專利名稱：一種哈工大堿桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物。
背景技術：
極端環(huán)境微生物具有獨特的基因類型，可以在極端環(huán)境中生存、繁衍。嗜 鹽微生物是能在高鹽環(huán)境下生長、繁衍的一類極端微生物，因其特殊的生理機 制和代謝產物(如視紫紅質、相似性溶質、酶、多聚物、脂質體等)，具有 巨大的研究價值和實際應用價值。嗜鹽微生物在能源、食品、生物電子、制鹽、 醫(yī)藥、培育轉基因植物以及環(huán)境整治等方面正顯示出巨大的開發(fā)潛力。
高含鹽有機廢水屬于極難處理的廢水之一。目前，對此類廢水一般采用電 解法、膜分離法、焚燒法和深井灌注法等技術處理，但由于這些方法存在成本 高、二次污染等缺點，所以難以在實際中應用。傳統(tǒng)生物法中采用的微生物在 處理低鹽度廢水時具有很大的優(yōu)勢，但當鹽濃度超過3.5%，則會造成生物代 謝的中度抑制和毒害，使微生物失去其降解能力，從而大幅影響高鹽有機廢水 的處理效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜鹽菌菌株，并應用于高鹽有機廢水的生物強化 處理，解決目前高含鹽有機廢水生物處理中污染物去除效果差，物理化學方法 成本高、易造成二次污染的缺陷。
本發(fā)明哈工大堿桿菌(^/^//to"7/w JSA1經(jīng)鑒定屬于堿桿菌屬 "/A^/Z^"'//""新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀區(qū)中關村北一條13號，保藏日期為2007 年4月6日，保藏號為CGMCC No.l994;哈工大堿桿菌JSA1為革蘭氏陽性 好氧桿菌，中度嗜鹽，在NaCl質量濃度為0~25%、 pH值為4.5 9.5的環(huán)境中 生長；哈工大堿桿菌JSA1菌體長短多變，寬為0.4^im 0.6pm，長為 0.7^im 3.8pm，無鞭毛；哈工大堿桿菌JSA1在固體培養(yǎng)基上生長菌落為白色， 表面光滑，邊緣整齊。不能以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗
糖、木糖醇、木糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、麥芽糖、甘露醇或山梨醇作為唯一碳
源；不能以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、賴氨酸、谷氨酸、組氨酸、 色氨酸、甘氨酸或脲作為唯一氮源。
本發(fā)明哈工大堿桿菌"/^^^"7/ws W) JSA1接觸酶陽性、氧化酶陰性、
淀粉水解陰性、明膠液化陰性，硝酸鹽還原反應陰性、酪素水解試驗為陰性、 酪氨酸水解試驗為陰性。哈工大堿桿菌(^&//6wz7/WlS JSA1的主要脂肪
酸種類[異構脂肪酸(iso)，反異構脂肪酸(anteiso)，不飽和脂肪酸(w7c alcohol)]
和含量為C15:0iso 34.06%、 C15:0anteiso 29.00%、 C16:0iso 3.44%、 C16:1 w7calcohol 4.04%、
C17:0is。4.10%、 C17:0anteis。 12.49%;占總脂肪酸含量的87.13%。
本發(fā)明哈工大堿桿菌(J汰a/Aa"7/w/nY) JSA1通過16SrDNA基因序列比 對分析與其最相近的種屬是堿桿菌屬嗜鹽堿桿菌"/&//tec///w sp.YIM012)， 相似性為99%，結合細菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結果及脂肪酸分 析結果，確定哈工大堿桿菌JSA1為堿桿菌屬的一個新菌種，命名為哈工大堿 桿菌/z" sp.nov.)，哈工大堿桿菌JSA1 (屋a/Zte贏s to JSA1) 為哈工大堿桿菌模式菌株。
本發(fā)明哈工大堿桿菌"汰a/z'^"7/w具有處理強化高鹽有機廢水的功 能，強化高鹽有機廢水中污染物去除率高于90%，費用低，不造成二次污染。 本發(fā)明哈工大堿桿菌(^&//6m///m為生物處理強化高鹽有機廢水及極端 微生物的研究奠定了物質基礎。
J/b/A""7/ws/nY屬于堿桿菌屬"儀a船a"7/w),保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀區(qū)中關村北 一條13號，保藏日期為2007年4月6日，保藏號為CGMCCNo.1994。


圖1是哈工大堿桿菌JSA1的菌落照片，圖2是哈工大堿桿菌JSA1的原 子力顯微鏡觀察圖，圖3是哈工大堿桿菌JSA1的原子力顯微鏡觀察圖，圖4 是哈工大堿桿菌JSA1的原子力顯微鏡觀察圖，圖5是哈工大堿桿菌JSA1的 原子力顯微鏡觀察圖，圖6是哈工大堿桿菌JSA1菌株的脂肪酸含量分析色譜 圖，圖7是哈工大堿桿菌JSA1和相近菌株的16S rDNA基因序列構建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹圖。 -具體實施方式
.
