專(zhuān)利名稱(chēng)：同化甲醛基因植物表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同化甲醛基因植物表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們的居住條件得到了 較大改善。隨著居住面積的增大，室內(nèi)裝修成了人們美化居室環(huán)境的重要一環(huán)， 但裝修的同時(shí)也引發(fā)了嚴(yán)重的室內(nèi)環(huán)境污染問(wèn)題。造成室內(nèi)空氣污染最具有代 表性的化學(xué)物質(zhì)是甲醛。由于裝修和家具制造要使用大量人造板材，而生產(chǎn)人 造板材需大量使用毒性高的甲醛為原料制造的膠粘劑，膠粘劑中的甲醛釋放期 很長(zhǎng)， 一般長(zhǎng)達(dá)15年，導(dǎo)致甲醛成為室內(nèi)空氣中的主要污染物。
研究表明，甲醛具有強(qiáng)烈的致癌和促癌作用。大量文獻(xiàn)記載，其濃度達(dá)到
0.06 -0.07 mg/ 1113時(shí)，兒童就會(huì)發(fā)生輕微氣喘。濃度高時(shí)，可引起惡心嘔吐， 咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫。長(zhǎng)期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引 起鼻咽癌、白血病，青少年記憶力和智力下降等。在所有接觸者中，兒童和孕 婦對(duì)甲醛尤為敏感，危害也就更大。
目前，常見(jiàn)居室甲醛污染凈化措施主要有三類(lèi)。 一是通過(guò)電動(dòng)風(fēng)扇的循環(huán)作
用和過(guò)濾吸附裝置實(shí)現(xiàn)快速清除污染物的產(chǎn)品，但耗能較大，尤其是針對(duì)裝修導(dǎo)
致的污染，需要常年運(yùn)行，成本較高。在污染物發(fā)散后期，因污染濃度降低，這種
措施的效果也會(huì)隨之降低。二是使用化學(xué)或天然產(chǎn)物，通過(guò)揮發(fā)或涂抹的方式降
解。吸附或以芳香氣味遮蓋有害氣體的產(chǎn)品，具有原理不可知性、操作煩瑣和潛
在二次污染等特點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)逐步退出市場(chǎng)。三是用納米Ti02催化氧化或臭
氧氧化法:實(shí)驗(yàn)表明在紫外光條件下,濃度小于10mg/ m 3的甲醛能被完全凈化，
但用太陽(yáng)光照射時(shí)，凈化效率僅為35 %。納米Ti02催化氧化法必須用納米Ti02
和紫外光，這將使此方法推廣帶來(lái)經(jīng)濟(jì)和技術(shù)的局限性;臭氧法凈化效率低，同
時(shí)臭氧易分解，不穩(wěn)定。近年來(lái)，利用植物凈化空氣的報(bào)道逐漸增多。美國(guó)科學(xué)家威廉，沃維爾經(jīng) 過(guò)多年測(cè)試，發(fā)現(xiàn)很多種綠色植物都能一定程度地吸收空氣中的化學(xué)物質(zhì)并將 它們轉(zhuǎn)化為自己的養(yǎng)料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達(dá)盒與6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶 基因的表達(dá)盒重組，構(gòu)建同化甲醛基因植物表達(dá)載體。
上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其組成包括在植物細(xì)胞中葉片特異表達(dá)型 的啟動(dòng)子、組成型表達(dá)的啟動(dòng)子、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、 6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶、終止子和篩選標(biāo)記基因，將3-己酮糖-6-磷酸合酶基 因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因重組到植物細(xì)胞表達(dá)的載體上，該載體的轉(zhuǎn)基 因植物葉綠體含有3-己酮糖-6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶。
所述3-己酮糖-6-磷酸合酶基因表達(dá)產(chǎn)物為3-己酮糖-6-磷酸合酶，3-己 酮糖-6-磷酸合酶基因的5'端組裝葉綠體特異表達(dá)型啟動(dòng)子PrbcS，它能使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因在植物葉綠體細(xì)胞特異表達(dá)，3-己酮糖-6-磷酸合酶基 因的3'端組裝了nos終止子。
所述6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)產(chǎn)物為6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶。
其特征在于6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因的5'端組裝CaMV35S啟動(dòng)子和葉綠體 轉(zhuǎn)運(yùn)肽核苷酸序列，它們能使6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因在植物葉綠體特異表 達(dá)；6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因的3'端組裝了polyA終止子。
所述的基因重組方式是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達(dá)盒與6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶的表達(dá)盒串聯(lián)，使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因與6-磷酸-3-己酮糖 異構(gòu)酶基因在植物葉綠體特異表達(dá)。
