專(zhuān)利名稱：：快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于含雙歧桿菌制品中活的雙歧桿菌的快速定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)最主要的生理性細(xì)菌之一，從1989年法國(guó)巴斯德研究院Tissier博士發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌至今的100多年來(lái)，人們從雙歧桿菌的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)、分類(lèi)學(xué)和遺傳學(xué)、微生態(tài)學(xué)、生理功能和應(yīng)用等諸多方面對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究。雙歧桿菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性專(zhuān)性厭氧菌，存在于人和動(dòng)物的消化道中，為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)維持機(jī)體健康具有重要意義，它對(duì)人機(jī)體具有獨(dú)特的益生作用，綜合目前文獻(xiàn)的報(bào)道，雙歧桿菌具有維持腸道菌群平衡，剌激機(jī)體的免疫機(jī)能，防止消化道疾病，促進(jìn)消化和吸收，緩解乳糖不耐癥，降低血清膽固醇，抗癌抗氧化等益生作用。因而，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了研究和開(kāi)發(fā)雙歧桿菌產(chǎn)品的熱潮，雙歧桿菌被廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等方面。由于雙歧桿菌制品是一種微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，其活菌的數(shù)量決定或影響著產(chǎn)品品質(zhì)，只有當(dāng)雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)到106Cfu/mL以上，才能發(fā)揮正常的生理功能。并且雙歧制品的菌株必須來(lái)源于人，動(dòng)物源菌株及其他來(lái)源菌株用于雙歧制品生產(chǎn)不能在人體中定植，因而達(dá)不到保健功效。與此同時(shí)，雙歧桿菌的檢測(cè)技術(shù)也得到了很大的發(fā)展。目前，雙歧桿菌的檢測(cè)技術(shù)主要可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是以傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)；另一類(lèi)是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的各種檢測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)依賴于選擇性培養(yǎng)基，利用抗生素對(duì)各種菌的抑制作用不同，在培養(yǎng)基中添加不同種類(lèi)、不同濃度的抗生素，從而達(dá)到選擇性培養(yǎng)雙歧桿菌的目的。但是目前的選擇性培養(yǎng)基不能真正完全特異性選擇雙歧桿菌，各種抗生素都可能對(duì)雙歧桿菌會(huì)有不同程度的抑制作用，尤其是采用多種抑制劑時(shí)，極易造成檢測(cè)結(jié)果的誤差。此外，在計(jì)數(shù)操作過(guò)程中環(huán)境中的氧氣會(huì)導(dǎo)致部分雙歧桿菌死亡，也會(huì)影響菌數(shù)的估計(jì)。在所有以PCR為基礎(chǔ)的改進(jìn)檢測(cè)方法和以信號(hào)或探針?lè)糯鬄榛A(chǔ)的檢測(cè)新方法中，分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是目前最為理想的辦法。這種技術(shù)在同一密閉試管中，實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增與靶核苷酸探針雜交檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，這樣就可以對(duì)PCR產(chǎn)物的數(shù)量和特異性進(jìn)行快速動(dòng)態(tài)的評(píng)估。"實(shí)時(shí)"指的是每個(gè)PCR循環(huán)之后都對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。目前主要有4種方法可用于DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，分別為T(mén)叫Man探針?lè)?、分子信?biāo)法、雜交探針?lè)ê蚐YBRGreenl熒光染料法，這些方法有著相近的靈敏度。T叫Man技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)定量檢測(cè)糞便樣品中的雙歧桿菌，基于SYBRGreenI的實(shí)時(shí)PCR方法也被用于雙歧桿菌種或?qū)俚臋z測(cè)，但目前還沒(méi)有應(yīng)用分子信標(biāo)法來(lái)檢測(cè)雙歧桿菌的報(bào)道。由于探針涉及雜交過(guò)程，要比單純的DNA結(jié)合染料有更高的特異性，同時(shí)有報(bào)道顯示分子信標(biāo)的特異性高于線性探針。溴化乙錠疊氮化物(Ethidiumbromidemonoazide，EMA)是一種熒光核酸染料，可以與死菌體的DNA結(jié)合形成共價(jià)化合物，進(jìn)而能抑制死菌體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Nogvaetal.,2003)。如果將EMA、分子信標(biāo)探針、實(shí)時(shí)PCR等材料和技術(shù)應(yīng)用于雙歧桿菌的檢測(cè)，可以快速檢測(cè)出活的雙歧桿菌的數(shù)量，增加檢測(cè)的靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過(guò)在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了一條熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)探針，將EMA與分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR的方法進(jìn)行結(jié)合，不但可以很好的區(qū)分死菌活菌，并且可以進(jìn)行定量檢測(cè)。上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，取樣后，將樣品io倍稀釋后，進(jìn)行EMA處理，然后提取樣品的DNA,進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過(guò)程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18%的檸檬酸鈉和1MNaOH，lOOOOrpm離心lOmin，收集菌體細(xì)胞，用無(wú)菌超純水洗滌后，懸浮于無(wú)菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2X的Tritox-100液中，100'C水浴處理10min后，立即置于冰水中冷卻，所得上清液直接用于分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數(shù)為1，所述的檸檬酸鈉的重量份數(shù)為0.15，所述的NaOH的重量份數(shù)為0.1，所述的無(wú)菌超純水的重量份數(shù)為0.1，所述的菌懸液的重量份數(shù)為0.01,所述的Tritox-lOO液的重量份數(shù)為0.1。