具體實施方式
一本實施方式哈工大堿桿菌"汰"/Aa"7/ws/hY) JSA1經(jīng)鑒 定屬于堿桿菌屬(^汰"http://^"7/^)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏日期為2007年4月6日，保藏號為CGMCCNo.l994;哈工 大堿桿菌JSAl為革蘭氏陽性好氧桿菌，中度嗜鹽，在NaCl質量濃度為0 25M、 pH值為4.5~9.5的環(huán)境中生長；哈工大堿桿菌JSA1菌體長短多變，寬為 0.4tim 0.6^im，長為0.7Mm 3.8|im，無鞭毛(如圖2 圖5所示)；哈工大堿桿 菌JSA1在固體培養(yǎng)基上生長，菌落為白色，表面光滑，邊緣整齊(如圖l所 示)。
本實施方式哈工大堿桿菌(^/^//Z^a'//^JSA1為適中溫菌，不運動， 在以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗糖、木糖醇、木糖、乙酸 鈉、擰檬酸鈉、麥芽糖、甘露醇或山梨醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上均不生長；在 以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、賴氨酸、谷氨酸、組氨酸、色氨酸、 甘氨酸或脲為唯一氮源的培養(yǎng)基上均不生長。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對哈工大 堿桿菌(^/^//^"7/ws /nY) JSA1進行生理生化鑒定哈工大堿桿菌 "/^/^c///^ /hY) JSA1接觸酶陽性、氧化酶陰性、淀粉水解陰性、明膠液 化陰性，硝酸鹽還原反應陰性、酪素水解試驗為陰性、酪氨酸水解試驗為陰性。
采用美國MIDI全細胞脂肪酸分析系統(tǒng)鑒定哈工大堿桿菌"/^幼acz7/^ to) JSA1，哈工大堿桿菌"汰a/Z^^7/wJSA1的主要脂肪酸種類和含量 為C15:0is。 34.06%、 C15:0anteiso 29.00%、 C16:0iso 3.44%、 C16:1
w7c alcohol
4濕、C17:0
is。 4.10%、 C17:q她is。 12.49%;占總脂肪酸含量的87.13%，哈工大堿桿菌 "/fe^'^c///^JSAl菌株的脂肪酸含量分析色譜圖，如圖6所示。
本實施方式哈工大堿桿菌(v4/^a//Z^c///"1sJSAl最適宜在NaCl質量濃 度為3%~15%、 pH值為6.5 9.0的環(huán)境中生長。
具體實施方式
二本實施方式哈工大堿桿菌(^&//&c///m/hY) JSAl是從 山東省威海市金泓化工有限公司高鹽廢水中篩選得到的。篩選按以下步驟進 行取山東省威海市金泓化工有限公司高鹽廢水10mL置于lOOmL液體培養(yǎng) 基中，在33 35。C、 120r/min的環(huán)境中搖床富集培養(yǎng)3 5天；然后接菌于NaCl
質量濃度為鹽度為15%的斜面培養(yǎng)基上，在33 37'C條件下培養(yǎng)2 4天；之后
挑選單菌落反復多次劃線純化培養(yǎng)，即可得到嗜鹽菌菌株。
本實施方式中每升液體培養(yǎng)基由5g酸水解酪素、12g酵母膏、6g胰蛋白 胨、3g檸檬酸三鈉、3gKCl、 18gMgS04'7H20、 0.001 gFeS04、 150gNaCl和 余量的去離子水組成，并調節(jié)pH值7.0 8.0。本實施方式中每升固體斜面培養(yǎng) 基由5g酸水解酪素、12g酵母膏、6g胰蛋白胨、3g檸檬酸三鈉、3gKCl、 18g MgS04*7H20、 0.001 gFeS04、 150gNaCl、 18~20g瓊脂和余量的海水組成，并 調節(jié)pH值7.0-8.0。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對篩選得 到的嗜鹽菌菌株進行生理生化鑒定，并采用美國MIDI全細胞脂肪酸分析系統(tǒng) 鑒定篩選得到的嗜鹽菌菌株。
通過16S rDNA的擴增、測序及同源性比較鑒定篩選得到的嗜鹽菌菌株 用細菌基因DNA小量快速提取試劑盒(購自于北京博大泰克生物基因技術有 限公司)提取篩選得到的嗜鹽菌菌株的總DNA，并用通用引物進行PCR擴增， 16S rDNA序列的上游引物Eu-bac27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCACG-3'、 下游引物1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(引物購自于大連寶生物 工程有限公司)。PCR反應體系(20pL)為篩選得到的嗜鹽菌菌株DNA40ng、 rragDNA聚合酶終濃度為0.3U，4種dNTP各O.3mmol/L，上游引物Eu-bac27F 0.1pmol/L、下游引物1492R0.1nmol/L和余量的去離子水。PCR反應程序為 94。C預熱5min， 94"C變性30s， 58'C退火45s， 72。C延伸90s，循環(huán)30次，最 后72"C延伸10min。 