼料保鮮等各個領(lǐng)域，他們被認為是一類安全的食品級微生物，而其它的活菌疫苗載體則未被歸為安全類；而且，某些乳酸桿菌是腸道內(nèi)正常的菌群，在腸道內(nèi)可以定植，是人和動物的健康促進因子，這一點是其它的活載體(減毒大腸桿菌、沙門氏菌、病毒)所無法比擬的；另外，研究表明腸道內(nèi)的乳酸桿菌及其產(chǎn)物對腸道感染和某些癌癥有對抗性，而且極有可能通過降低血液中的膽固醇含量而起到抗膽固醇的效應(yīng)。乳酸桿菌其它可能的作用包括增加腸道內(nèi)有益菌，減少有害菌；增加食物的營養(yǎng)價值，減少乳糖不耐癥；產(chǎn)生腫瘤壞死因子、干擾素、IgA抗體等。大量的優(yōu)點使乳酸桿菌成為口服疫苗抗原傳遞的活載體最具吸引力的候選者。但是選擇乳酸桿菌作為表達系統(tǒng)最重要的是其安全、沒有內(nèi)毒素，表達的外源蛋白無需純化可直接連同菌體一起服用。再者，由于乳酸桿菌可以在腸道中定植存活，基因工程乳酸桿菌經(jīng)過口服后，其表達的用于治療或免疫作用的蛋白在腸道內(nèi)就可以不斷地被生產(chǎn)并且持續(xù)的發(fā)揮作用。乳酸桿菌表達載體已成功地用于不同的外源蛋白的表達，但是幾乎所有以乳酸桿菌作為宿主菌表達蛋白的效率均不高，因此提高乳酸桿菌表達外源蛋白的能力已經(jīng)成為研究的焦點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種確定β-葡萄糖苷酸酶(gusA)在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達條件，為實現(xiàn)可替代gusA的外源基因在干酪乳桿菌中的表達奠定基礎(chǔ)，確定了干酪乳桿菌作為口服疫苗傳遞載體的可行性及用干酪乳桿菌表達葡萄糖苷酸酶的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的以干酪乳桿菌Lactobacillus casei393為宿主菌，通過細胞表面表達載體pPG611.1以及細胞外分泌表達載體pPG612.1表達β-葡萄糖苷酸酶。
以D-木糖作為誘導(dǎo)物，挑取pPG611.1/L..casei 393和pPG612.1/L..casei 393，接種于含有2％木糖的MRS基本培養(yǎng)基中，同時在木糖中培養(yǎng)不含質(zhì)粒菌L.casei 393和生長于含有2％葡萄糖中的pPG611.1/L..casei 393作為對照培養(yǎng)，37℃靜止培養(yǎng)過夜進行誘導(dǎo)，終止培養(yǎng)后分別取適量菌液做電泳分析；誘導(dǎo)條件為pH值6.0至7.0、補充D-木糖終濃度為1％、乳糖中濃度為0.5mM，30℃靜置培養(yǎng)至菌體濃度為A590OD＝0.50。
本發(fā)明確定目的蛋白均在細胞內(nèi)產(chǎn)生，細胞表面表達的目的蛋白結(jié)合在細胞壁上，而分泌表達的目的蛋白并未在上清中出現(xiàn)，實際上仍然結(jié)合在菌體上。本發(fā)明使用D-木糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)目的蛋白的表達；同時根據(jù)干酪乳桿菌的生長特性，從多方面探索了gusA的最佳誘導(dǎo)表達條件，該系統(tǒng)的高效表達為抗原傳遞奠定了基礎(chǔ)。
1.有效的誘導(dǎo)物本實驗用D-木糖作為pPG611.1/L.casei 393及pPG612.1/L.casei393的誘導(dǎo)物，同時以葡萄糖作為對照，SDS-PAGE結(jié)果顯示D-木糖誘導(dǎo)能夠表達目的蛋白，進一步用Western-blot分析，結(jié)果表明獲得的gusA蛋白具有抗原性。
2.目的蛋白表達的位置結(jié)果表明，干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393及pPG612.1/L.casei393可以在2％D-木糖誘導(dǎo)條件下表達gusA。對于細胞表面表達的載體pPG611.1/L.casei 393，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)其表達的目的蛋白出現(xiàn)在菌體裂解物中；然而，就分泌表達載體pPG612.1/L.casei 393而言，通過對上清液進行透析和冷凍干燥處理后，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測未出現(xiàn)目的蛋白，在菌體沉淀中經(jīng)SDS-PAGE電泳也未看見明顯目的帶，而經(jīng)Western-blot檢測卻發(fā)現(xiàn)菌體沉淀中有目的帶出現(xiàn)，由此證明分泌型表達宿主菌pPG612.1/L.casei 393表達的蛋白也是結(jié)合在細胞壁上的。
3.培養(yǎng)條件對gusA表達量的影響由于分泌型表達的pPG612.1/L.casei 393的目的蛋白經(jīng)試驗證明并未分泌到上清液中，也在菌體沉淀中出現(xiàn)，其試驗方法與細胞表面表達的pPG611.1/L.casei 393相類似，因此，本研究僅以pPG611.1/L.casei 393宿主菌為例從以下幾個方面進行了探索誘導(dǎo)劑的種類、誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的初始pH值及抑制劑葡萄糖的濃度等。通過大量試驗得出最佳表達條件為用pH值在6.0至7.0之間的基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基，補充D-木糖終濃度為1％和乳糖中濃度為0.5mM，30℃靜置培養(yǎng)至菌體濃度為A590OD＝0.50左右時，其表達量達到峰值。
