專利名稱：：一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒屬，是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其導(dǎo)致的豬繁殖與呼吸綜合征又稱藍(lán)耳病或神秘病，以引起豬呼吸道感染、仔豬死亡、母豬繁殖障礙等臨床表現(xiàn)為特征。目前，該病廣泛流行于歐美及亞洲國(guó)家，已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸疫局將該病列為C類傳染病。由于缺乏有效的疫苗，因而及時(shí)診斷疾病、及時(shí)處理疫情就變得十分重要，這就需要有一種既準(zhǔn)確又快速的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法來確定病原，但PRRSV與其它許多引起豬繁殖障礙的疾病(如細(xì)小病毒病、偽狂犬病、豬瘟、日本乙型腦炎、布病、鉤端螺旋體病等)存在著許多類似的臨床癥狀，因此極大地增加了本病診斷的難度。豬繁殖與呼吸綜合征病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷，國(guó)內(nèi)外都已建立了各種方法，主要有病毒分離鑒定,免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)，間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)和血清中和試驗(yàn)(SN)等,但這些方法都不同程度地存在著敏感性低、特異性差、操作繁瑣、耗時(shí)等不足，因?yàn)檫@些方法都是建立在病毒分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不適宜作為豬繁殖與呼吸綜合征的早期診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，普通PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，但該技術(shù)需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，極易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，同時(shí)有一定的非特異性擴(kuò)增。而熒光PCR技術(shù)則是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀來檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性，并且由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了人工判斷的主觀性，又可進(jìn)一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，無須PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對(duì)性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)模化、自動(dòng)化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測(cè)任何病毒的核酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列。基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列包括由上游引物PRRSVpf序列為CCTGTGTCCGACCCAGTCG和下游引物PRRSVpr序列為TGGCAAGACCGAGACCGAC組成的引物對(duì)。探針PRRSVpb序列為TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG。本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物和一個(gè)特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，而在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5'端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)就可以由儀器檢測(cè)到，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。附圖利用引物對(duì)PRRSVpf/PRRSVpr和探針PRRSVpb檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性樣品的熒光PCR擴(kuò)增圖。具體實(shí)施例方式1.引物和探針設(shè)計(jì)通過分別對(duì)所有已知的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下上游引物PRRSVpf:CCTGTGTCCGACCCAGTCG下游引物PRRSVpr:TGGCAAGACCGAGACCGAC探針PRRSVpb:TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化利用滅活的豬繁殖與呼吸綜合征病毒作為待檢樣品，用Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲(chǔ)存于一2(TC備用。2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物濃度分別從0.1wmol/L至1.6umol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4ymol/L。2.2鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從1ramol/L至10mmol/L以1mmol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。2.3反轉(zhuǎn)錄酶(AMVRnaseXL)用量的優(yōu)化經(jīng)過使用不同濃度反轉(zhuǎn)錄酶的試驗(yàn)結(jié)果比較，選定5U作為試劑盒反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄酶的用量。2.4TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定5U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。2.5dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)估后選1mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。2.6探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒的探針濃度分別從0.lumol/L至0.5umol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，通過試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.2timol/L。利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系為25u1體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表l。表1豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)巾的各組分情況<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注a.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。b.根據(jù)檢測(cè)樣本來源不同，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整模板加量。3.儀器檢測(cè)通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)對(duì)所用儀器中反應(yīng)管熒光信號(hào)的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測(cè)通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。4.PCR條件選擇如下50°C3G分鐘，95°C2分鐘，1個(gè)循環(huán)；95°C5秒，60°C40秒，40個(gè)循環(huán)。5.檢測(cè)步驟5.l選取引物和探針；5.2制備待測(cè)模板，可采用TRIZOL核酸提取法提取各種來源樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核酸；5.3反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；C、確定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；5.4選擇儀器的檢測(cè)通道；5.5上機(jī)檢測(cè)。6.實(shí)施例6.1待測(cè)模板的制備用Trizol核酸抽提試劑的提取方法6.1.1剪取50-100mg新鮮組織樣本，加入裝有500ulHanks液的研缽中緩慢研成勻漿，取勻漿液作為樣本進(jìn)行下一步處理。如果樣本為血液，取血清作為樣本進(jìn)行下一步處理。6.1.2往1.5ml滅菌無RNA酶污染的離心管中加入加入600ulRNA提取液，然后加入經(jīng)步驟l處理的待測(cè)樣本2GQul，吸打混勻；再加入2GGul氯仿，顛倒5-10次混勻。12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。6.1.3吸取上層液相(切勿吸入下層液體)轉(zhuǎn)移新的1.5ml滅菌離心管中，加入200ul異丙醇(一2(TC預(yù)冷)，顛倒混勻。12，00G轉(zhuǎn)/分鐘離心1G分鐘。6.1.4輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入60Qul75%乙醇，顛倒洗漆。12，000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。6.1.54,000轉(zhuǎn)/分鐘離心1G秒將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥1-5分鐘。6.1.6加入15ulDEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上RNA，保存-2(TC備用。6.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件根據(jù)表1加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)熒光收集條件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下6.2.150°C30分鐘進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，95°C3分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶；6.2.295°C15秒變性，55°C30秒退火，72°C1分鐘延伸，如此重復(fù)5個(gè)循環(huán)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；6.2.395°CIO秒變性，60°C40秒退火、延伸，如此重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。6.3豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)檢測(cè)，若待檢培養(yǎng)液中含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1000個(gè)拷貝/ml;若待檢培養(yǎng)液中不含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒則無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的靈敏度和特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1000個(gè)拷貝/ml，說明其具有良好的靈敏度。(2)本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)于不含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)樣本均無擴(kuò)增信號(hào)，說明其具有良好的特異性。(3)由于本發(fā)明分別對(duì)所有己知的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其他核酸檢測(cè)方法如PCR—電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性結(jié)果；由于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了監(jiān)測(cè)時(shí)間，節(jié)約了人力物力。SEQUENCELISTING<110〉深圳太太基因工程有限公司<120>—種用于.檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列<130>3<160>3<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉19〈212〉腿<213〉人工序列<400>1cctgtgtccgacccagtcg19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400〉2tggcaagaccgagaccgac19<210〉3<211>28<212〉DNA<213>人工序列<400>3tttgagcttctcaaaccttgggaccctg28權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PRRSVpf序列為CCTGTGTCCGACCCAGTCG和下游引物PRRSVpr序列為TGGCAAGACCGAGACCGAC組成的引物對(duì)。2.—種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針PRRSVpb序列為TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG。全文摘要一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核苷酸片段的引物和探針序列。引物序列包括由上游引物PRRSVpf序列為CCTGTGTCCGACCCAGTCG和下游引物PRRSVpr序列為TGGCAAGACCGAGACCGAC組成的引物對(duì)。探針PRRSVpb序列為TTTGAGCTTCTCAAACCTTGGGACCCTG。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101186949SQ20071007419公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年5月8日優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日發(fā)明者斌吳,張經(jīng)緯,葉李,李振榮,肖性龍,胡傳偉,赟賈申請(qǐng)人:深圳太太基因工程有限公司;遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心