所述的篩選基因是將所述載體的質(zhì)粒組裝潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(/^//7) 基因，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行篩選。
所述的同化甲醛基因，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶 基因可以來(lái)自專(zhuān)性甲基營(yíng)養(yǎng)菌，也可以來(lái)自兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌及其他細(xì)菌。
技術(shù)方案有以下有益效果1. 本發(fā)明所述載體含有的兩個(gè)基因表達(dá)的產(chǎn)物可以定位到植物葉綠體細(xì) 胞，其產(chǎn)物可以同化甲醛進(jìn)入到植物光合作用的卡爾文循環(huán)，使其轉(zhuǎn)化為植物 生長(zhǎng)的養(yǎng)料，將該載體轉(zhuǎn)化具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的觀賞花卉植物，從而提高其同化甲 醛的能力，對(duì)于凈化空氣甲醛污染具有重要的意義。
2. 以往通過(guò)電動(dòng)風(fēng)扇的循環(huán)作用和過(guò)濾吸附裝置實(shí)現(xiàn)快速清除污染物的 產(chǎn)品，耗能較大,尤其是針對(duì)裝修導(dǎo)致的污染，需要常年運(yùn)行，成本較高。在污染 物發(fā)散后期，因污染濃度降低，這種措施的效果也會(huì)隨之降低。本發(fā)明利用光合 作用將甲醛同化，將甲醛轉(zhuǎn)化為植物的養(yǎng)料，進(jìn)行良性的循環(huán)，而且作用持久。
3. 以往使用化學(xué)或天然產(chǎn)物，通過(guò)揮發(fā)或涂抹的方式降解、吸附或以芳香氣 味遮蓋有害氣體的產(chǎn)品，具有原理不可知性、操作煩瑣和潛在二次污染等缺點(diǎn)， 與此相比，本發(fā)明采用純生物過(guò)程，將微生物代謝甲醛的關(guān)鍵酶引入植物，原 理清楚，無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)異味，不會(huì)造成二次污染，而且操作簡(jiǎn)便。
4. 以往用納米Ti02催化氧化法凈化甲醛廢氣，必須用納米Ti02和紫外 光,具有經(jīng)濟(jì)和技術(shù)的局限性，不易推廣。而臭氧法凈化效率低，同時(shí)臭氧易分
解，不穩(wěn)定。本發(fā)明將微生物代謝甲醛的關(guān)鍵酶引入植物表達(dá)載體，用該載體的 轉(zhuǎn)基因植物凈化甲醛污染，具有成本低、效果持久、穩(wěn)定性好和操作方便等優(yōu) 點(diǎn)。
5. 對(duì)于短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的高濃度甲醛污染，居室內(nèi)有限的天然觀賞植物顯然 不能立即清除。從生物學(xué)本能來(lái)看，植物對(duì)有害于生物的化學(xué)氣體可能過(guò)多地吞 噬，而且在吸入一定量后會(huì)導(dǎo)致中毒或影響生長(zhǎng)。所以，要利用居室內(nèi)有限的植 物，凈化被嚴(yán)重污染的空氣，就需要強(qiáng)化植物的這種功能，使之凈化效果更高， 自身的耐受能力更強(qiáng)，本發(fā)明為利用植物基因工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了 可能。
6. 3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶是核酮糖單磷酸途徑 的關(guān)鍵酶。該途徑最初是在甲基營(yíng)養(yǎng)菌中發(fā)現(xiàn)的，但是最近的數(shù)據(jù)表明固定甲 醛的反應(yīng)分布更廣泛，不僅是甲基營(yíng)養(yǎng)菌，與3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸 -3-己酮糖異構(gòu)酶基因同源的基因也在許多非甲基營(yíng)養(yǎng)生物中發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)菌和 古生菌，其分布廣泛，不用浪費(fèi)廣大的人力物力去尋找同源基因。
7. 在植物光合作用的卡爾文循環(huán)中存在核酮糖-5-磷酸Ru5P，甲醛與Ru5P在3-己酮糖-6-磷酸合酶作用下，可以合成3-己酮糖-6-磷酸Hu6P，在6-磷酸 -3-己酮糖異構(gòu)酶的作用下Hu6P可以轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，而果糖-6-磷酸可以 繼續(xù)加入到光合作用的卡爾文循環(huán)中。所以，如果把3-己酮糖-6-磷酸合酶和 6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因?qū)氲街参锶~綠體基因組，則可以將3-己酮糖-6-磷酸合酶和3-己酮糖-6-磷酸異構(gòu)酶在葉綠體內(nèi)大量表達(dá)，通過(guò)光合作用把甲醛 同化，使甲醛成為植物可以利用的養(yǎng)料，從而可以實(shí)現(xiàn)利用葉綠體轉(zhuǎn)基因植物 凈化甲醛污染的目的，為降低空氣甲醛污染創(chuàng)造一條嶄新的途徑。
這兩個(gè)關(guān)鍵酶可以同化甲醛進(jìn)入到植物光合作用的卡爾文循環(huán)，使甲醛轉(zhuǎn) 化為植物生長(zhǎng)的養(yǎng)料。將該載體轉(zhuǎn)化具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的觀賞花卉植物，從而提高 植物同化甲醛的能力，對(duì)于凈化空氣甲醛污染具有重要的意義。