4.乳酸桿菌的裂解由于乳酸桿菌的細胞壁含有大量的肽聚糖，因此乳酸桿菌基因工程的難點之一就在于其難以裂解。一般情況下，裂解大腸桿菌只需一定濃度的SDS即可；相關(guān)資料報道，芽孢桿菌、鏈球菌等G+菌需用5～10mg/ml溶菌酶預(yù)處理1小時，而經(jīng)抗生素篩選后的乳酸桿菌，用10mg/ml溶菌酶處理數(shù)小時幾乎沒有裂解。然而，本試驗中采用的溶菌液成分10mM Tris-HCl，pH8.0，溶菌酶10mg/ml。當(dāng)菌體濃度在A590OD＝0.5左右時，1ml菌液的沉淀加入此種溶菌液100μl充分混勻后，37℃作用30～60minn即可充分裂解，因此，從中抽提質(zhì)?；?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入都變得極其容易，更有利于乳酸桿菌基因工程的發(fā)展和利用。
5.乳酸桿菌基因工程的發(fā)展有著深遠的意義由于乳酸桿菌的GRAS(generally regarded as safe)的特性，表達功能蛋白的乳酸桿菌可通過定居于人或哺乳動物粘膜表面而持續(xù)發(fā)揮作用，從而成為一個良好的表達系統(tǒng)。本研究通過以干酪乳桿菌Lactobacillus casei393為宿主菌表達標(biāo)簽蛋白β-glucuronidasegene(gusA)，確定了新型表達載體pPG611.1/L.casei 393及pPG612.1/L.casei 393的表達條件，成功地實現(xiàn)gusA的高效、穩(wěn)定表達，證明了該載體系統(tǒng)表達的可行性，并探索出其最佳誘導(dǎo)表達條件，為下一步表達外源基因奠定了基礎(chǔ)，也為進一步開發(fā)安全級的新型活載體疫苗誘導(dǎo)黏膜免疫提供了基礎(chǔ)。
四

圖1和圖2是干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393表達gusA的SDS-PAGE電泳分析和Western-blot檢測；圖1中1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白2-3.木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei3934.葡萄糖培養(yǎng)的未誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei3935.木糖誘導(dǎo)的空菌L.casei393圖2中1.木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌L.casei 3932.葡萄糖培養(yǎng)的未誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei3933.木糖培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei3934.乳糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393圖3和圖4是不同濃度木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.393表達gusA的分析；圖5和圖6是干酪乳桿菌pPG611.1/L.393不同誘導(dǎo)時間的SDS-PAGE電泳分析及表達量分析；圖5中1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白2-9.菌體濃度即A590OD值依次為0.252；0.257；0.280；0.310；0.350；0.410；0.510；0.631；0.740時的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393圖7是葡萄糖含量對gusA在干酪乳桿菌pPG611.1/L.393中表達量的影響的SDS-PAGE電泳分析；1.1％木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.393作為陽性對照2.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白3-8.pPG611.1/L.393均培養(yǎng)于1％木糖同時含有不同濃度的葡萄糖的MRS中，其所含有的葡萄糖終濃度依次為0.01％；0.1％；0.5％；1％；2％；3％圖8是SDS-PAGE電泳分析培養(yǎng)溫度對gusA在空載體干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 393中表達量的影響；1.木糖誘導(dǎo)的于28℃培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3932.30℃培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3933.32℃誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3934.37℃木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3935.40℃木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3936.木糖誘導(dǎo)的于42℃培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3937.