PCR擴增產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，再用膠回收試劑盒 (寶泰克)切膠回收，然后與pGEM-T載體(購自于美國Promega公司)連 接，再轉化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞(購自于北京天為時代科技有限公 司)中。藍白斑篩選在加入氨芐青霉素Amp (5pg/mL)和X-gal的LB固體 培養(yǎng)基上進行篩選。檢測白色質?；蛐蛄刑崛“咨|粒基因，再用pGEM-T 載體引物T7和SP6擴增，并測序；本實施方式篩選得到的哈工大堿桿菌 U/^3/^ad//^ M) JSA1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.l所示。測出的基 因序列用BioEdit v 5.06進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)與本實施方式篩選得到的哈工 大堿桿菌JSA1最相近的種屬是堿桿菌屬嗜鹽堿桿菌U/^幼a"7to sp.YIM
012， DQ359731),相似性為99%，結合細菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化 鑒定結果及脂肪酸分析結果，發(fā)現(xiàn)兩者間存在明顯區(qū)別，與本屬其它菌種的區(qū) 別更為明顯，確定哈工大堿桿菌JSA1屬于一個新菌種，命名為哈工大堿桿菌 "/^//6""7/^/^)。根據(jù)哈工大堿桿菌JSA1和相近菌株的16SrDNA基因序 列，采用MEGA3.1軟件鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹如 圖7所示。
本實施方式中質?；蛱崛∈褂蒙虾ＨA舜生物有限公司出品的DNA小量 細菌提取試劑盒，基因測序工作由生物工程公司完成。
用本實施方式哈工大堿桿菌JSA1處理強化高鹽有機廢水。按50mL/L將 哈工大堿桿菌JSA1接種于序列間歇反應器(Sequencing Batch Reactor),再向 SBR反應器中注入含鹽量為10%， CODcr為2570mg/L的高鹽模擬有機廢水； 處理72h，高鹽模擬有機廢水的CODo去除率為79%，處理108h，高鹽模擬 有機廢水的CODcr去除率為92%。實驗證明哈工大堿桿菌JSA1具有處理強化 高鹽有機廢水的功能，可以明顯去除強化高鹽有機廢水中的污染物，而且無須 添加其它化學制劑，大幅降低了高鹽有機廢水的處理成本，避免了二次污染。
COD (化學耗氧量)，采用重鉻酸鉀(K2Cr207)作為氧化劑測定出的化學耗 氧量表示為COD&。 序列表
<110>哈爾濱工業(yè)大學
<120> —種哈工大堿桿菌
<160> 3
<210> 1 <211> 1484 -212>DNA
<213>哈工大堿桿菌禾中(J/to/沾fld〃w/z" sp.nov.) <220>
<223>哈工大堿桿菌JSA1 16S rDNA基因序列
<400> 1
gagacgctggcggcgtgcctagtcgagcgcgggaagcgagctgaagccct 60
tcggggtggatgctcgtggaacgagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctacc 120
tgtgagacggggataactccggga肪ccggggctaataccggatascgcatcgaaccgca 180
tggttcgatgatcaaagatggcttcttgctatcactc3cagatgggcccgcggcgcatta 240
gttagttggtggggt幼cggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtga 300
tcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatc 360
atccgcaatggacgcaagtctgacggtgcaacgccgcgtgagcgatgaaggtcttcggat 420
cgtaaagctctgttgtg鄉(xiāng)gaagaacaagtgccgttcgaatagggcggcaccttgacgg 480
tacctcaccagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt鄉(xiāng)gggc 540
aagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggttccttaagtctgatgt 600
g助3ggCC3Cagctcaactgtggagggccattggaaactggggaacttgaggacagaaga 660
gg卿gCgg3attccacgtgtagcggtgaa8tgcgtagatatgtggaggaacaccagtgg 720
cgaaggcggctctctggtctgtaactgscgctgaggcgcgsaagcatgggtagcgaacag 780
gattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgagtgctaggtgttagggggtccaa 840
cccttagtgctgcagttaacgcaataagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctg 900
