專利名稱：一種高增殖力、高細胞毒活性cik細胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞的制備方法。
背景技術(shù)：
細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK細胞)，是將人外周血、臍血或骨髓的單個核細胞在體外用細胞因子培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞。由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)限制性殺瘤優(yōu)點。但是現(xiàn)有的CIK細胞增殖力差、細胞毒活性低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的CIK細胞增殖力差、細胞毒活性低的問題，而提供的一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法。
高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞按以下步驟制備將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-2的濃度為600U/mL、細胞因子IL-12的濃度為5ng/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO2濃度為5％、濕度為100％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)7～24天，即得到高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-2和IL-12以保持培養(yǎng)液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。
本發(fā)明采用基因重組人細胞因子IL-2和IL-12聯(lián)合誘導(dǎo)CIK細胞，細胞因子的聯(lián)合應(yīng)用可以對淋巴細胞的擴增產(chǎn)生協(xié)同作用，比使用單一細胞因子誘導(dǎo)細胞的擴增倍數(shù)提高了約1倍，并且減少了因大劑量單因子應(yīng)用所產(chǎn)生的毒副作用。本發(fā)明制備出的CIK細胞的細胞毒活性明顯高于現(xiàn)有CIK細胞50％以上，而且細胞毒活性可維持2～3周，CIK細胞最高殺傷率出現(xiàn)在培養(yǎng)的第13～15天。


圖1是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的(第一組)CIK細胞CD3+CD56+表型檢測結(jié)果圖；圖2是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的(第二組)CIK細胞CD3+CD56+表型檢測結(jié)果圖；圖3是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的(第三組)CIK細胞CD3+CD56+表型檢測結(jié)果圖；圖4是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)3天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態(tài)光學(xué)顯微鏡觀察圖；圖5是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態(tài)光學(xué)顯微鏡觀察圖；圖6是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2誘導(dǎo)培養(yǎng)10天的(第一組)CIK細胞擴增集落形態(tài)光學(xué)顯微鏡觀察圖；圖7是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)10天的(第三組)CIK細胞擴增集落形態(tài)光學(xué)顯微鏡觀察圖；圖8是具體實施方式
二中經(jīng)基因重組人細胞因子IL-2和基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)培養(yǎng)10天的(第二組)CIK細胞擴增集落形態(tài)光學(xué)顯微鏡觀察圖；圖9是具體實施方式
二中三組CIK細胞增殖曲線圖，曲線A為第一組細胞增殖曲線，曲線B為第二組細胞增殖曲線，曲線C為第三組細胞增殖曲線。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞按以下步驟制備將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-2的濃度為600U/mL、細胞因子IL-12的濃度為5ng/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO2濃度為5％、濕度為100％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)7～24天，即得到高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-2和IL-12以保持培養(yǎng)液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。
本實施方式可重復(fù)性好(可重復(fù)率達到67.7％)，誘導(dǎo)率(表達CD3和CD56抗性)高，為(20.89±0.5)％，這是因為IL-2與IL-12的聯(lián)合應(yīng)用可以對淋巴細胞的擴增產(chǎn)生協(xié)同作用。