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖9、10是培養(yǎng)基不同初始pH值對gusA在干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 393中表達量的影響；圖9中1.pH為7.0的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3932.pH為6.5的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3933.pH為6.2的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3934.pH為6.0的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3935.pH為5.5的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3936.pH為5.0的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3937.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖11是震蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)對gusA在pPG611.1/L.393中表達量的影響；1.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白2.靜止培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 393
3.70rpm震蕩培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 3934.186rpm震蕩培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 393圖12是干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei 393的SDS-PAGE和Western-blot檢測。
1.1％木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei 393對為陽性對照2.經(jīng)透析濃縮50倍后的1％木糖誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei 393的上清液3.冷凍干燥濃縮50倍后誘導(dǎo)的干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei393的上清液4.葡萄糖培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei 393的菌體沉淀作為對照5.木糖誘導(dǎo)的空菌L.casei 393菌體沉淀作為陰性對照6.1％木糖誘導(dǎo)的于30℃培養(yǎng)的干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei393的菌體沉淀五具體實施方式
下面舉例對本發(fā)明作更詳細的描述1木糖誘導(dǎo)gusA表達以D-木糖作為誘導(dǎo)物，挑取pPG611.1/L..casei 393和pPG612.1/L..casei 393，接種于含有2％木糖的MRS基本培養(yǎng)基中，同時在木糖中培養(yǎng)不含質(zhì)粒菌L.casei 393和生長于含有2％葡萄糖中的pPG611.1/L..casei 393作為對照培養(yǎng)，37℃靜止培養(yǎng)過夜進行誘導(dǎo)，終止培養(yǎng)后分別取適量菌液做電泳分析。
2最佳木糖濃度的確定將適量的pPG611.1/L..casei 393接于含不同濃度木糖的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置過夜培養(yǎng)，D-木糖濃度分別為0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％，誘導(dǎo)結(jié)束取菌液做電泳分析，進一步通過光密度掃描對表達產(chǎn)物進行初步定量分析，得出最佳誘導(dǎo)濃度。
3最佳誘導(dǎo)時間的確定將過夜誘導(dǎo)的5ml菌液以4000r/min離心3min，棄去約4ml上清液后，重新懸浮菌體沉淀加入到20ml含2％D-木糖的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，于適當(dāng)時間取菌液用分光光度計測A590OD值，然后每隔一小時測定一次并取菌液處理，做SDS-PAGE分析，以此得出pPG611.1/L..casei 393表達gusA的最佳誘導(dǎo)時間或OD值。
4葡萄糖濃度對表達量的影響將pPG611.1/L..casei 393接于不同濃度葡萄糖的MRS中37℃靜置培養(yǎng)，葡萄糖終濃度分別為0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％，木糖誘導(dǎo)的終濃度均為2％，終止培養(yǎng)后分別取適量菌液做電泳分析及光密度掃描對表達產(chǎn)物進行定量分析。
5最佳誘導(dǎo)表達溫度的確定由于干酪乳桿菌最適生長溫度為37℃，但是在溫度低于30℃或高于40℃時仍能生長。因此將2％D-木糖誘導(dǎo)的pPG611.1/L..casei393分別靜置培養(yǎng)于不同的溫度，過夜誘導(dǎo)，電泳分析，確定表達量達到最大時的溫度。