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的取樣無(wú)菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)做成1:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，其特征是取混合均勻的10倍稀釋含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMA貯液，充分混勻，避光反應(yīng)5min，采用650W的鹵素?zé)粽丈?min，樣品距光源20cm，操作在冰上進(jìn)行，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數(shù)為1，所述的EMA貯液的重量份數(shù)為0.0015。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的方法是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了一條熒光標(biāo)記的探針，即在已設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)構(gòu)建分子信標(biāo)探針，當(dāng)探針保持完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，淬滅熒光基團(tuán)抑制了報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)而不發(fā)光，檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同比增長(zhǎng)，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，引物/探針濃度比為0.8pM/0.4jiM,熒光信號(hào)采集的退火溫度為40。C，M^+濃度為4.0mM，循環(huán)參數(shù)為94。Cx3min—94°Cx30sec—40。Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長(zhǎng)度為19bp,序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的20~38bp號(hào)位置；Bif-R為反向引物，長(zhǎng)度為20bp,序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的655674bp號(hào)位置。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM,6-羥基勞光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL,4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發(fā)射峰值在491nm處，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)序列為5誦FAM國(guó)CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG畫(huà)3畫(huà)DABCYL。上述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以不同菌數(shù)的陽(yáng)性模板對(duì)數(shù)(LogCO)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)Ct為縱坐標(biāo)繪制雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍在2Xl()S2Xl(^CFU/ml之間時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R值大于0.97，所建立分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=-3.568X+42.322。這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果1.EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)方法，將溴化乙錠疊氮化物(EMA)、分子信標(biāo)探針、實(shí)時(shí)PCR等材料和技術(shù)應(yīng)用于雙歧桿菌的檢測(cè)，可以快速、定量檢測(cè)出活雙歧桿菌的數(shù)量，增加檢測(cè)的靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間。EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)含雙歧桿菌制品中活雙歧桿菌的最低檢出限為2xlO"CFU/mL(g);檢測(cè)時(shí)間為4h;非雙歧桿菌屬微生物對(duì)本方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。此方法可用于含雙歧桿菌制品中雙歧桿菌的快速定量檢測(cè)。2.本發(fā)明所建立的EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法重復(fù)性好，不同批次和同批次的批內(nèi)、批間的重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于5X，；特異性強(qiáng)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)明顯的S型，非雙歧桿菌屬微生物對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響；靈敏度高，對(duì)乳制品中活雙歧桿菌的最低檢出限為2xlO"CFU/mL(g);線性范圍寬，起始模板數(shù)在2xl08CFU/ml-2xl04CFU/ml之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于97%。；檢測(cè)時(shí)間為4h，與平板菌落計(jì)數(shù)方法相比顯著縮短檢測(cè)時(shí)間。3.本發(fā)明所建立的EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)平板菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)方法相比較，兩種檢測(cè)方法獲得的結(jié)果差異不顯著(p>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便和快速的特點(diǎn)，可用于對(duì)雙歧桿菌活菌數(shù)的定量檢測(cè)。4.EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，整個(gè)過(guò)程采用完全閉管檢測(cè)，因此擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能性很低，在同一儀器中可以定性、定量、突變及多重測(cè)定，定量范圍比傳統(tǒng)PCR方法高出23個(gè)數(shù)量級(jí)。5.由于省去了傳統(tǒng)的電泳、照相等操作步驟，避免了放射性物質(zhì)或凝膠電泳染色時(shí)溴化乙啶等污染和危害，因此安全可靠，而且所需時(shí)間更短；檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高出10100倍。