本實施方式高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞對低分化胃腺癌BGC-823細胞株具有較高的殺傷率，效靶比為40∶1時，殺傷率為(80.19±1.86)％，而現(xiàn)有方法制備的CIK細胞的抑瘤率僅為(52.60±4.33)％。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是單個核細胞是采用Ficoll密度梯度分離法從健康成人外周血中分離得到外周血單個核細胞。其它與實施方式一相同。
對比實驗對外周血單個核細胞(PBMC)進行不同的細胞因子誘導(dǎo)，第一組PBMC采用基因重組人細胞因子IL-2誘導(dǎo)(將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-2和IL-1，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-2的濃度為600U/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO2濃度為5％、濕度為100％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)10天；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-2以保持培養(yǎng)液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。)，第二組采用本實施方式，第三組PBMC采用基因重組人細胞因子IL-12誘導(dǎo)(將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-12和IL-1，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-12的濃度為5ng/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO2濃度為5％、濕度為100％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)10天；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-12和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-12以保持培養(yǎng)液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-12和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。)。
1、CIK細胞免疫表型測定分別取檢測用抗體鼠抗人CD3-Percp/CD4-FITC/CD8-PE和CD3-FITC/CD56-PE及同亞型對照抗體兔抗鼠IgG1各20μL加入流式細胞儀(Flow cytometer，F(xiàn)CM)專用試管內(nèi)；另取三組(第一組、第二組和第三組)分別培養(yǎng)7、14、21天的CIK細胞用不含鈣和鎂離子的PBS緩沖液洗2次后加入已裝有抗體的FCM管內(nèi)，在4℃、避光的條件下孵育30min，并每隔10min搖晃FCM管1次；之后用PBS緩沖液洗2次，立即上流式細胞儀進行分析，結(jié)果采用CellQuest Pro軟件分析，分析結(jié)果如表1所示，三組培養(yǎng)21天的CIK細胞CD3+CD56+表型檢測結(jié)果分別如圖1、圖2和圖3所示。
表1

表1中經(jīng)7天誘導(dǎo)，CIK細胞中CD3+細胞比例明顯增加，尤以CD3+和CD8+亞群細胞增加為主，CD3+CD56+亞群開始明顯擴增；誘導(dǎo)2周后CD3+CD56+細胞擴增達到高峰期，本實施方式(第二組)擴增比例明顯高于另外兩組；三組不同誘導(dǎo)時間之間表型均具有顯著差異(P＜0.05)，但三組在相同時間下細胞表型沒有明顯差異。說明本實施方式對CIK細胞免疫表型無影響。圖2與圖1、圖3對比，本實施方式培養(yǎng)21天的CIK細胞中CD3+CD56+細胞占(20.89±0.5)％，說明本實施方式對CD3+CD56+細胞有較強的誘導(dǎo)作用。
2、觀察CIK細胞擴增集落形態(tài)及增殖活性測定用光學(xué)顯微鏡觀察三組細胞擴增集落形態(tài)的變化，并記錄三組細胞的集落情況，第二組(本實施方式)剛提取的單個核細胞大小較均一，折光性較一致，誘導(dǎo)第3天可見大量細胞死亡，少數(shù)細胞開始呈集落生長，但集落較小(細胞數(shù)約為10個)，細胞體積增大，出現(xiàn)多形性，胞核中可見多量顆粒，為大顆粒淋巴細胞(LGL)，如圖4所示；第6天觀察細胞集落明顯增多而且增大，在肉眼下即可以看到白色的斑點集落，鏡下單位集落組成細胞數(shù)明顯增多，色深，細胞呈堆積樣，圍繞集落周圍有很多的細胞游出，細胞飽滿折光性好，大小形態(tài)各異，如圖5所示。
第一組和第三組早期集落較少，隨著誘導(dǎo)時間延長，集落數(shù)顯著增加，第10天每孔集落(細胞數(shù)＞40)數(shù)分別為54.2±8.3和48.8±6.3，但集落組成細胞數(shù)較少，單位集落的細胞數(shù)多為50～80左右，分別如圖6和圖7所示。第二組(本實施方式)在早期即有很多的小集落形成，隨著培養(yǎng)時間延長，集落數(shù)增多較第一組顯著減少(P＜0.05)，為32.5±9.7，但集落組成細胞數(shù)多，單位集落的細胞數(shù)多為150個以上，如圖8所示。說明聯(lián)合IL-12和IL-2誘導(dǎo)的CIK細胞具高增殖力。