6最適培養(yǎng)基初始pH值的確定將pPG611.1/L.casei 393分別接于不同初始pH值(pH5.0、5.5、6.0、6.2、6.5和7)的2％D-木糖的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置過夜誘導(dǎo)，處理菌液電泳分析結(jié)果。
7不同培養(yǎng)方式對表達量的影響將pPG611.1/L..casei 393的單個菌落分別接入2％D-木糖的MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于37℃搖床中以186rpm或70rpm震蕩培養(yǎng)過夜和37℃靜置培養(yǎng)過夜及電泳分析。
8表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-blot分析干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393為細胞表面表達。取過夜培養(yǎng)的菌液經(jīng)溶菌酶處理后進行SDS-PAGE樣品制備并分析；干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei393為細胞外表達，可將蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因此取過夜培養(yǎng)的菌液離心后，保留上清分別進行4℃透析和冷凍干燥以50倍濃縮后進行SDS-PAGE樣品制備并分析；為防止干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei393表達蛋白仍然結(jié)合在菌體上，故將誘導(dǎo)的菌液離心后所得菌體沉淀也進行SDS-PAGE電泳分析。本研究中表達量的數(shù)據(jù)均由dual wavelength TLC scanner(Shimadzu CS-930)分析所得。
9實驗結(jié)果
9.1干酪乳桿菌pPG611.1/L.casei393表達gusA基因的條件9.1.1木糖誘導(dǎo)gusA表達的SDS-PAGE和Western-blot檢測結(jié)果將木糖以及葡萄糖過夜培養(yǎng)的pPG611.1/L.casei393菌液處理后進行電泳分析(圖1、2)，同時將空菌L.casei393培養(yǎng)于木糖中作陰性對照。電泳圖顯示僅有D-木糖誘導(dǎo)的pPG611.1/L.casei393在75KD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，該分子量與gusA基因表達產(chǎn)物理論值相符合。由此電泳結(jié)果(圖1)可初步證明重組菌培養(yǎng)于2％D-木糖中可以表達gusA目的蛋白，進一步用Western blot來檢測目的蛋白(圖2)，結(jié)果表明獲得的gusA蛋白具有抗原性。
9.1.2最佳木糖濃度的確定將干酪乳桿菌培養(yǎng)于含有不同濃度木糖的MRS中，其電泳結(jié)果如圖3，從圖可以分析出由不同濃度D-木糖誘導(dǎo)的pPG611.1/L.casei393的gusA的表達量趨勢當(dāng)木糖含量低于0.5％時基本檢測不到表達的gusA，通過光密度掃描分析可知當(dāng)木糖含量為1％時，gusA的表達量最高為菌體總蛋白的12.8％，而木糖濃度大于1％時，其表達量并未隨著木糖含量的增加而增加，相反有下降的趨勢。多次誘導(dǎo)電泳分析其表達量與木糖含量關(guān)系如圖49.1.3最佳誘導(dǎo)時間的確定該菌在木糖中生長緩慢，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋進行擴大培養(yǎng)約6h后才出現(xiàn)明顯混濁，每小時取一次菌液測定A590OD值并留樣電泳。不同A590OD值電泳結(jié)果如圖5，由該圖可以看出當(dāng)A590OD小于0.51時，gusA在pPG611.1/L.393中的表達量隨誘導(dǎo)時間即A590OD的增加而增加，而當(dāng)菌體濃度繼續(xù)上升時，其表達目的蛋白的量不再增加。經(jīng)分析其最大表達量可達到菌體總蛋白的14％，其表達量趨勢如圖6。
9.1.4葡萄糖濃度對表達量的影響幾乎在所有載體中表達β-glucuronidase均受到葡萄糖的抑制，即使有誘導(dǎo)物出現(xiàn)。為了檢測分析本實驗中g(shù)usA的表達是否也受到葡萄糖的抑制及抑制程度，進行了不同濃度葡萄糖的抑制試驗，結(jié)果如圖7，培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度對gusA的表達有明顯的抑制作用。當(dāng)葡萄糖終濃度為0.1％以下時基本不影響目的基因的表達量，而當(dāng)其含量達到0.5％時，即使培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑D-木糖的含量不變，其表達的目的帶也僅是隱約可見，說明表達量已開始下降，至葡萄糖濃度達到2％時，基本看不到表達的目的帶。說明葡萄糖的含量是影響表達量的一個重要因素。
9.1.5最佳誘導(dǎo)表達溫度的確定將干酪乳桿菌pPG611.1/L.393分別于不同溫度培養(yǎng)進行電泳分析，結(jié)果如圖8。該圖表明溫度是影響gusA表達的重要因素，28℃培養(yǎng)的菌液也可以表達gusA，30℃(表達量占菌體總蛋白的13.4％)和32℃(表達量占菌體總蛋白的12.5％)其表達量明顯大于37℃(表達量占菌體總蛋白的11.2％)，而隨著溫度的繼續(xù)增高其表達量明顯下降，40℃幾乎肉眼難以看見目的帶，而培養(yǎng)在42℃的表達量雖然較30℃也明顯下降但仍可觀察到明顯的目的帶，由此說明溫度是影響表達量的重要因素，該結(jié)果還說明目的基因在pPG611.1/L.casei393中表達的溫度范圍基本與干酪乳桿菌生長的溫度相同，較寬的溫度范圍有利于pPG611.1/L.casei393作為抗原傳遞的活載體定值于不同的動物機體內(nèi)。