6.由于EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是在普通PCR基礎(chǔ)上增加了一條熒光探針，由專(zhuān)門(mén)的儀器在擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，大大提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)熒光探針又起到了DNA雜交探針的作用，相當(dāng)于通過(guò)PCR和DNA雜交兩者反應(yīng)驗(yàn)證檢測(cè)的特異性。而且，整個(gè)操作過(guò)程只需在加樣時(shí)開(kāi)蓋一次，其后的過(guò)程完全是閉管操作，并且不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、染色劑染色、在紫外光下觀察等PCR后操作，大大減少了污染的機(jī)會(huì)，同時(shí)也避免了染色劑對(duì)人體的毒害作用。7.EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法不需要繁瑣的培養(yǎng)富集，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，儀器自動(dòng)給出結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間短，只需4h(包括樣品前處理時(shí)間)。EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法可檢測(cè)活菌數(shù)。分子信標(biāo)的構(gòu)建及其性能檢測(cè)1.1分子信標(biāo)的構(gòu)建在己設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)，經(jīng)多序列分析軟件ClustalW及DNAman對(duì)已知的34種雙歧桿菌16SrRNA/16SrDNA進(jìn)行多重比對(duì)分析后，利用探針設(shè)計(jì)軟件BeaconDesigner2.0，選取高度保守區(qū)161180bp片段作為設(shè)計(jì)分子信標(biāo)環(huán)部結(jié)構(gòu)的模板，軟件分析證實(shí)此片段不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。構(gòu)建出分子信標(biāo)環(huán)部寡核苷酸序列，長(zhǎng)度為20bp;通過(guò)軟件BeaconDesigner2.0程序給出的莖部序列并結(jié)合引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0，參考莖部設(shè)計(jì)要求(Marras,2002)，最終確定出分子信標(biāo)莖部序列。探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM(6-羥基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL(4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發(fā)射峰值在491nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。分子信標(biāo)序列為5-FAM誦CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG畫(huà)3畫(huà)DABCYL1.2分子信標(biāo)與其目標(biāo)DNA的響應(yīng)特性通過(guò)F-4500熒光分光光度計(jì)的測(cè)定，結(jié)果表明當(dāng)分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的終濃度比值為1:20時(shí)，分子信標(biāo)的熒光強(qiáng)度增加最為明顯(見(jiàn)圖3-3和圖3-4),信噪比(S/N)和淬滅效率(Eff)最高(見(jiàn)表3-4)。同時(shí)對(duì)分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)也進(jìn)行了研究(見(jiàn)表3-4)，結(jié)果表明在濃度比值為1:20時(shí)，分子信標(biāo)和目標(biāo)DNA的雜交最快，5min之內(nèi)即可完成。但從表3-4中可以看出隨著分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA終濃度比的增加，信噪比和淬滅效率雖均有所增加，但增加幅度卻并不明顯，說(shuō)明濃度對(duì)分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交效率影響不大，但對(duì)雜交速度卻有較大的影響。表l-l分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的響應(yīng)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.3分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的熱變性條件分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的熱變性情況見(jiàn)圖1-3。單獨(dú)存在的分子信標(biāo)在低溫時(shí)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在溫度低于35°C的情況下，熒光強(qiáng)度維持在較低的水平(本底水平)，表明分子信標(biāo)的發(fā)卡處于閉合狀態(tài)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；在3545'C區(qū)間，隨著溫度的變化熒光強(qiáng)度變化很小，表明分子信標(biāo)的發(fā)卡開(kāi)始打開(kāi)，但主要還是以穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)溫度超過(guò)45-C后，隨著溫度的逐漸升高，熒光強(qiáng)度急劇增加，表明分子信標(biāo)的發(fā)卡迅速打開(kāi)；當(dāng)溫度升至7(TC以后，隨溫度的升高，熒光強(qiáng)度變化不大，表明所有的分子信標(biāo)的發(fā)卡已全部打開(kāi)?？梢?jiàn)，本研究所構(gòu)建的分子信標(biāo)的發(fā)卡既可以閉合也可以打開(kāi)，符合分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR過(guò)程對(duì)分子信標(biāo)的要求。當(dāng)分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交后，可以看出在40'C以下時(shí)，其熒光值明顯高于分子信標(biāo)單獨(dú)存在時(shí)的熒光值，這主要是由于分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA結(jié)合后，使得分子信標(biāo)的莖部打開(kāi)，5'端的熒光基團(tuán)與3'端的淬滅基團(tuán)分開(kāi)而產(chǎn)生熒光，熒光值維持在較高的水平；但隨著溫度的升高，分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的雜交體所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)逐漸開(kāi)始變性，解鏈；當(dāng)溫度升高到在70'C時(shí)，所有的分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA完全分離，其熒光值與分子信標(biāo)單獨(dú)存在時(shí)的體系無(wú)明顯差異。