gaattgacgggggcctgcacaagcggtggagcatgtggUtaattcgacg 960
caacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttcggacagcccaagagattgggtcttc1020
ccttcggggaccg犯tgac3ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgtt1080
gggttaagtcccgt犯cgagcgcaacccctgatcttagttgccagcattcagttgggcac1140
tctaggatgactgccggtgaC€l￡l€LCCgg￡tggaaggcggggatcatcatgc1200
cccttatgacctgggctacacacgtgctac幼tggatggteicgiaagggaagccei肌ccgc1260
gaggtcgagctaatcccataEiagccattc1:cagttcggattg，ggctgcaactcgcctg1320
catgaagccggaatcgctsgtaatcgcggstcagaatgccgcggtg幼tacgttcccagg1380
ccttgtacacaccgcccgtcacaccacgag3gttggCMCacccgaagtcggtgggg他1440
ccttcacggagccagccgccg,gtggggccaatgattggggg 1484
<210>2 <211>21 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>通用16SrDNA序列上游引物Eu-bac27F <400> 2
agagtttgat cctggctcac g 21
<210>3 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223>通用16SrDNA序列下游引物1492R <400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
權利要求
1、一種哈工大堿桿菌，其特征在于哈工大堿桿菌(Alkalibacillus hit)JSA1經(jīng)鑒定屬于堿桿菌屬(Alkalibacillus)新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年4月6日，保藏號為CGMCCNo.1994；哈工大堿桿菌JSA1為革蘭氏陽性好氧桿菌，中度嗜鹽，在NaCl質量濃度為0～25％、pH值為4.5～9.5的環(huán)境中生長；哈工大堿桿菌JSA1菌體長短多變，寬為0.4μm～0.6μm，長為0.7μm～3.8μm，無鞭毛；哈工大堿桿菌JSA1在固體培養(yǎng)基上生長菌落為白色，表面光滑，邊緣整齊。不能以D-葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、乳糖、肌醇、蔗糖、木糖醇、木糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、麥芽糖、甘露醇或山梨醇作為唯一碳源；不能以精氨酸、胱氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、賴氨酸、谷氨酸、組氨酸、色氨酸、甘氨酸或脲作為唯一氮源。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種哈工大堿桿菌，其特征在于哈工大堿桿菌 "/^/^ac/〃^ /hY)JSA1的主要脂肪酸種類和含量為C15:0 is。 34.06%、C15:o咖&。29.00%、 C16:0iso3.44%、 C16:lw7calcohol4,04%、 C17:0iso4.10%、 C17:0anteiso 12.49%; 占總脂肪酸含量的87.13%。
3、 根據(jù)權利要求1所述的一種哈工大堿桿菌，其特征在于哈工大堿桿菌 "/^/^"7/w M) JSA1接觸酶陽性、氧化酶陰性、淀粉水解陰性、明膠液化陰性，硝酸鹽還原反應陰性、酪素水解試驗為陰性、酪氨酸水解試驗為陰性。
全文摘要
一種哈工大堿桿菌，它涉及一種微生物。它提供一種嗜鹽性菌株，并可應用于高鹽有機廢水的生物強化處理，解決目前高含鹽有機廢水生物處理污染物去除效果差的缺陷。哈工大堿桿菌經(jīng)鑒定屬于堿桿菌屬新種，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年4月6日，保藏號為CGMCC No.1994；哈工大堿桿菌為革蘭氏陽性好氧桿菌，中度嗜鹽，在NaCl質量濃度為0～25％、pH值為4.5～9.5的環(huán)境中生長；哈工大堿桿菌菌體長短多變，寬為0.4μm～0.6μm，長為0.7μm～3.8μm，無鞭毛。本發(fā)明哈工大堿桿菌具有處理強化高鹽有機廢水的功能，強化高鹽有機廢水中污染物去除率高于90％，不造成二次污染。
文檔編號C12N1/20GK101173234SQ20071007273
公開日2008年5月7日 申請日期2007年9月3日 優(yōu)先權日2007年9月3日
發(fā)明者李維國, 蘇俊峰, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱工業(yè)大學