9.1.6最適培養(yǎng)基初始pH值的確定干酪乳桿菌生長的最適pH為5.5-6.2，但在pH值為5.5以下的酸性環(huán)境中亦能生長，為了檢測表達gusA的重組菌對培養(yǎng)基的pH要求是否相同，將其培養(yǎng)在不同初始pH的MRS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。結(jié)果(見圖9、10)發(fā)現(xiàn)當(dāng)其生長在pH為5.0的培養(yǎng)基中時速度明顯慢于在其他幾個pH中的。而將不同PH值中誘導(dǎo)的菌液進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PH值低于5.5時，gusA在pPG611.1/L.casei 393中的表達量下降，當(dāng)pH值為5.0時基本看不到表達的目的蛋白帶。pH值在6.0和7.0之間時，其表達量相差不大。由于乳酸桿菌在生長過程中會使培養(yǎng)液酸化，因此若在整個誘導(dǎo)過程中始終保持pH在6.0至7.0之間時，其表達蛋白的能力會極大的加強。
9.1.7不同培養(yǎng)方式對表達量的影響因干酪乳桿菌為微嗜氧菌，故靜止培養(yǎng)應(yīng)該更有利于其生長和表達目的基因，檢測結(jié)果表明進行37℃不同轉(zhuǎn)速的震蕩培養(yǎng)和37℃靜置培養(yǎng)，gusA的表達量差異不大，從電泳圖11中可以看出靜置培養(yǎng)時表達量略高于震蕩培養(yǎng)時，說明振蕩培養(yǎng)或靜止培養(yǎng)對其表達量影響不大。
9.2干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei393表達gusA基因的條件誘導(dǎo)的分泌表達干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei 393上清液分別經(jīng)透析和冷凍干燥濃縮50倍后，SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測均未出現(xiàn)目的蛋白，表明其目的蛋白并未分泌到培養(yǎng)基中。而將pPG612.1/L.casei 393的菌體沉淀經(jīng)Western-blot檢測后在大約72KD處出現(xiàn)明顯的目的帶(見圖12)，由此說明干酪乳桿菌pPG612.1/L.casei 393表達的gusA目的蛋白并未分泌到上清中，而是結(jié)合在菌體上。
權(quán)利要求
1.一種β-葡萄糖苷酸酶在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達方法，其特征是以干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393為宿主菌，通過細胞表面表達載體pPG611.1以及細胞外分泌表達載體pPG612.1表達β-葡萄糖苷酸酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酸酶在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達方法，其特征是以D-木糖作為誘導(dǎo)物，挑取pPG611.1/L..casei 393和pPG612.1/L..casei 393，接種于含有2％木糖的MRS基本培養(yǎng)基中，同時在木糖中培養(yǎng)不含質(zhì)粒菌L.casei 393和生長于含有2％葡萄糖中的pPG611.1/L..casei 393作為對照培養(yǎng)，37℃靜止培養(yǎng)過夜進行誘導(dǎo)，終止培養(yǎng)后分別取適量菌液做電泳分析；誘導(dǎo)條件為pH值6.0至7.0、補充D-木糖終濃度為1％、乳糖中濃度為0.5mM，30℃靜置培養(yǎng)至菌體濃度為A590OD＝0.50。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種β－葡萄糖苷酸酶在干酪乳桿菌表達系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達方法。以干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393為宿主菌，通過細胞表面表達載體pPG611.1以及細胞外分泌表達載體pPG612.1表達β－葡萄糖苷酸酶。本發(fā)明確定目的蛋白均在細胞內(nèi)產(chǎn)生，細胞表面表達的目的蛋白結(jié)合在細胞壁上，而分泌表達的目的蛋白并未在上清中出現(xiàn)，實際上仍然結(jié)合在菌體上。本發(fā)明使用D－木糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)目的蛋白的表達；同時根據(jù)干酪乳桿菌的生長特性，從多方面探索了gusA的最佳誘導(dǎo)表達條件，該系統(tǒng)的高效表達為抗原傳遞奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N9/24GK101050450SQ20071007189
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日
發(fā)明者李一經(jīng), 唐麗杰, 葛俊偉, 任曉峰, 夏春麗 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)