附圖1本發(fā)明同化甲醛基因植物表達(dá)載體pBIRYG的構(gòu)建路線圖。
附圖2載體pBIRYG的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的pBluescriptlISK(+)、 pRBykG
載體圖譜。
附圖3載體pBIRYG的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的載體pBI121、 pBIRYG圖譜。 附圖4本發(fā)明同化甲醛基因植物表達(dá)載體pCMTPYF的構(gòu)建路線圖。 附圖5載體pCMTPYF的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的pBluescript SK(+)、 pTP載 體圖譜。
附圖6載體pCMTPYF的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的pHS、 pCAMBIA1300載體圖譜。 附圖7載體pCMTPYF的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的pTPykF、 pC35載體圖譜。 附圖8載體pCMTPYF的構(gòu)建過(guò)程中涉及到的pC35TPykF、 pCMTPYF載體圖譜。
附圖9本發(fā)明同化甲醛基因植物表達(dá)載體pCMGF的構(gòu)建路線圖。 附圖IO本發(fā)明同化甲醛基因植物表達(dá)載體pCMGF圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
同化甲醛基因植物表達(dá)載體pBIRYG的構(gòu)建1.1 3-己酮糖-6-磷酸合酶(yckG)基因的克隆
根據(jù)GenBank中登錄的枯草芽孢桿菌的3-己酮糖-6-磷酸合酶基因(以下簡(jiǎn) 稱(chēng)yckG)序列設(shè)計(jì)引物P1，P2 (引物序列見(jiàn)表1. 1. 1) , Pl的5'端加上Sphl 酶切位點(diǎn)，P2的5'端加上PstI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR的方法(PCR反應(yīng)體系見(jiàn) 表1.1.2， PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表1.1.3)擴(kuò)增到500bp的片段。經(jīng)測(cè)序(送交上海 生工)，該基因片段為527bp，與GenBank登錄的yckG基因的序列完全相同。 表1. 1. 1 PCR引物P1，P2序列 P1:5' -ATCGCATGCATGGAATTACAGCTTGC-3' P2:5 ， -CACCTGCAGTCAGGCTTTTGCTGGATC-3 ，
表1. 1.2 PCR反應(yīng)體系 Template薩 1 u 1
10 x buffer 2.5ul dNTP Mix(2. 5mM) 2u 1
Primer 1(10uM) 1 U 1
Primer 2(10uM) 1 u 1
Ex Taq polymerase (5U/iil) 0. 5 u 1
ddH20 17 ul
Total 25ul 表l. 1.3 PCR擴(kuò)增條件
94°C5min
94。C30s ，
55°C30s >
72 °C50s ^
72 。ClOmin
30 cycles
1. 2將yckG基因置于PrbcS啟動(dòng)子下
將yckG基因用Sphl/PstI雙酶切(雙酶切反應(yīng)及電泳體系見(jiàn)表1.2)，經(jīng)
瓊脂糖凝膠電泳后，利用Gel Extraction kit (Takara， 以下同)回收530bp 的片段，將含有PrbcS啟動(dòng)子的載體pRBCS也用Sphl/PstI雙酶切，回收4. 6kb 的片段，將此片段與yckG基因530bp的片段按摩爾比1: 3的比例在T4DNA連接酶的作用下連接30分鐘，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，將轉(zhuǎn)化后的菌液均 勻涂于LB (50mg/LAmp)固體平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落做菌落PCR(引物用 P1，P2，反應(yīng)體系同上)，初步篩選克隆重組菌，獲得了 5個(gè)陽(yáng)性克隆菌。再將 菌落PCR中的陽(yáng)性克隆菌接種于LB (50mg/L Amp)液體培養(yǎng)基中，搖菌18小時(shí)， 堿裂解法提取質(zhì)粒，用Pstl+Sphl雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果切出了 530bp的 片段，證明yckG基因已經(jīng)成功地插入到pRBCS載體中，將此載體命名為pBRykG。 表1. 2 Sphl/Pstl雙酶切反應(yīng)及電泳體系
質(zhì)粒載體DNA 20 u 1
IOX反應(yīng)緩沖液 5.0 ul
Hindin(雨/u 1) 2 y 1
Sphl (8U/ul) 2.5ul
ddH20 20. 5 iil
Total 50 yl
37。C條件下保溫3小時(shí)，然后用IXTAE(O. 04mol/L Tris-乙酸，0. 001mol/L EDTA)電泳緩沖液配置1. 0%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖中加入溴化乙錠(EB)至終 濃度為O. 5ug/ml，在3-5V/cm的電壓下電泳。
1.3將PrbcS-yckG片段克隆到pBI121載體