因此，本研究所構(gòu)建的分子信標(biāo)可以與目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，可以用于雙歧桿菌的定性檢測(cè)。依據(jù)分子信標(biāo)的熱變性條件，可以看出，在45'C時(shí)，分子信標(biāo)自身解鏈趨勢(shì)開(kāi)始上升，所以分子信標(biāo)的退火溫度不得超過(guò)45。C。因此應(yīng)在45'C以下設(shè)置不同的退火溫度，采集熒光信號(hào)，比較擴(kuò)增曲線，最終確定最優(yōu)的循環(huán)參數(shù)。分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化2.1循環(huán)參數(shù)的確定在循環(huán)參數(shù)6的條件下，熒光擴(kuò)增曲線具有較典型的"S"型形態(tài)和特異性擴(kuò)增，并且穩(wěn)定性、重復(fù)性好。擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2-l，圖2-2。在其它5個(gè)循環(huán)參數(shù)下，其擴(kuò)增的穩(wěn)定性、重復(fù)性均較差，見(jiàn)圖2-3。最終確定循環(huán)參數(shù)為94°Cx3min^94。Cx30s—40°Cx35s—59°Cx3Qte—72°Cxlmin40cycles此外，從圖2-2中可以看出分子信標(biāo)的加入對(duì)PCR擴(kuò)增并無(wú)影響。但從圖2-3可以看出循環(huán)參數(shù)對(duì)分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線有直接影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在4(TC、4rC、42-C時(shí)采集熒光信號(hào)，所得擴(kuò)增曲線趨勢(shì)差別不大，但在40'C時(shí)曲線形態(tài)最好，且在這一溫度下分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA雜交體約有50%變性，由此可知40'C為分子信標(biāo)的最佳Tm值。同時(shí)變性時(shí)間的縮短(從lmhi到30sec)不僅有利于特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，而且穩(wěn)定性更好。2.2引物/探針濃度的優(yōu)化通過(guò)分析熒光擴(kuò)增曲線的形態(tài)及比較Ct值的大小，確定最佳引物/探針濃度比。首先觀察曲線形態(tài)(見(jiàn)圖2-4),可見(jiàn)引物/探針濃度比為0.4pM/0.4jiM、0.4nM/0.8pM、0.8nM/0.4jiM時(shí)曲線的上升趨勢(shì)要比其它5個(gè)濃度比的趨勢(shì)明顯。再分析比較各組的Ct值大小(見(jiàn)表2-l)。表2-l不同引物/探針Ct值的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注數(shù)據(jù)角標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)經(jīng)過(guò)SAS軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0.8nM/0.4jiM組的Ct值明顯小于其它組的值(P<0.05)，再結(jié)合曲線形態(tài)的分析及最大RFU值，最終選擇最優(yōu)引物/探針濃度比為0.8nM/0.4nM。3.Mg2+濃度的優(yōu)化在確定的最佳循環(huán)參數(shù)及引物/探針濃度比條件下，優(yōu)化M^+的最適濃度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了9個(gè)Mg2+濃度，即2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM。結(jié)果顯示M^+對(duì)熒光強(qiáng)度有一定的影響，濃度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)減弱熒光強(qiáng)度；M^+濃度為2.0mM、2.5mM、4.0mM時(shí)，所得到的擴(kuò)增曲線形狀好且曲線的上升趨勢(shì)要比其它6個(gè)濃度趨勢(shì)明顯(見(jiàn)圖3-l)，熒光強(qiáng)度相對(duì)較高，但最大RFU值無(wú)明顯變化。從擴(kuò)增曲線上看，M^+濃度的改變只影響曲線的RFU值，但幾乎不影響Ct值，可見(jiàn)Ct值只與模板的濃度有關(guān)。由于M^+濃度是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，而且M^+濃度過(guò)高會(huì)增加引物二聚體的形成，因此確定2.5mM為M^+最佳濃度。至此確定出分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR最佳反應(yīng)體系，見(jiàn)表3-2。表3-2分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR最優(yōu)反應(yīng)組分Tab.3隱2Theoptimumcomponentofreal-timePCRandmolecularbeacon<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>dNTPMixture(2.5mM)Bif-F(IOjiM)Bif-R(IOjiM)Bif-MB(5jiM)DNAtempalteTaqDNAPolymerase(2.5U/jil)ROXReferenceDye44440.5200pM0.4jiM1.25U標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)參數(shù)94。Cx3min~^94。Cx30s—40。Cx35s—59。Cx39s—72。Cxlmin40cyclesEMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)乳制品中活雙歧桿菌條件的確定4.1含雙歧桿菌制品稀釋度的確定本實(shí)驗(yàn)將含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶分別設(shè)置了3個(gè)不同的濃度，即原始濃度、IO倍稀釋和IOO倍稀釋。將不同稀釋度的樣品分別采用EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR方法和平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果分別見(jiàn)表4-1和表4-2。_表4-1不同稀釋度奶粉中雙歧桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注同行數(shù)據(jù)角標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)表4-2不同稀釋度酸奶中雙歧桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(Ct士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表4-1和4-2可以看出含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶在原始濃度條件下進(jìn)行檢測(cè)，EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR方法所得結(jié)果與平板菌落計(jì)數(shù)方法所得結(jié)果差異顯著(p0.05)。