每組取細胞濃度為1×106/mL的細胞懸液1mL，鋪于24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，每3天補充新鮮培養(yǎng)液和細胞因子，同時取樣進行細胞計數(shù)，用臺盼藍拒染法計數(shù)細胞總數(shù)并計算平均值，根據(jù)細胞增殖倍數(shù)繪制生長曲線，如圖9所示。動態(tài)監(jiān)測CIK細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)三組CIK細胞均在培養(yǎng)第3天開始增殖，培養(yǎng)第14天進入快速增殖期，21天以后增殖趨于緩慢進入平臺期，用血細胞計數(shù)儀計算培養(yǎng)10天細胞擴增倍數(shù)結(jié)果基本與觀察結(jié)果一致，第二組(本實施方式)細胞(曲線B)的擴增倍數(shù)最高，為10.62±0.33倍，其次為第一組細胞(曲線A)擴增倍數(shù)為6.14±0.49倍，而第三組細胞(曲線C)擴增倍數(shù)為5.66±0.23倍，三組間有顯著性差異(P＜0.05)顯示出第二組(本實施方式)IL-12聯(lián)合IL-2有較好的擴增效果，可比單純應(yīng)用IL-2或IL-12的細胞數(shù)增加約1倍。
3、細胞毒活性的測定取對數(shù)生長期的低分化胃腺癌細胞株(BGC-823)細胞作為靶細胞，并重懸靶細胞濃度為1×105/mL、5×104/mL、2.5×104/mL，每孔100μL鋪于96孔平底板中，置于37℃、CO2體積濃度為5％的環(huán)境中培養(yǎng)，靶細胞培養(yǎng)24h后將三組CIK細胞重懸為1×106/mL加入96孔板中，使每孔內(nèi)效應(yīng)細胞與靶細胞的比例分別為10∶1、20∶1和40∶1，各濃度設(shè)4個復(fù)孔，并設(shè)未與腫瘤靶細胞反應(yīng)的各組CIK細胞為效應(yīng)細胞空白對照，未與CIK反應(yīng)的各濃度BGC-823為靶細胞的空白對照。培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為5mg/mL的噻唑藍(MTT)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，翻板棄去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100μL，于570nm處測定吸光度A值，計算殺傷率。

CIK細胞的細胞毒活性(殺傷率)如表2所示，表2中不同效靶比(E∶T)，第二組(本實施方式)CIK細胞對BGC-823的特異性殺傷率均顯著高于的第一組和第三組CIK細胞(P＜0.05)，而第一組和第三組CIK細胞在殺傷活性上不存在顯著差異(P＞0.05)，三組組內(nèi)不同效靶比之間均存在顯著性差異(P＜0.05)。研究發(fā)現(xiàn)第二組(本實施方式)CIK細胞的細胞毒活性可維持2～3周，CIK細胞最高殺傷率出現(xiàn)在培養(yǎng)的第13～15天。
表2

**P＜0.01，ΔΔP＜0.01本實施方式中基因重組人IL-2購自于江蘇金絲利藥業(yè)有限公司，CD3單抗體蛋白購自于北京天廣實生物技術(shù)有限公司，基因重組人IFN-γ、基因重組人IL-1、基因重組人IL-12購自于美國PEPRO TECH公司，抗體鼠抗人CD3-Percp/CD4-FITC/CD8-PE和CD3-FITC/CD56-PE及同亞型對照抗體兔抗鼠IgG1購自于美國BD公司，淋巴細胞分離液Ficoll相對密度為1.077購自于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，MTT溶液購自于北京索萊寶科技有限公司。
權(quán)利要求
1.一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法，其特征在于高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞按以下步驟制備將單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮2h，之后加入基因重組人細胞因子IFN-γ，使懸浮液中IFN-γ的濃度為1000U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度為100ng/mL、細胞因子IL-2的濃度為600U/mL、細胞因子IL-12的濃度為5ng/mL、細胞因子IL-1的濃度為100U/mL，然后再在37℃、CO2濃度為5％、濕度為100％的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)7～24天，即得到高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞；其中加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后每隔3天半量換液，并補加IL-2和IL-12以保持培養(yǎng)液中的濃度不變；加入CD3單抗體蛋白和基因重組人細胞因子IL-2、IL-12和IL-1后第6天再補加CD3單抗體蛋白，使培養(yǎng)液中CD3單抗體蛋白的濃度達到100ng/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法，其特征在于單個核細胞是采用Ficoll密度梯度分離法從健康成人外周血中分離得到外周血單個核細胞。
全文摘要
一種高增殖力、高細胞毒活性CIK細胞的制備方法，它涉及一種細胞的制備方法。它解決了現(xiàn)有的CIK細胞增殖力差、細胞毒活性低的問題。細胞制備向單個核細胞內(nèi)加入基因重組人細胞因子IFN－γ、CD3單抗體蛋白及基因重組人細胞因子IL－2、IL－12和IL－1，再在37℃、CO
文檔編號C12N5/08GK101063108SQ20071007209
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者王志華, 秦莉 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)