專利名稱：：一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術：
：近年來，豬的疫病日益呈現(xiàn)復雜化和嚴重化趨勢，而出于豬繁殖育種的需要，種豬流通貿易量則大大增加，諸多因素的共同作用，使得豬繁殖障礙疾病呈愈演愈烈之勢，每年由此造成的損失不可估量，已對世界養(yǎng)豬業(yè)構成了嚴重威脅。豬的繁殖障礙性疾病主要包括病毒、細菌、寄生蟲和一些微形體，其中病毒性疫病危害最大，這類疫病包括豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬細小病毒(PPV)感染、偽狂犬病(PR)、豬瘟(CSF)、豬圓環(huán)病毒(PCV—2)感染、日本乙型腦炎(JE)等。這些病原在國內均廣泛存在，可通過多種途徑使豬感染，臨床特點都可表現(xiàn)為妊娠母豬發(fā)生流產、早產、死胎及木乃伊胎等繁殖障礙，病毒由1頭公豬最終傳染給許多母豬及其所產仔豬，造成疫病的流行和擴散。而且，近年來這些疫病在臨床表現(xiàn)及流行病學方面出現(xiàn)了新的變化，隱性感染病例顯著上升，持續(xù)性感染在豬群中較為普遍，更增加了控制工作的難度。豬細小病毒(Porcineparvovirus,簡稱PPV)為引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，可引起胚胎或胎兒的感染和死亡，導致母豬發(fā)生流產、死胎、胎兒木乃伊化及新生仔豬的死亡。PPV基因組結構簡單，為單鏈線狀DNA，大小約為5.0kb，兩端均含有發(fā)夾結構。近年來，PPV感染呈擴大趨勢，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。由于缺乏有效的疫苗，因而及時診斷疾病、及時處理疫情就變得十分重要，這就需要有一種既準確又快速的實驗室檢測方法來確定病原.這也是臨床診斷與流行病學研究的一個必不可少的環(huán)節(jié)。目前常見的病毒分離和血清學診斷方法，操作繁瑣、耗時、敏感性低、特異性差，不適宜作為病毒的早期診斷。隨著分子生物學技術的發(fā)展，普通PCR方法已經廣泛應用于臨床診斷，但該技術需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染，同時有一定的非特異性擴增。而熒光PCR技術則是在普通PCR技術的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。除了具有普通PCR的優(yōu)點外，它還具有以下優(yōu)點(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應，在線式實時監(jiān)測熒光，無須PCR產物的后處理，避免污染，保證了結果的可靠性。(3)數據分析選在核酸擴增的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠。(4)可實現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動化及聯(lián)網管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何病毒的核酸。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明采用以下技術方案用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對。探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應用PCR技術實現(xiàn)耙核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在PCR擴增過程中，Taq酶的5'端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。附圖利用引物對PPVpf/PPVpr和探針PPVpb檢測豬細小病毒陽性樣品的熒光PCR擴增圖。具體實施例方式1.引物和探針設計通過分別對所有已知的豬細小病毒基因組序列進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段，設計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下上游弓I物PPVpf:CAACTACGCAGCAACTCCAATAC下游引物PPVpr:GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT探針PPVpb:CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA2.反應體系的建立和優(yōu)化豬細小病毒實時熒光PCR反應體系的建立和優(yōu)化靶區(qū)域模板以如下方法獲得利用滅活的豬細小病毒毒株作為待檢樣品，用酚氯仿的提取方法提取病毒基因組DNA，分裝后儲存于_2(TC備用。2.1引物濃度的優(yōu)化在反應體系中，將豬細小病毒的引物濃度分別從0.1ymol/L至0.8pmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2umol/L。2.2鎂離子濃度的優(yōu)化在反應體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5隨ol/L遞增，經過多次重復實驗選定2.5mmol/L為試劑盒反應體系中的鎂離子濃度。2.3TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優(yōu)化實驗結果，選定2U作為試劑盒反應體系中Taq酶的用量。2.4dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應體系中dNTPs的使用量。2.5探針濃度的優(yōu)化在反應體系中，將豬細小病毒的探針濃度分別從0.05iimol/L至0.2pmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.lumol/L。利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應體系為4Gnl體系，所需各組分及相應濃度見表l。表1優(yōu)化后的PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注a.在熒光PCR反應體積^F同時，各試劑應按比例調整。b.使用的儀器不同，應將反應參數作適當調整。3.儀器檢測通道的選擇在進行熒光PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。4.PCR條件選擇如下95°C2分鐘，l個循環(huán)；95°C5秒，6G°C40秒，4G個循環(huán)。5.檢測步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測模板,可采用酚一氯仿法提取各種來源樣品中豬細小病毒的基因組DNA;(3)反應體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；C、確定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。6.實施例選取引物對PPVpf/PPVpr和探針PPVpb，將待檢的豬細小病毒培養(yǎng)液用酚一氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)剪取50-100mg新鮮組織樣本，加入裝有500ulHanks液的研缽中緩慢研成勻漿，取勻漿液作為樣本進行下一步處理。如果樣本為血液，取血清作為樣本進行下一步處理。(2)加入DM裂解液70Gul,充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。(3)加入等體積的酚一氯仿(V/V-1:1)溶液，充分混勻后離心，13Q00轉/分鐘離心5分鐘。(4)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000轉/分鐘離心5分鐘。(5)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13GQG轉/分鐘離心5分鐘。(6)棄上清后用70%乙醇沖洗，13000轉/分鐘離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。(7)在干燥后的離心管中加入50ulDNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。在40ul熒光PCR反應體系中，加入以上提取的豬細小病毒基因組DNA2ul，根據前述PCR反應條件進行熒光PCR檢測。經檢測，若待檢培養(yǎng)液中含有豬細小病毒則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可達到1000個拷貝/ml;若待檢培養(yǎng)液中不含有豬細小病毒則無擴增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度和特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達1000個拷貝/ml，說明其具有良好的靈敏度。(2)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有豬細小病毒的檢測樣本均無擴增信號，說明其具有良好的特異性。(3)由于本發(fā)明分別對所有已知的豬細小病毒基因組序列進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段進行引物和探針的設計，避免了假陰性結果的產生。(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術作為檢測方法，整個反應均在封閉的反應管內進行，避免了其他核酸檢測方法如PCR—電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結果；由于對PCR產物進行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。SEQUENCELISTING<110>深圳太太基因工程有限公司<120〉一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列<130〉2<160〉3<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>23<212>DM<213>人工序列<400>1caactacgcagcaactccaatac23<210〉2<211〉23<212>■<213>人工序列<400〉2ggttggtgaaag"ggtgttgtt<210>3<211>24<212>DM<213>人工序列<400〉3ctcgctccacggctccaaggctaa權利要求1.一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對。2.—種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。全文摘要一種用于檢測豬細小病毒核苷酸片段的引物和探針序列。引物序列包括由上游引物PPVpf序列為CAACTACGCAGCAACTCCAATAC和下游引物PPVpr序列為GGTTGGTGAAAGTTGGTGTTGTT組成的引物對。探針PPVpb序列為CTCGCTCCACGGCTCCAAGGCTAA。文檔編號C12Q1/68GK101294224SQ20071007419公開日2008年10月29日申請日期2007年5月8日優(yōu)先權日2007年5月8日發(fā)明者斌吳,張經緯,葉李,李振榮,肖性龍,胡傳偉,赟賈申請人:深圳太太基因工程有限公司;中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局