這可能是由于樣品原始濃度比較大，樣品濁度較大，從而導(dǎo)致ema在鹵素光源照射后仍有殘留，在隨后的dna提取過(guò)程中，殘留的ema與dna結(jié)合，進(jìn)而抑制dna的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。含有雙歧桿菌的奶粉在10倍稀釋度下進(jìn)行檢測(cè)，兩種計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果差異不顯著(pX).05)。含有雙歧桿菌的奶粉和酸奶在100倍稀釋度下進(jìn)行檢測(cè)，兩種計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果差異顯著(p0.05)。這是由于稀釋樣品的濃度較低，導(dǎo)致在DNA提取過(guò)程中所獲得的dna量小于實(shí)際量，即濃度低時(shí)會(huì)影響dna的提取量。根據(jù)以上對(duì)這兩種乳制品的計(jì)數(shù)結(jié)果可知，產(chǎn)品稀釋度會(huì)影響ema-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，所得的檢測(cè)結(jié)果與平板菌落計(jì)數(shù)相比均有顯著差異，只有當(dāng)乳制品稀釋度適宜時(shí)，采用ema-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)pcr方法才能真實(shí)地反映出其中的活菌數(shù)量。在本實(shí)驗(yàn)條件下，所選用的兩種乳制品的最適宜稀釋度為10倍。4.2.EMA最小用量的確定4.2.1EMA最小用量的確定將制備含雙歧桿菌死菌體奶粉溶液和酸奶，對(duì)所制備的酸奶進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)俜謩e采用0.5jig/mL，l.Ojig/mL,1.5ng/mL,2.0ng/mL，2.5ng/mL和5.0fig/mL六種濃度的EMA對(duì)上述兩種制備物進(jìn)行處理，然后進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖4-l和圖4-2。結(jié)果顯示六種濃度的EMA對(duì)兩種乳制品制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增抑制程度不同。當(dāng)EMA的濃度小于1.5ng/mL時(shí)，雙歧桿菌死菌體DNA還可以進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增曲線與對(duì)照(control)相比，無(wú)明顯S型；當(dāng)EMA的濃度大于1.5fig/mL(含1.5照/mL)時(shí)，雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增基本受到抑制。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定能夠抑制乳制品中雙歧桿菌死菌體DNA時(shí)PCR擴(kuò)增的最小EMA用量為1.5ng/mL。4.2.2EMA對(duì)乳制品中活雙歧桿菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響將制備含雙歧桿菌活菌奶粉溶液和酸奶，對(duì)所制備的酸奶進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)俜謩e采用0.5fig/mL,1.0ng/mL，1.5fig/mL，2.0fig/mL，2.5pg/mL和5.0fig/mL六種濃度的EMA對(duì)上述兩種制備物進(jìn)行處理，然后進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖4-3和圖4-4。結(jié)果顯示由于EMA濃度不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線形態(tài)也不同。由圖4-3和圖4-4可知，當(dāng)EMA達(dá)到設(shè)置的最大量5.0fig/mL時(shí)，雙歧桿菌活菌DNA還可以進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增曲線與對(duì)照(control)相比，曲線RFU值很小，無(wú)明顯S型，但是曲線仍然有Ct值；當(dāng)EMA的濃度為1.5照/mL時(shí)，EMA對(duì)雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增基本沒(méi)有影響。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，所確定的EMA最小用量(1.5jig/inL)對(duì)雙歧桿菌活菌DNA的擴(kuò)增無(wú)影響，因此確定EMA的最小用量為1.5ng/mL。4.3EMA最短曝光時(shí)間的確定4.3.1EMA在650W鹵素光源照射下最短曝光時(shí)間的確定將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉溶液和酸奶，對(duì)所制備的酸奶進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)捎肊MA(終濃度為1.5fig/mL)對(duì)上述兩種制備物進(jìn)行處理，再用650W的鹵素?zé)舴謩e照射30s、lmin、2min、3min和5min，樣品距光源20cm,然后進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖4-5和圖4-6。結(jié)果顯示由于曝光時(shí)間不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線形態(tài)也不同。當(dāng)EMA的曝光時(shí)間小于2min時(shí)，雙歧桿菌死菌體DNA還可以進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增曲線與對(duì)照(control)相比，無(wú)明顯S型；當(dāng)EMA的曝光時(shí)間豳過(guò)2min(含2min)時(shí)，EMA對(duì)雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增基本沒(méi)有影響，所得到Ct值與對(duì)照相比差異不顯著(pX).05)。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定650W鹵素光源EMA最短曝光時(shí)間為2min。4.3.2EMA在500W鹵素光源照射下最短曝光時(shí)間的確定將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉溶液和酸奶，對(duì)所制備的酸奶進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)捎肊MA(終濃度為1.5jig/mL)對(duì)上述兩種制備物進(jìn)行處理，再用500W的鹵素?zé)舴謩e照射5min、10min、15min和20min，樣品距光源14cm,然后進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖4-7和圖4-8。結(jié)果顯示由于曝光時(shí)間的不同，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線形態(tài)不同。