將pRByckG載體經(jīng)HindlII/Smal酶切，電泳、回收包含PrbcS-yckG的片 段。將pBI121載體先用Sacl酶切，KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)平滑(方法 見(jiàn)表1.3)，再用HindIII酶切，回收12, lkb片段，將此片段在T4DNA連接酶 的作用下與rbcS-yckG片段按摩爾比1: 3的比例連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ， 用與步驟②相同的方法做菌落PCR,得到3個(gè)陽(yáng)性克隆，搖菌，堿裂解法提取質(zhì) 粒，用HindlII+Sphl雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果切出了 2.4kb的片段，證明 PrbcS-yckG已經(jīng)成功地插入到pBI121載體中，將此載體命名為pBIRYG。(雙酶 切、電泳、DNA片段回收方法同上) 表1.3 DNA片段末端的平滑
DNA片段 6n 1
10 Blunting Buffer 1 P 1
KOD Polymerase 114 1ddH20 2 u 1
Total 10 ill
實(shí)施例2 :同化甲醛基因植物表達(dá)載體pCMTPYF的構(gòu)建 2.1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TP)核苷酸序列的擴(kuò)增與克隆
根據(jù)GenBank中的登錄的大豆鐵蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物P3， P4(引物序列見(jiàn) 表2. 1. 1)，P3的5，端加上BamHI酶切位點(diǎn)，P4的5'端加有PstI酶切位點(diǎn)。 通過(guò)PCR的方法(PCR反應(yīng)體系同表1. 2, PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表2. 1. 2)擴(kuò)增到葉綠 體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TP) 165bp的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)296的瓊脂糖凝膠電泳，將其用 Gel Extraction kit (Takara， 以下同)回收，用BamHI/Pstl雙酶切后克隆 到pBlueskript SK+載體的BamHI/Pstl位點(diǎn)，得pTP。
表2. 1. 1 PCR引物P3， P4序列
P3: 5' -AGTGGATCCATGGCTCTTgCTCCATCC-3，
P4: 5， -CTACTGCAGTGAGGCACAAACCCTAAG-3，
表2. 1.2 PCR擴(kuò)增條件 94 。C 5min
94。C30s ，
55°C30s >30 cycles
72 。C20s
72°C10min
2.2 6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因(yckF)的擴(kuò)增與克隆
根據(jù)GenBank中的登錄的6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因(以下簡(jiǎn)稱(chēng)yckF) 序列設(shè)計(jì)引物P5， P6 (引物序列見(jiàn)表2. 2) ， P5， P6的5'端都加有Pstl識(shí)別序 列，通過(guò)PCR的方法(PCR的反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件參考表1. 2,表1. 3)擴(kuò)增到 575bp的6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因，將其克隆到pTP的Pstl位點(diǎn)，得 pTPyckF。
表2.2 PCR引物P5，P6序列
P5: 5' -G丁GCTGCAGATGAAAACGACTGAATAC-3，
P6: 5' -CTACTGCAGCTATTCAAGGTTTGCGTG-3'2.3 CaMV35S啟動(dòng)子的克隆
將pHS用HindlII/BamHI酶酶切出837bp的CaMV35S啟動(dòng)子序列，并將其 克隆到pCAMBIA1300的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得pC35。
2.4 TP-yckF片段與CaMV35S啟動(dòng)子的組裝
將pTPyckF用BamHI/EcoRI酶切，切出TP-yckF片段，將其克隆到pC35的 相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得pC35TPykF。 BamHI/EcoRI酶切切下740bp左右的條帶，說(shuō)明 TP-yckF已經(jīng)成功插入。
2. 5 polyA終止子的克隆與組裝
將pHS載體用EcoRI酶切，切出polyA終止子片段,將其克隆到pC35TPykF, 得pCMTPYF。
實(shí)施例3:同化甲醛基因植物表達(dá)載體pCMGF的構(gòu)建
3. 1 PrbcS-yckG-nos表達(dá)盒的酶切、回收與平滑
將pBIRYG用HindlII/EcoRI酶切，切下2.8kb左右的PrbcS-yckG-nos條 帶，將其用Gel Extraction kit回收，并用KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)進(jìn)
行末端平滑。
3.2 pCAMTPF的酶切、回收與平滑
將pCAMTPF用Kpnl酶切后，將其用用Gel Extraction kit回收，KOD DNA Polymerase (T0Y0B0)進(jìn)行末端平滑，去磷酸化(方法見(jiàn)表3.1)，與平滑好的 rbcS-yckG-nos片段進(jìn)行連接，得pCMGF。
表3. 1堿性磷酸酶去磷酸化方法
在微量離心管中配置下列反應(yīng)液，全量定容至50 P 1
DNA片段 10ul 10 x Buffer 5ul 堿性磷酸酶 1 P 1
dH20 34 ul
Total 50 ul