當(dāng)EMA的曝光時(shí)間小于15mhi時(shí)，雙歧桿菌死菌體DNA可以進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，但擴(kuò)增曲線與對(duì)照(control)相比，無(wú)明顯S型；當(dāng)EMA的曝光時(shí)間超過(guò)15min(含15min)時(shí)，EMA對(duì)雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增基本沒(méi)有影響，所得到Ct值與對(duì)照相比差異不顯著(pX).05)。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定500W鹵素光源EMA最短曝光時(shí)間為15min。4.4不同強(qiáng)度曝光光源的比較將制備含雙歧桿菌活菌的奶粉和酸奶，對(duì)所制備的酸奶進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)捎肊MA(終濃度為1.5jig/mL)對(duì)上述兩種制備物進(jìn)行處理，再用650W的鹵素?zé)粽丈?min，樣品距光源20cm;同時(shí)用500W的鹵素?zé)魟e照射15min,樣品距光源14cm，然后進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖4-9和圖4-10。結(jié)果顯示采用不同強(qiáng)度曝光光源進(jìn)行照射后，兩種乳制品制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線形態(tài)基本一致，熒光強(qiáng)度相對(duì)較高，最大RFU值均無(wú)明顯變化，所得到的Ct值結(jié)果差異不顯著(pX).05)。但是由于本實(shí)驗(yàn)是在冰上操作，照射時(shí)間越長(zhǎng)，需要換冰的頻率越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，影響EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)時(shí)間。所以本實(shí)驗(yàn)選定的曝光光源為650W鹵素光源，照射時(shí)間為2min。圖1是分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1-1分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA不同濃度比雜交熒光光譜.圖1-2分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA濃度比為1:20時(shí)雜交熒光光譜。圖1-3分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA的熱變性。圖2-l循環(huán)參數(shù)6時(shí)分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線。圖2-2循環(huán)參數(shù)6時(shí)分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物凝膠電泳。圖2-3不同循環(huán)參數(shù)下分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線的比較。圖2-4不同引物/探針濃度下分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線的比較。圖3-1不同M^+濃度下分子信標(biāo)-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線的比較。圖4-1不同濃度EMA對(duì)奶粉制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-2不同濃度EMA對(duì)酸奶制備物中雙歧桿菌死菌體DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-3不同濃度EMA對(duì)奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-4不同濃度EMA對(duì)酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-5不同曝光時(shí)間對(duì)奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-6不同曝光時(shí)間對(duì)酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-7不同曝光時(shí)間對(duì)奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-8不同曝光時(shí)間對(duì)酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-9不同強(qiáng)度曝光光源對(duì)奶粉制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。圖4-10不同強(qiáng)度曝光光源對(duì)酸奶制備物中雙歧桿菌活菌DNA的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的影響。本發(fā)明的具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:一種快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，取樣后，將樣品10倍稀釋進(jìn)行EMA處理，然后提取樣品的DNA，分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過(guò)程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18%的檸檬酸鈉和1MNaOH，lOOOOrpm離心10min，收集菌體細(xì)胞，用無(wú)菌超純水洗滌后，懸浮于無(wú)菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2%的Tritox-100液中，100。C加熱處理lOmin后，立即置于冰水中快速冷卻，所得上清液直接用于分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數(shù)為l,所述的檸檬酸鈉的重量份數(shù)為0.15，所述的NaOH的重量份數(shù)為0.1，所述的無(wú)菌超純水的重量份數(shù)為0.1，所述的菌懸液的重量份數(shù)為0.01，所述的Tritox-100液的重量份數(shù)為0.1。實(shí)施例2:實(shí)施例1中所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的取樣，無(wú)菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)做成l:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。實(shí)施例3:實(shí)施例1或2中所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，取混合均勻的含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMAlt液，充分混勻，避光反應(yīng)5min，采用650W的鹵素?zé)粽丈?min，樣品距光源20cm,操作在冰上進(jìn)行，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數(shù)為1，所述的EMA貯液的重量份數(shù)為0.0015。實(shí)施例4:上述實(shí)施例中所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的方法是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了一條熒光標(biāo)記的探針，即在已設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)構(gòu)建分子信標(biāo)探針，當(dāng)探針保持完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，淬滅熒光基團(tuán)抑制了報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)而不發(fā)光，檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同比增長(zhǎng)，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，引物/探針濃度比為0.8jiM/0.4nM，熒光信號(hào)采集的退火溫度為4(TC，Mg"濃度為4.0mM,循環(huán)參數(shù)為94°Cx3min—94°Cx30sec—40°Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin40cycles實(shí)施例5:上述實(shí)施例快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長(zhǎng)度為19bp，序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的20~38bp號(hào)位置；Bif-R為反向引物，長(zhǎng)度為20bp，序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的655~674bp號(hào)位置。快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM(6-羥基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL(4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發(fā)射峰值在491nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)序列為5-FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3畫(huà)DABCYL實(shí)施例6:上述實(shí)施例快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)的原理是，在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了一條熒光標(biāo)記的探針，探針的5'端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)即reporter,R;靠近3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)即quencher,Q;兩者之間約7~10nm時(shí)就可發(fā)生FRET。當(dāng)探針保持完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，淬滅熒光基團(tuán)抑制了報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)而不發(fā)光，檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)。當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，熒光信號(hào)增強(qiáng)。熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同比增長(zhǎng)，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，溴化乙錠疊氮化物是一種熒光核酸染料，可以與死菌體的DNA結(jié)合形成共價(jià)化合物，進(jìn)而能抑制死菌體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)EMA加入到含有死活菌的樣品中時(shí)，活菌的細(xì)胞膜是完整的，加入EMA后，EMA只存在菌的表面，不能滲透到活菌的細(xì)胞中，通過(guò)鹵素光源照射，曝光一段時(shí)間后，活菌表面游離的EMA分解或形成羥胺化合物，由于死菌體的細(xì)胞膜破壞，EMA進(jìn)入到細(xì)菌的細(xì)胞中，在DNA提取的過(guò)程中，活菌表面游離的EMA曝光分解或形成羥胺化合物，對(duì)活菌的DNA沒(méi)有綁定，而存在于死菌體細(xì)胞中的EMA，在提取過(guò)程中，與死菌體的DNA結(jié)合形成共價(jià)化合物，活菌的DNA可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是由于EMA與死菌體的DNA結(jié)合形成共價(jià)化合物，因此死菌體的DNA不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將EMA與分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR的方法進(jìn)行結(jié)合不但可以很好的區(qū)分死菌活，并且可以進(jìn)行定量檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立-以不同菌數(shù)的陽(yáng)性模板對(duì)數(shù)(LogCO)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)繪制雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明當(dāng)濃度過(guò)大(超過(guò)2X108CFU/ml)或過(guò)低(低于2X104CFU/ml)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性不好；濃度范圍在2Xl()S2Xl(^CFU/ml之間時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R值大于0.97。因此，依據(jù)此模板范圍建立了EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表l及圖l。表1EMA-分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>所檢乳制品樣品中雙歧桿菌的含量計(jì)算按圖1建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所檢含雙歧桿菌制品的樣品中雙歧桿菌的結(jié)果計(jì)算方法如下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.568X+42.322，y-代表分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果的Ct值。x—代表待測(cè)含雙歧桿菌制品的樣品中的雙歧桿菌菌數(shù)Log值。所檢乳制品樣品中雙歧桿菌的含量[LogCO/mL=Log值+2由于將含雙歧桿菌制品的樣品稀釋10倍，在分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR中DNA模板為5UL，總體積為50UL，又進(jìn)行一次10稀釋。