5(TC反應(yīng)30分鐘，苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)抽提2次，氯仿/異戊 醇(24: 1)抽提1次，添加5u 1的3M Na0AC，添加125u 1 (2. 5倍量)冷乙醇，在-20 。C下保冷40分鐘，離心分離收集沉淀，用200y 1的70%冷乙醇洗 凈后，減壓干燥，用15u 1的滅菌水溶解沉淀。
權(quán)利要求
1.一種同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其組成包括在植物細(xì)胞中葉片特異表達(dá)型的啟動(dòng)子、組成型表達(dá)的啟動(dòng)子、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶、終止子和篩選標(biāo)記基因，其特征是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因重組到植物細(xì)胞表達(dá)的載體上，該載體的轉(zhuǎn)基因植物葉綠體含有3-己酮糖-6-磷酸合酶、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其特征是所述的 基因重組方式是將3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的表達(dá)盒與6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶 的表達(dá)盒串聯(lián)，使3-己酮糖-6-磷酸合酶基因與6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因在植 物葉綠體特異表達(dá)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其特征是所 述3-己酮糖-6-磷酸合酶基因表達(dá)產(chǎn)物為3-己酮糖-6-磷酸合酶，3-己酮糖-6-磷 酸合酶基因的5，端組裝葉綠體特異表達(dá)型啟動(dòng)子PrbcS，它能使3-己酮糖-6-磷 酸合酶基因在植物葉綠體細(xì)胞特異表達(dá)，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因的3，端組裝 了 nos 終止子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其特征是所 述6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)產(chǎn)物為6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶，6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因的5，端組裝CaMV35S啟動(dòng)子和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽核苷酸序列， 它們能使6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因在植物葉綠體特異表達(dá)，6-磷酸-3-己酮糖 異構(gòu)酶基因的3，端組裝了 polyA終止子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其特征是所 述的篩選基因是將所述載體的質(zhì)粒組裝潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hptll)基因， 作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行篩選。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同化甲醛基因植物表達(dá)載體，其特征是所 述的同化甲醛基因，3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因可 以來(lái)自專(zhuān)性甲基營(yíng)養(yǎng)菌，也可以來(lái)自兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌及其他細(xì)菌。
全文摘要
同化甲醛基因植物表達(dá)載體。本發(fā)明涉及一種同化甲醛基因植物表達(dá)載體。利用植物凈化甲醛成本低、效果持久、操作方便，但能夠凈化甲醛的植物種類(lèi)不多，天然植物凈化甲醛的能力也非常有限。本發(fā)明其組成包括在植物細(xì)胞中葉片特異表達(dá)型的啟動(dòng)子、組成型表達(dá)的啟動(dòng)子、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶、終止子和篩選標(biāo)記基因，將細(xì)菌代謝甲醛的關(guān)鍵酶基因3-己酮糖-6-磷酸合酶基因、6-磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶基因重組到植物細(xì)胞表達(dá)的載體上。該載體的轉(zhuǎn)基因植物葉綠體將含有這兩個(gè)酶，它們可以同化甲醛進(jìn)入到植物光合作用的卡爾文循環(huán)，使甲醛轉(zhuǎn)化為植物生長(zhǎng)的養(yǎng)料。本品用于制造凈化甲醛污染的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101314779SQ20071007228
公開(kāi)日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2007年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者亮 司, 爽 張, 毛文艷, 郭長(zhǎng)虹 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)