相當(dāng)于含雙歧桿菌制品的樣品稀釋了100。所以在計(jì)算所檢含雙歧桿菌制品的樣品中雙歧桿菌的含量為L(zhǎng)og值+2。權(quán)利要求1.一種快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，其特征是取樣后，將樣品10倍稀釋后，進(jìn)行EMA處理，然后提取樣品的DNA，進(jìn)行分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙歧桿菌的含量，所述的DNA提取過(guò)程是EMA處理后的含雙歧桿菌制品，加入18％的檸檬酸鈉和1MNaOH，10000rpm離心10min，收集菌體細(xì)胞，用無(wú)菌超純水洗滌后，懸浮于無(wú)菌超純水中，取菌懸液，加入到濃度為2％的Tritox-100液中，100℃水浴處理10min后，立即置于冰水中冷卻，所得上清液直接用于分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，所述的含雙歧桿菌制品的重量份數(shù)為1，所述的檸檬酸鈉的重量份數(shù)為0.15，所述的NaOH的重量份數(shù)為0.1，所述的無(wú)菌超純水的重量份數(shù)為0.1，所述的菌懸液的重量份數(shù)為0.01，所述的Tritox-100液的重量份數(shù)為0.1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，其特征是所述的取樣無(wú)菌操作將充分混勻的含雙歧桿菌制品的樣品放入含有PBS緩沖液的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)做成l:IO的均勻稀釋液，室溫靜置水合30min。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的EMA處理樣品，其特征是取混合均勻的10倍稀釋含雙歧桿菌制品的樣品稀釋液，加入濃度為lmg/mLEMA貯液，充分混勻，避光反應(yīng)5min，采用650W的卣素?zé)粽丈?min，樣品距光源20cm，操作在冰上進(jìn)行，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，所述的雙歧桿菌制品的樣品稀釋液的重量份數(shù)為1，所述的EMA貯液的重量份數(shù)為0.0015。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的方法是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上加入了一條熒光標(biāo)記的探針，即在已設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)構(gòu)建分子信標(biāo)探針，當(dāng)探針保持完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅熒光基團(tuán)吸收，淬滅熒光基團(tuán)抑制了報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)而不發(fā)光，檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)到報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同比增長(zhǎng)，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，引物/探針濃度比為.0.8pM/0.4nM，熒光信號(hào)采集的退火溫度為40'C,M^+濃度為4.0mM,循環(huán)參數(shù)為.94°Cx3min—94。Cx30sec—40°Cx35sec—59。Cx35sec—72°Cxlmin。.40cycles5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，其特征是:所述的引物包括正向引物和反向引物，其中Bif-F為正向引物，長(zhǎng)度為19bp,序列為5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的2038bp號(hào)位置；Bif-R為反向引物，長(zhǎng)度為20bp，序列為5'-CACCGTTACACCGGGAATTC-3'，結(jié)合位點(diǎn)落在長(zhǎng)雙歧桿菌16SrDNA序列的655~674bp號(hào)位置。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速定量檢測(cè)活的雙'歧桿菌的方法，其特征是所述的分子信標(biāo)探針5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，6-羥基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL,4-4'-(惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸，熒光發(fā)射峰值在491nm處，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)序列為5國(guó)FAM-CCAGGCATCCGGCATTACCACCCGTCCTGG-3'-DABCYL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法，其特征是所述的分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以不同菌數(shù)的陽(yáng)性模板對(duì)數(shù)(LogCO)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)Ct為縱坐標(biāo)繪制雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍在2X1082X104CFU/ml之間時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R值大于0.97，所建立分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=-3.568X+42.322。全文摘要快速定量檢測(cè)活的雙歧桿菌的方法。本發(fā)明涉及一種用于含雙歧桿菌制品中活的雙歧桿菌的快速定量檢測(cè)方法。雙歧桿菌的檢測(cè)技術(shù)分為傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的各種檢測(cè)。本方法取樣將樣品10倍稀釋后，進(jìn)行EMA處理，提取樣品的DNA，分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算雙歧桿菌的含量，DNA提取過(guò)程是EMA處理后的樣品，加18％的檸檬酸鈉和1MNaOH，10000rpm離心10min，收集菌體細(xì)胞，超純水洗滌后，取菌懸液，加入濃度為2％的Tritox-100液中，100℃水浴處理10min后，立即冷卻，上清液用于分子信標(biāo)-實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。本發(fā)明用于含雙歧桿菌的制品中活的雙歧桿菌的定量檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101319250SQ20071007232公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日發(fā)明者孟祥晨,睿龐,超王申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)